, 马大龙
, 姜雪薇, 刘梦洋, 臧淑英哈尔滨师范大学地理科学学院, 哈尔滨 150025
收稿日期: 2019-10-09; 修回日期: 2019-11-09; 录用日期: 2019-11-09
基金项目: 国家自然科学基金（No.41501065）；中国博士后科学基金项目（No.2017M611381）；黑龙江省普通本科高等学校青年创新人才培养计划项目（No.UNPYSCT-2017177）；黑龙江省博士后资助经费项目（No.LBH-Z17100）
作者简介: 陈泓硕(1995-), 男, E-mail:yiyunhuaxia@163.com
通讯作者（责任作者）: 马大龙(1982—), 男, 博士, 副教授, 硕士生导师, 主要从事寒区环境微生物生态适应及功能研究.E-mail：madalong728@163.com
摘要：选取扎龙湿地芦苇沼泽为研究对象，采用磷脂脂肪酸法和微孔板法研究了季节性冻融期土壤微生物群落结构和胞外酶活性的动态变化规律.结果表明，微生物总磷脂脂肪酸（PLFA）含量和细菌PLFA含量均呈先降低后升高趋势，而真菌PLFA含量呈先升高后降低趋势.冻融初期至融冻初期，β-葡萄糖苷酶显著降低了71.84%，β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶表现为先升高后降低趋势，酸性磷酸酶在融冻初期最高、冻融初期最低，过氧化物酶和多酚氧化酶峰值均出现在融冻后期.主成分分析表明，季节性冻融显著改变了土壤微生物群落结构.冗余分析发现，土壤含水率与总PLFA、细菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、放线菌、过氧化物酶和多酚氧化酶呈显著正相关（p < 0.05）；土壤全磷、速效磷、速效氮与真菌和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶呈显著正相关；β-葡萄糖苷酶主要受土壤碳氮比和有机质影响，而土壤微生物与胞外酶活性在不同冻融时期具有显著相关性（p < 0.05）.因此，探究全球变化背景下土壤微生物和胞外酶对季节性冻融过程的响应机制，可为深入解析扎龙湿地土壤质量演变特征及湿地生态系统功能的恢复与保护提供科学依据.
关键词：季节性冻融扎龙湿地微生物群落胞外酶磷脂脂肪酸
Effects of seasonal freeze-thaw on soil microbial community structures and extracellular enzyme activities in Zhalong wetland
CHEN Hongshuo
, MA Dalong, JIANG Xuewei, LIU Mengyang, ZANG ShuyingCollege of Geographical Science, Harbin Normal University, Harbin 150025
Received 9 October 2019; received in revised from 9 November 2019; accepted 9 November 2019
Abstract: The dynamics change regulations of microbial community structure and extracellular enzymes activity of reed swamp in Zhalong wetland were studied by using phospholipid fatty acid and microplate method. The results showed that microbial total phospholipid fatty acid(PLFA) content and bacterial PLFA content represented a trend of decreasing first and then increasing, while fungal PLFA content represented a trend of increasing first and then decreasing. From the early freezing-thawing stage to the early thawing stage, β-glucosidase decreased by 71.84%, and β-N-acetyl-glucosaminidase increased first and then decreased; the acid phosphatase was the highest in the early stage of thawing and the lowest in the early stage of freezing and thawing; the peak values of peroxidase and polyphenol oxidase appeared in the late stage of thawing. Principal component analyses (PCA) showed that seasonal freezing and thawing significantly changed soil microbial community structure. Redundancy analyses (RDA) found that soil moisture content was positively correlated with total PLFA, bacteria, Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria, actinomycetes, peroxidase and polyphenol oxidase (p < 0.05); soil total phosphorus, available phosphorus and available nitrogen were positively correlated with fungi and β-N-acetylglucosaminidase; β-glucosidase was mainly affected by soil carbon to nitrogen ratio and organic matter, but soil microbes were significantly correlated with extracellular enzyme activies in different freeze-thaw periods (p < 0.05). Therefore, exploring the response mechanism of soil microbes and extracellular enzymes to seasonal freezing and thawing processes under the background of global change can provide a scientific basis for further analysis of the soil quality evolution characteristics of Zhalong wetland and the restoration and protection of wetland ecosystem functions.
