吴杰¹, 全建平¹, 叶勇¹, 吴珍芳¹, 杨杰¹, 杨明^,2, 郑恩琴^,1 1. 华南农业大学动物科学学院,国家生猪种业工程技术研究中心,广州 510642
2. 仲恺农业工程学院,动物科技学院,广州 510225

Advances in assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing

Jie Wu¹, Jianping Quan¹, Yong Ye¹, ZhenFang Wu¹, Jie Yang¹, Ming Yang^,2, Enqin Zheng^,1 1. National Engineering Research Center for Breeding Swine Industry, College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
2. College of Animal Science and Technology, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China

通讯作者: 杨明，博士，高级畜牧师，研究方向：动物遗传育种。E-mail:yangming@zhku.edu.cn;

编委: 朱卫国
收稿日期:2019-11-14修回日期:2020-01-29网络出版日期:2020-04-20

基金资助:

广东省“扬帆计划”引进创新创业团队项目编号.2016YT03H062 广东省现代农业产业技术体系生猪创新团队项目编号.2019KJ126 广东省自然科学基金项目资助编号.2017A030313213

Corresponding authors: 郑恩琴，硕士，高级实验师，研究方向：遗传育种。E-mail:eqzheng@scau.edu.cn
Editorial board: ZHUWei-guo
Received:2019-11-14Revised:2020-01-29Online:2020-04-20

Fund supported:

Supported by Guangdong YangFan Innovative and Entrepreneurial Research Team Program No.2016YT03H062 Guangdong Modern Agricultural Industry Technology System Pig Innovation Team Project No.2019KJ126 Guangdong Natural Science Foundation.2017A030313213

作者简介 About authors
吴杰,硕士研究生,专业方向：分子遗传与动物育种。E-mail:wujiezi163@163.com。









摘要
染色质转座酶可及性测序(assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing, ATAC-seq)诞生于2013年,具有比脱氧核糖核酸酶I超敏感位点测序(deoxyribonuclease I hypersensitive site sequencing, DNase-seq)和微球菌核酸酶敏感位点测序(micrococcal nuclease sequencing, MNase-seq)更快速、灵敏、简便的优点,是目前分析全基因组范围染色质开放区域的热点技术。通过该技术能获得染色质开放区域的相关信息,从而映射出转录因子等调控蛋白的结合区域和核小体定位等信息,对于研究表观遗传分子机制具有重要意义。本文比较了5种获取染色质开放区域技术的优缺点,重点介绍了ATAC-seq的原理和主要流程,描述了利用ATAC-seq技术研究染色质开放区域的发展概况以及ATAC-seq的相关应用,期望对真核生物全基因组水平的染色质开放区域研究、顺式调控元件鉴定以及遗传调控网络的解析等提供借鉴。
关键词： 染色质转座酶可及性测序;染色质开放区域;Tn5转座酶;表观遗传修饰;转录因子

Abstract
Assay for transposase accessible chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) was developed in 2013. It has the advantages of more convenient operation and higher efficiency for DNA recovery than DNase I hypersensitive site sequencing (DNase-seq) and micrococcal nuclease sequencing (MNase-seq). ATAC-seq currently is the most popular technique of genome-wide mapping for chromatin accessibility. It provides information on binding regions of transcription factors and nucleosome localization on the chromatin. Thus, ATAC-seq is of great significance for studying the epigenetics and molecular mechanisms in chromatin structure. In this review, we compare the advantages and disadvantages of multiple techniques for profiling chromatin accessibility, and summarize the principles, main process, development and applications of ATAC-seq. We hope this review will provide a reference for study of genome-wide mapping for chromatin accessibility, identification of cis-regulatory elements, and dissection of the epigenetic and genetic regulatory networks using the ATAC-seq technology in eukaryotes.
Keywords：assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing;open chromatin regions;Tn5 transposase;epigenetic modification;transcription factor


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吴杰, 全建平, 叶勇, 吴珍芳, 杨杰, 杨明, 郑恩琴. 染色质转座酶可及性测序研究进展. 遗传[J], 2020, 42(4): 333-346 doi:10.16288/j.yczz.19-279
Jie Wu. Advances in assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing. Hereditas(Beijing)[J], 2020, 42(4): 333-346 doi:10.16288/j.yczz.19-279


