摘要： 【目的】本研究旨在克隆与鉴定家蚕Bombyx mori C类清道夫受体基因BmSR-C，为探析其在家蚕免疫中的功能奠定基础。【方法】利用RACE技术克隆家蚕C类清道夫受体基因全长序列，并对其进行生物信息学分析。利用RT-PCR和qPCR方法对BmSR-C基因的时空表达情况进行检测。通过原核表达和Ni+亲和层析的方法获得BmSR-C重组蛋白，免疫昆明小鼠制备抗BmSR-C多克隆抗体。利用ELISA法和Western blot分别对鼠抗BmSR-C蛋白多克隆抗体的效价和特异性进行检测。构建家蚕BmSR-C的真核表达载体，转染家蚕BmE细胞，分析该蛋白的亚细胞定位情况。【结果】克隆获得家蚕BmSR-C基因(GenBank登录号: BGIBMGA004577)，其开放阅读框(ORF)全长为1 821 bp，编码606个氨基酸残基。BmSR-C具有典型的C类清道夫受体家族结构特征，主要由CCP, MAM和SO结构域以及靠近C端的单次跨膜结构域组成。进化分析结果显示鳞翅目昆虫SR-C单独聚为一支，家蚕BmSR-C与同为鳞翅目昆虫的草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda和大红斑蝶Danaus plexippus的同源蛋白亲缘关系最为接近。对BmSR-C基因的时空表达分析表明，BmSR-C在家蚕的马氏管和血细胞中高表达，而在其他组织中无明显表达；其在家蚕不同发育时期的血细胞中均有表达，且在4龄眠期的表达量达到峰值。ELISA检测结果显示，所制得抗体效价高达 1∶128 000；Western blot检测结果显示，该抗体可以特异性识别重组蛋白。家蚕BmE细胞中的亚细胞定位结果表明BmSR-C主要定位于细胞膜。【结论】获得家蚕C类清道夫受体基因BmSR-C的完整cDNA序列及其表达特征；成功制备了BmSR-C的多克隆抗体，利用家蚕BmE细胞在细胞水平上分析了BmSR-C的亚细胞定位情况，推测其参与家蚕的生长发育及病原微生物入侵的免疫反应，为进一步研究BmSR-C的生物学功能奠定了基础。
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家蚕C类清道夫受体BmSR-C的基因克隆、原核表达及亚细胞定位
本站小编 Free考研考试/2022-01-03
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