Keywords: seasonal freeze-thawZhalong wetlandmicrobial communityextracellular enzymesphospholipid fatty acids
1 引言(Introduction)季节性冻融是北半球中高纬度地区普遍存在的自然现象, 可驱动地表的能量和水分平衡, 深刻影响土壤矿化和微生物分解等多个生态过程.已有研究认为, 冬季低温会引起土壤微生物休眠甚至死亡, 致使其活性极低(杨梅学等, 2006).而近年来大量的研究表明, 土壤冻融期间仍然有较高的微生物活性(Sulkava et al., 2003；Withington et al., 2006), 其原因是冻融导致土壤团粒结构破碎、凋落物分解及微生物死亡后释放出大量的有效养分, 为耐寒微生物的生存和繁殖提供了充足的代谢底物(李姗姗等, 2016).全球气候变化会打破中高纬度地区土壤冻融格局(蔡延江等, 2013), 增加土壤温度波动和冻融频率, 改变土壤理化性质、温室气体排放、水热动态及微生物群落结构, 进而影响整个湿地生态系统的稳定性(王娇月等, 2011).因此, 明晰冻融作用对土壤微生物群落结构和酶活性的交互影响是掌握湿地生物地球化学循环和生态系统功能变化趋势的关键, 也是目前湿地生态学的研究热点.
土壤微生物是生态系统中的关键组成部分, 在土壤有机质分解、矿化及营养元素循环等方面发挥着重要作用(Ruan et al., 2004；杨桂生等, 2010).微生物作为评价土壤质量的灵敏生物指标, 其群落结构和多样性可对环境变化和胁迫做出快速响应(Ou et al., 2004).湿地是介于陆地和水生生态系统之间的过渡区域, 具有涵养水源、调节气候和维护生物多样性等多种生态功能, 而微生物参与湿地的物质循环和能量流动过程, 对维持湿地生态系统结构和功能起着决定作用(李森森等, 2018).因此, 了解湿地土壤微生物群落变化特征, 对及时判定湿地生态系统各组分的演变规律和科学评价湿地生境质量具有重要意义.
胞外酶是由植物根系及微生物分泌的具有催化作用的蛋白质, 可参与土壤中几乎所有的生化反应, 也是调控土壤养分元素循环的关键限速步骤(左宜平等, 2018).胞外酶能够将复杂的大分子有机质分解为可被微生物和动植物利用的小分子有机质, 酶活性的高低能直接反映土壤代谢过程的方向和强度(孙锋等, 2014), 常作为衡量湿地土壤养分供给潜力和健康状况的敏感指标(Kotroczó et al., 2014；罗攀等, 2017).目前, 对于全球变化背景下湿地生态系统适应特征和反馈机理的认知不足, 还缺乏土壤微生物对碳、氮、磷等元素循环的影响机制及微生物与土壤胞外酶耦合关系等方面的综合研究.
扎龙湿地位于寒温带半湿润-半干旱季风气候区, 存在明显的季节性冻融过程, 既是松嫩平原生态系统中最重要的组成部分, 也是整个嫩江流域生态环境最脆弱的关键区(佟守正等, 2008；马玲等, 2011).近年来, 气候变化和人为干扰带来的巨大环境压力, 导致扎龙湿地植物群落逆向演替、湿地面积萎缩等现象频发(王兴菊等, 2008).目前, 针对冻融生态效应的研究多集中在高纬度多年冻土区、环北极高山苔原带和北方针叶林带(陈哲等, 2016；张慧敏等, 2017).而季节性冻融过程是如何调控湿地土壤微生物和胞外酶活性的机理仍不清晰, 这很难满足全球气候变化情景下湿地生态系统演变过程的研究需要.基于此, 本研究选取扎龙湿地为研究对象, 运用磷脂脂肪酸法和微孔板法, 厘清季节性冻融期土壤微生物群落结构和胞外酶活性的动态变化规律及关键环境驱动因子, 探讨湿地土壤微生物对冻融效应的响应特征, 以期为准确评估中高纬度湿地生态系统对全球变化的响应及其相互作用机制提供科学依据.