自然界中的生物根据其细胞核类型可以分为原核生物和真核生物,其中原核生物的细胞核无核膜包被,其遗传物质DNA裸露在外;而真核生物细胞的细胞核DNA并非裸露,而是以左旋超螺旋的方式(约147 bp)绕八聚体结构的组蛋白1.67圈,进而形成核小体^[1,2]。相邻核小体的连接区由10~80 bp的游离DNA与组蛋白H1共同构成;核小体通过连接区的连接形成串珠式结构,这种串联结构进一步折叠、凝聚,形成染色质;最终多条染色质以高度螺旋化状态包裹于细胞核中^[3]。研究显示,染色质开放区域的基因组占总DNA序列的2%~3%,且超过90%的开放区域均与转录因子(transcription factor, TF)的结合相关^[4]。以TF为代表的调控因子可与其他染色质结合蛋白相互作用,从而动态调控和维持染色质稳态,在发育过程的调控中发挥着不可替代的作用^[5,6,7]。在DNA复制或转录过程中,DNA的折叠结构被打开,一些染色质区域处于开放状态,调控因子(如转录因子)会与这些裸露的无核小体结合的DNA部位结合,进而调控DNA的复制或转录过程^[8]。此外,有研究表明,DNA折叠、凝聚形成的染色质物理结构并不是一成不变的,仍然能够发生动态的表观遗传修饰,如DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑等^[8,9,10,11]。因此,通过了解相关获取染色质开放信息的技术,学习技术原理和应用,明确了这些技术对于基因组调控元件的鉴定、转录因子结合位点的识别及转录调控机制等研究均具有重要意义。本文主要综述了染色质可及性研究技术的发展概况、以及染色质转座酶可及性测序(assay for transposase accessible chromatin with high-throughput sequencing, ATAC-seq)技术的原理和应用,以期为表观遗传学研究提供重要的参考。

1 染色质开放区域研究技术的发展历程

染色质开放区域的研究源于人们发现某些染色质特定位点表现出对DNase I酶切的高度敏感性^{[12,13,14,15]}。后期研究表明,这些DNase I敏感位点(deoxyribonuclease I hypersensitive site, DHS)通常是顺式调控元件所在区域^[16],其染色质裸露、结构疏松,可与转录因子结合,从而便于DNase I与之结合并剪切,进而表现出高度敏感性^[17]。基于上述原理,染色质开放区域的鉴定工作也随之展开。最先开展的是DHS鉴定分析工作,该分析依赖DNase I高度敏感性特点,并与 Southern 杂交技术结合,不过很快发现该方法的灵敏性和精确性都较低,并且耗时费力^[18,19]。随着高通量测序技术(high-throughput sequencing, HTS)的发展及测序成本不断降低,衍生出一系列研究染色质开放区域的技术与方法,如脱氧核糖核酸酶I超敏感位点测序(deoxyribonuclease I hypersensitive site sequencing, DNase-seq)^[20]、微球菌核酸酶敏感位点测序(micrococcal nuclease sequencing, MNase-seq)^[11]、甲醛辅助性调控元件分离测序(formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements followed by sequencing, FAIRE-seq)^[21]、核小体定位和甲基化组测序(nucleosome occupancy and methylome sequencing, NOMe-seq)^[22]和ATAC-seq。在上述5种技术中,获取染色质开放信息的方式分为3种：DNase-seq、MNase-seq以及ATAC-seq采用酶切法;FAIRE-seq采用物理断裂法;NOMe-seq技术则利用甲基化修饰。5种技术的具体信息见表1。ATAC-seq与其他4种技术相比表现出更为简便和高效的优势,一经发明就被广泛采用,成为当前染色质开放区域获取的前沿技术。下面将对上述染色质开放区域获取技术的发展历程、作用机理以及研究进程进行描述。

Table 1
表1
表15种染色质可及性研究技术介绍
Table 1Introduction of five chromatin accessibility assays

技术	细胞类型及数量	获取方式	目的	特点	参考文献
DNase-seq	需要1,000,000~ 10,000,000的任何 细胞类型	DNase I 酶切	获取染色质开放信息	(1)比传统方法操作更简便; (2)细胞需要量大; (3)酶最优酶切浓度确定过程繁琐; (4)样品制备过程复杂且耗时	[20,24]
MNase-seq	需要1,000,000~ 10,000,000的 任何细胞类型	微球菌 核酸酶酶切	绘制核小体图谱以间 接探测染色质可及性	(1)操作简单,后期数据处理方便; (2)细胞样本需要量大; (3)酶浓度和切割温度难以确定	[26,27]
FAIRE-seq	需要100,000~ 10,000,000的任 何细胞类型	超声波 物理断裂	获取染色质开放信息	(1)不用酶切、不需要分离出细胞核; (2)没有序列切割特异性; (3)细胞需要量大; (4)甲醛最佳交联程度难以确定	[21,24,31]
NOMe-seq	至少1,000,000 的任何细胞类型	甲基化修饰	获得内源DNA甲基化 的信息并定位核小体	(1)不需要使DNA断裂,不会产生富集偏差; (2)同时获得含GpC和CpG二核苷酸的信息; (3)细胞需要量大	[22,34]
ATAC-seq	500~50,000个 新鲜分离的细胞	Tn5转座 酶酶切	获取染色质可及性、 转录因子结合以及 核小体定位信息	(1)过程简便、效率高; (2)数据分析工具不够成熟; (3)线粒体、叶绿体中的DNA污染; (4)冷冻组织细胞DNA提取效率低; (5) DNA片段损失过多	[36~38]