2 材料与方法(Materials and methods)2.1 研究区概况扎龙湿地(46°52′~47°32′N, 123°47′~124°37′E)位于黑龙江省松嫩平原西部的乌裕尔河下游, 面积达21×104 hm2, 是世界最大的芦苇湿地(许林书等, 2003).该区属于寒温带大陆性季风气候, 年平均降水量为420 mm, 年平均气温为3.2 ℃, 10月—翌年4月为负温期, 最冷月平均气温为-19.4 ℃, 最热月平均气温为22.9 ℃, 年日照时数为2700~3000 h, 平均地温为4.9 ℃, 无霜期为128 d(焦德志等, 2015).扎龙湿地是我国北方同纬度地区最具代表性和典型性的内陆湿地生态系统, 在全球变化研究中占有重要地位.
2.2 样品采集与处理将季节性冻融过程划分为5个时期, 冻融初期(10下旬—11月)：表层土壤日最高温大于0 ℃, 日最低温小于0 ℃, 土壤开始自上而下单向冻结；冻融后期(12月—1月中旬)：昼夜平均气温在0 ℃以下, 土壤冻结锋面从土壤表层向深层移动并逐渐延伸至最大冻结层；稳定冻结期(1月中旬—2月)：深层土壤日最高温持续在0 ℃以下, 土壤处于完全冻结状态；融冻初期(3月)：昼夜平均气温在0 ℃上下波动, 土壤开始自上而下与自下而上双向融化；融冻后期(4月下旬)：土壤冻结层即将融通, 表层土壤日最低温大于0 ℃, 但深层土壤仍存在负温现象.
2017年10月—2018年4月在扎龙湿地芦苇沼泽样地内设置3块10 m×10 m的样方, 每个样方间隔50 m.在样方内按照“S”型路线采集0~10 cm土样5份, 除去碎石、植物残体和根系等杂物后用灭菌自封袋封装, 做好标记立即放置在冰盒中带回实验室.将土样充分混匀后平均分为2份, 一份置于-20 ℃冰箱保存, 一周内用于土壤微生物磷脂脂肪酸和酶活性测定；另一份自然风干后过2 mm筛, 用于土壤理化性质测定.
2.3 研究方法2.3.1 土壤理化性质测定土壤pH测定采用电位法；土壤含水率(SWC)测定采用烘干法；土壤有机质(OM)测定采用重铬酸钾容量法；土壤全氮(TN)测定采用半微量凯氏法；土壤速效氮(AN)测定采用康维皿扩散法；土壤全磷(TP)测定采用碳酸钠熔融-钼锑抗比色法；土壤速效磷(AP)测定采用双酸浸提-钼锑抗比色法(王金成等, 2015；王璐璐等, 2018).
2.3.2 土壤微生物磷脂脂肪酸测定采用磷脂脂肪酸法测定扎龙湿地土壤微生物群落(Bossio et al., 1998), 将8 g冻干土样置于离心管中, 加入35 mL提取液(V(氯仿):V(甲醇):V(磷酸)=1:2:0.8), 避光振荡2 h后以2000 r·min-1离心10 min, 取上清液加入24 mL氯仿磷酸缓冲液静置分液, 重复提取1次, 将2次提取液充分混匀收集氯仿层, N2吹干后过氯仿、丙酮和甲醇洗脱, 收集甲醇洗提液.经KOH甲醇溶液皂化和水解, N2吹干后以19:0甲酯为内标物, 运用Agilent 7890B气相色谱仪进行磷脂脂肪酸含量测定.运用美国MIDI公司研发的Sherlock MIS 4.5全自动系统鉴定微生物细胞中磷脂脂肪酸成分, 根据其分子结构划分为不同微生物类群并进行定量分析.将12:0、18:0、a19:0、19:0、20:0、22:0表征为一般性细菌；a13:0、i14:0、a14:0、14:0、i15:0、a15:0、i16:0、16:0、i17:0、a17:0表征为革兰氏阳性菌；16:1ω9c、16:1ω7c、16:1ω5c、17:1ω8c、18:1ω7c、cy19:0ω7c表征为革兰氏阴性菌；18:3ω6c、18:2ω6c、18:1ω9c表征为真菌；10Me16:0、10Me17:0、10Me18:0表征为放线菌(Diedhiou et al., 2008；Cao et al., 2010；Kulmatiski et al., 2011).
2.3.3 土壤胞外酶活性测定采用微孔板法测定β-葡萄糖苷酶(BG)、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)、酸性磷酸酶(ACP)、过氧化物酶(PER)和多酚氧化酶(PPO)活性(Saiya-Cork et al., 2002).将1 g新鲜土壤置于125 mL 50 mmol·L-1(pH=5)的醋酸盐缓冲液中, 用磁力搅拌器搅拌5 min后用移液器吸取土壤悬浮液200 μL移至96微孔板, 每个样品8个重复.将微孔板于20 ℃下恒温培养, 水解酶培养4 h, 氧化酶培养18 h, 分别用4-MUB-β-D-glucopyranoside、4-MUB-N-acetyl-β-D-glucosaminide和4-MUB-phosphate(浓度为200 μmol·L-1)作为测定水解酶活性的标示底物, L-DOPA(浓度为50 mmol·L-1)作为测定氧化酶活性的标示底物, 运用Synergy H4多功能酶标仪测定其荧光度(水解酶的荧光激发光和检测光波长分别为365 nm和450 nm)和吸光度(氧化酶测定460 nm处吸光值).
2.3.4 数据处理分析运用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析(ANOVA), 显著性水平设为α=0.05.运用Bio-Dap程序计算扎龙湿地土壤微生物群落香农-威纳多样性指数(Shannon-Wiener index)、辛普森优势度指数(Simpson index)和均匀度指数(McIntosh index).运用SigmaPlot 10.0软件绘制土壤胞外酶活性动态变化折线图.运用Canoco 4.5软件进行主成分分析(Principal component analysis, PCA)和冗余分析(Redundancy analysis, RDA).
3 结果与分析(Results and analysis)3.1 不同冻融时期土壤理化性质分析由表 1可知, 不同冻融时期扎龙湿地土壤理化性质存在显著差异.土壤pH值变化范围为8.34~8.58, 其中, 稳定冻结期土壤pH显著高于冻融初期、冻融后期和融冻后期(p < 0.05).土壤含水率为18.62%~35.81%, 融冻后期显著高于其他时期(p < 0.05).土壤有机质含量(72.92 g·kg-1)和碳氮比(51.63)均在冻融初期最高, 且显著高于稳定冻结期、融冻初期和融冻后期(p < 0.05).土壤全磷和速效磷含量分别为0.45~0.76 g·kg-1和4.19~6.28 mg·kg-1, 均表现为稳定冻结期显著高于冻融初期、融冻初期和融冻后期(p < 0.05).土壤全氮含量变幅较小, 呈先升高后降低趋势；土壤速效氮含量在稳定冻结期(244.95 mg·kg-1)显著高于其他时期(p < 0.05).
表 1(Table 1)
| 表 1 不同冻融时期土壤理化性质 Table 1 Soil physical and chemical properties under different freeze-thaw periods | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
表 1 不同冻融时期土壤理化性质 Table 1 Soil physical and chemical properties under different freeze-thaw periods
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3.2 不同冻融时期土壤微生物群落结构特征不同冻融时期扎龙湿地土壤样品中共检测出79种磷脂脂肪酸(PLFA), 选择含量大于0.1 nmol·g-1的28种PLFA进行分析, 其中, 一般性细菌(B)6种、革兰氏阳性菌(G+)10种、革兰氏阴性菌(G-)6种、真菌(F)3种、放线菌(A)3种.由图 1可知, 不同冻融时期均以16:0含量最高, 占总PLFA的15.22%~18.86%；12:0、18:0、19:0、18:1ω9c和10Me16:0含量总和占总PLFA的39.01%~42.05%, 说明这6种PLFA是扎龙湿地土壤微生物优势类群.不同冻融时期各PLFA含量存在显著差异, 其中, 12:0、16:0和18:0含量均表现为融冻后期最高, 稳定冻结期最低；19:0和18:1ω9c含量呈先升高后降低趋势, 均在稳定冻结期最高且显著高于冻融初期和融冻后期(p < 0.05)；10Me16:0含量最高值出现在融冻后期, 最低值出现在冻融后期.
图 1(Fig. 1)
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| 图 1 不同冻融时期土壤微生物磷脂脂肪酸类型及含量 Fig. 1The type and content of soil microbial phospholipid fatty acid under different freeze-thaw periods |
如表 2所示, 土壤微生物总PLFA含量为15.90~22.16 nmol·g-1, 在冻融初期、融冻初期、融冻后期显著高于冻融后期和稳定冻结期(p < 0.05).扎龙湿地土壤微生物以细菌为优势类群, 细菌PLFA含量占总PLFA含量的84.79%~86.51%, 在融冻后期最高、稳定冻结期最低.真菌PLFA含量呈先升高后降低趋势, 不同时期间差异不显著(p>0.05).革兰氏阳性菌/革兰氏阴性菌(G+/G-)在冻融初期和融冻初期显著高于冻融后期(p < 0.05)；真菌/细菌(F/B)在稳定冻结期最高且显著高于冻融初期、融冻初期和融冻后期(p < 0.05).
表 2(Table 2)
| 表 2 不同冻融时期土壤微生物各菌群磷脂脂肪酸含量及比率 Table 2 The content and ratio of soil microbial phospholipid fatty acid under different freeze-thaw periods | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
表 2 不同冻融时期土壤微生物各菌群磷脂脂肪酸含量及比率 Table 2 The content and ratio of soil microbial phospholipid fatty acid under different freeze-thaw periods
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3.3 不同冻融时期土壤微生物多样性特征Shannon-Wiener指数用于评估微生物群落的物种丰富度, Simpson指数用于指示微生物群落中某些常见物种的优势度, McIntosh指数则用于反映群落中物种均一度.从表 3中可以看出, Shannon-Wiener指数和McIntosh指数均表现为冻融初期和融冻后期显著高于稳定冻结期和融冻初期(p < 0.05), Simpson指数在稳定冻结期最高, 且显著高于冻融初期、冻融后期和融冻后期(p < 0.05).
表 3(Table 3)
| 表 3 不同冻融时期土壤微生物多样性 Table 3 Soil microbial diversity under different freeze-thaw periods | ||||||||||||||||||||||||||||
表 3 不同冻融时期土壤微生物多样性 Table 3 Soil microbial diversity under different freeze-thaw periods
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3.4 不同冻融时期土壤胞外酶活性特征季节性冻融对扎龙湿地土壤β-葡萄糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、酸性磷酸酶、过氧化物酶和多酚氧化酶活性均产生了不同程度的影响(图 2).冻融初期土壤β-葡萄糖苷酶活性显著高于其他时期(p < 0.05), 整体呈先降低后升高趋势, 从冻融初期至融冻初期酶活性降低71.84%, 融冻初期至融冻后期又升高50.33%.β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性的变化规律为：稳定冻结期>冻融后期>融冻初期>冻融初期>融冻后期, 在冻融初期至稳定冻结期升高36.17%, 在融冻后期较稳定冻结期降低43.63%.酸性磷酸酶活性变化趋势与β-葡萄糖苷酶相反, 呈先升高后降低的趋势, 在融冻初期最高为169.95 nmol·g-1·h-1, 冻融初期最低为120.78 nmol·g-1·h-1.土壤过氧化物酶和多酚氧化酶活性变化基本一致, 季节性冻融开始后酶活性逐渐降低至稳定冻结期的最低值, 与冻融初期相比分别降低了1.04和0.61 μmol·g-1·h-1(p < 0.05), 而稳定冻结期后其活性显著升高直至融冻后期达到最高值, 分别升高了1.27和0.91 μmol·g-1·h-1(p < 0.05).
图 2(Fig. 2)
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| 图 2 不同冻融时期5种土壤胞外酶活性特征 Fig. 2Five soil extracellular enzyme activities characteristics under different freeze-thaw periods |
3.5 土壤微生物PLFA主成分分析对扎龙湿地不同冻融时期土壤微生物PLFA进行主成分分析, 其中, PC1和PC2的累计方差贡献率为81.2%, 基本可以全面反映土壤微生物群落结构的分异特征.冻融初期和融冻后期主要聚集于第1、4象限, 冻融后期和稳定冻结期分别位于第2象限和第3象限, 融冻初期位于第4象限, 说明季节性冻融对扎龙湿地土壤微生物群落结构影响较大.其中, 对第1主成分起主要作用的PLFA为12:0、16:0和18:0, 对第2主成分贡献较大的PLFA为18:1ω9c和18:2ω6c.
图 3(Fig. 3)
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| 图 3 不同冻融时期土壤微生物磷脂脂肪酸主成分分析 Fig. 3Principal component analysis of soil microbial phospholipid fatty acids under different freeze-thaw periods |
3.6 土壤微生物群落结构与土壤理化性质间的关系冗余分析结果表明(图 4), 第1轴和第2轴分别解释了土壤微生物群落结构变异的59.5%和18.3%, 二者累计解释变异量达77.8%, 模拟效果较好.其中, 土壤含水率主要是与总磷脂脂肪酸、细菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、放线菌及过氧化物酶、多酚氧化酶的相关性最强；土壤全磷、速效磷、速效氮主要是与真菌及β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的相关性最强；土壤碳氮比和有机质主要是与β-葡萄糖苷酶的相关性最强；土壤全氮与革兰氏阳性菌/革兰氏阴性菌的相关性最强；土壤pH值与酸性磷酸酶的相关性最强；真菌/细菌受环境因子的影响较小.此外, 真菌与过氧化物酶和多酚氧化酶表现为显著负相关；细菌与β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶呈显著负相关.
图 4(Fig. 4)
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| 图 4 土壤微生物群落结构与土壤环境因子的冗余分析 (Total PLFA：总磷脂脂肪酸；B：细菌；F：真菌；A：放线菌；G+：革兰氏阳性菌；G-：革兰氏阴性菌；G+/G-：革兰氏阳性菌/革兰氏阴性菌；F/B：真菌/细菌；BG：β-葡萄糖苷酶；NAG：β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶；ACP：酸性磷酸酶；PER：过氧化物酶；PPO：多酚氧化酶) Fig. 4Redundancy analysis of soil microbial community structure and soil environmental factors |
4 讨论(Discussion)4.1 季节性冻融对土壤微生物群落结构的影响本研究中, 12:0、16:0、18:0、19:0、18:1ω9c和10Me16:0是扎龙湿地土壤微生物的主要类群, 但不同冻融时期各优势PLFA含量存在一定差异.冻融初期至稳定冻结期土壤微生物总PLFA含量急剧下降达到最低值, 可能是由于土壤冻结产生的冰晶体膨胀对细胞膜造成机械损伤, 导致微生物数量减少；进入融冻期后气温逐渐回升, 土壤自由水含量增加, 冻融期积累的有效养分得到释放和转运, 刺激微生物的快速生长和繁殖, 致使土壤总PLFA含量在土壤融冻期显著增加.土壤细菌PLFA含量与总PLFA含量变化趋势一致, 在稳定冻结期大量冷敏感细菌死亡或休眠, 而耐低温细菌得以存活并维持一定的活性；在融冻后期土壤冻结过程中被固定的有效底物及破碎的土壤团粒、植物根系、凋落物和死亡微生物所释放的大量养分又为细菌快速增殖提供有利条件, 这与前人的研究结果相一致(吕欣欣等, 2016).本研究还发现, 扎龙湿地土壤真菌/细菌在稳定冻结期最高, 这说明真菌对冻融环境的适应性更加灵活并具有较强的耐受能力.冻融期土壤水分相对缺乏限制了细菌生长, 而真菌菌丝体能够利用土壤颗粒周围吸附的未冻水以保持自身生理代谢活性.因此, 对于恶劣环境的适应能力及在物质和能量的积累效率方面, 真菌明显优于细菌.王怀玉等(2012)对川西亚高山森林土壤微生物群落的研究也证实, 在季节性土壤冻结过程中细菌和放线菌数量显著减少, 真菌数量显著增加.而本研究中真菌PLFA含量在稳定冻结期最高但不同时期间差异均未达到显著水平, 这可能是稳定冻结期积雪覆盖在一定程度上为表层土壤提供了相对稳定的生境, 真菌的耐受性较高取得了生存优势, 但真菌更适宜生长在偏酸性环境中, 而扎龙湿地土壤pH值较高并不利于真菌和放线菌的生长.土壤微生物具有迅速调节自身结构来适应复杂环境变化的能力, 不同微生物类群对冻融过程的响应机理存在很大的差异, 这种差异可能对中高纬度湿地生态系统功能变化具有重要指示作用.
4.2 季节性冻融对土壤胞外酶活性的影响胞外酶是土壤微生物代谢活性和养分分解潜力的重要指示参量, 尽管季节性冻融可能降低部分酶活性, 但在低温环境下胞外酶依然对维持湿地生态过程具有重要意义(Mikan et al., 2002).β-葡萄糖苷酶(BG)在纤维素降解过程中发挥关键作用, 其降解产物是土壤微生物的主要能量来源.本研究中, BG在冻融初期最高、融冻初期最低, 可能由于在冻融初期凋落物周转速率降低, 土壤有机质积累较多, 而低温又限制了微生物的生长代谢, 进而提供更多可利用底物增加了BG活性.融冻初期地温逐渐升高, 微生物代谢增强, 植被根系重新萌发, 激烈的竞争使得土壤中可利用底物含量下降, 加之积雪融化过程中的淋溶作用也导致部分碳素损失, 从而降低土壤BG活性.Chaer等(2009)研究发现, 土壤β-葡萄糖苷酶经历连续冻融后其活性降低16%, 与本文结果相似.β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)与氮素的循环和转化密切相关, 其活性可表征土壤氮素营养的供给状况(杜林森等, 2018).本研究表明, 冻融作用所产生的强烈干扰不仅可以造成部分非耐寒微生物活性降低甚至死亡, 同时微生物残体又可作为NAG的有效底物促使自身活性增强, 这与沈丹杰等(2017)在川西高寒地区的研究结果一致.酸性磷酸酶(ACP)能将有机磷水解为无机磷以供植物利用和吸收, 其活性的高低直接影响土壤中有机磷的分解转化及生物有效性(朱利霞等, 2019).本研究中ACP呈先升高后降低趋势, 这说明ACP在冻结土壤中并未完全钝化, 冬季低温致使土壤中磷元素有效性降低, 微生物会分泌更多的ACP促进有机磷矿化来缓解自身的磷限制(Garcia-Gil et al., 2000；Zong et al., 2016).扎龙湿地土壤过氧化酶(PER)和多酚氧化酶(PPO)活性与微生物总PLFA含量变化趋势一致, 说明季节性冻融过程中土壤微生物的繁殖和代谢会受到抑制, 进而也限制了氧化酶活性.土壤微生物和胞外酶受到冻融胁迫时具有不同权衡策略, 全球变暖导致冬季冻融循环格局变化可能改变微生物与胞外酶间的协同关系, 从而对寒区湿地生态系统物质循环和能量转换产生正反馈效应.
4.3 土壤环境因子对微生物和胞外酶的影响土壤环境因子可通过不同途径调控微生物代谢进而影响胞外酶活性(刘银银等, 2013).冗余分析结果表明, 总PLFA、细菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、放线菌、PER和PPO与土壤含水率呈显著正相关, 说明土壤含水率是调控微生物群落代谢及能量转化的关键因子, 这与闫浩等(2014)的研究结论一致.冻融期随着温度的降低, 土壤含水率和含氧量也逐渐降低, 直接导致好氧微生物的生理性干旱并逐渐被厌氧、嗜冷微生物所替代；融冻期雪水下渗增加了土壤含水率和有效底物, 为嗜冷微生物受损细胞修复和再繁殖提供了有力条件(李昌明等, 2012).PER和PPO与真菌呈负相关关系, 这是由于真菌可利用PER和PPO降解土壤中的木质素和酚类化合物等难分解的大分子有机质, 这也许能够解释真菌在稳定冻结期驱动土壤氧化酶活性模式中的重要性.扎龙湿地真菌和NAG与土壤全磷、速效磷、速效氮呈显著正相关关系, 可表征土壤氮、磷元素的积累状况.季节性冻融过程中养分的释放对真菌的生长与代谢具有一定的选择作用, 也对NAG活性具有激活效应.土壤有机质与BG呈显著正相关, 土壤有机质既可以通过改变微生物代谢强度来影响胞外酶的释放, 也可以直接调控由胞外酶参与的生化反应速率(左宜平等, 2018).刘亚军等(2017)研究表明, 较高的土壤有机质含量有助于增强土壤BG活性.由此可见, BG能够反映土壤有机质的转化和分解效率, 是评价扎龙湿地土壤生境质量的重要指标之一.扎龙湿地土壤微生物对季节性冻融的响应存在较大差异, 而短期监测可能会掩盖微生物和胞外酶对冻融效应的敏感性, 今后还需开展更为深入的长周期野外定位监测及综合分析植被、水文、浮游生物与微生物间的交互作用机制.
5 结论(Conclusions)1) 季节性冻融过程对扎龙湿地土壤微生物群落结构产生了一定影响, 其中, 总PLFA与细菌PLFA含量均在融冻后期最高、稳定冻结期最低, 而不同时期真菌PLFA含量差异不显著, 其最高值出现在稳定冻结期, 暗示真菌对冻融环境的耐受和抗干扰能力强于细菌.
2) BG、PER和PPO活性主要表现为先降低后升高趋势, 峰值分别出现在冻融初期和融冻后期, 而NAG和ACP活性则相反, 峰值出现在稳定冻结期和融冻初期, 说明5种胞外酶对季节性冻融的响应和适应策略有所不同.
3) 土壤含水率是影响总磷脂脂肪酸、细菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、放线菌、PER和PPO的主要环境因子；真菌、NAG与土壤全磷、速效磷、速效氮呈显著正相关；BG和ACP分别受土壤碳氮比、有机质和pH值的影响, 表明土壤微生物和胞外酶活性是反映土壤养分循环状况的重要指标.
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