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1.1 DNase-seq及其衍生技术

早在2006年,DNase-seq技术便被用于DHS区域的探究。该技术过程可简单概括为：先通过裂解剂裂解细胞释放细胞核,选用最佳浓度DNase I消化细胞核并包埋于低熔点凝胶琼脂糖塞中,以减少额外的随机剪切;随后,将DNA片段平末端化并在两端连接上接头,通过PCR扩增目的片段完成测序文库构建^[20]。DNase-seq鉴定大多数转录因子的结合位点的精确性主要取决于酶切片段大小,其中短片段(<100 bp)比较长片段效果更佳^[23]。DNase-seq技术的建立使得DHS的分析鉴定变得更简便,但存在细胞量需要量大(1,000,000~10,000,000)、样品制备过程复杂且耗时、最优酶浓度确定过程繁琐等缺点^[24]。2015年,Cumbie等^[25]发现使用传统DNase-seq技术消化拟南芥(Arabidopsis thaliana)时,无法获得足够的DNA量用于建库测序。其主要原因在于植物细胞碎片及根毛等杂质占据了凝胶琼脂糖塞,从而导致DNA产量过低。因此,他们在传统DNase-seq基础上建立了DNase I-SIM (for simplified in-nucleus method)技术。该技术在DNase I消化细胞核前,先采用Percoll层析液对细胞核进行初步纯化;经DNase I消化后,在T4 DNA聚合酶的作用下,DNA片段的双链形成平末端,而不包埋于琼脂糖塞中。这种改进的DNase I-SIM技术的优点在于,Percoll梯度纯化后的细胞核及T4 DNA聚合酶处理后的DNA片段依然具备高度完整性,在极大缩减DNase- seq文库制备时间的同时,有效提升了DNA片段的回收效率。

1.2 MNase-seq技术

MNase-seq技术发明于2008年,其原理与DNase-seq大体相似,不同之处在于,该技术采用的是微球菌核酸酶替代DNase I酶,进而对细胞核中的DNA进行切割。该技术可通过揭示由核小体和其他调节因子占据的基因组区域,从而间接探测染色质可及性并绘制核小体图谱^[26]。与DNase-seq相比,MNase-seq具有操作简单、后期数据处理更方便等优点。然而,MNase-seq技术仍存在一些技术弊端。首先,其灵敏度同样受到细胞样本数量(1,000,000~ 10,000,000)、酶浓度和切割温度等因素的影响^[27];其次,微球菌核酸酶对A/T碱基序列存在切割倾向性^[28],从而无法精确切割核小体边界^[29]。

1.3 FAIRE-seq及其衍生技术

2007年,Giresi等^[21]开发了一种物理打断DNA双链的技术,即FAIRE-seq技术,其过程相较DNase-seq更为简便。该技术是利用超声波打断已用甲醛交联的DNA序列,在未解交联的条件下,通过酚-氯仿抽提,提取位于水相中的游离DNA并测序,最终获得相应的染色质开放区域信息^[21]。FAIRE-seq具有不需要酶、不需要分离出细胞核、不受细胞类型限制、没有序列切割特异性^[30]、以及在增强子区域具有更高的覆盖率等优点^[31],但同样面临着样品需求量大的限制(需要100,000~10,000,000的细胞)^[24]。值得注意的是,该技术难以确定甲醛最佳交联程度,从而成为限制该技术应用的最大瓶颈。究其原因在于,DNA与甲醛过度交联或不充分交联,均会影响到最终的测序结果^[32]。2009年,Auerbach等^[33]在此基础上创建了超声处理交联染色质测序(sonication of cross-linked chromatin sequencing, Sono-seq)技术,其原理与FAIRE-seq相同,其主要区别在于,FAIRE- seq是在酚-氯仿抽提之后进行大小分级,选择特定大小范围如100~350 bp范围进行建库测序。由于存在大小分级选择这一关键步骤,Sono-seq与FARIRE- seq各自所鉴定的Peaks存在明显的区别。

1.4 NOMe-seq技术

NOMe-seq技术由Kelly等^[22]于2012年发明,该技术利用GpC甲基转移酶(M.CviPI)通过甲基化修饰的方式处理开放区域的GpC二核苷酸。因为GpC^m不存在于人类基因组中,M.CviPI使GpC甲基化为无内源背景的GpC^m。随后,经过亚硫酸氢盐处理和全基因组测序,可同时获得含GpC和CpG二核苷酸的相关信息,从而能在全基因组范围内确定核小体的位置,同时还能获得内源DNA甲基化的信息^[22,34]。NOMe-seq需要的细胞量为1,000,000个,材料处理因为不需要使DNA断裂,因此不会产生富集偏差,从而可降低假阳性的概率。但由于NOMe-seq不是基于先富集目的片段,然后再测序的方法,因此需要大量的测序读长数据以获得足够的深度及基因组覆盖率,从而获取整个基因组的开放性水平^[35]。

1.5 ATAC-seq技术

以上4种技术虽然都能应用于染色质开放性的表观基因组学研究,但通病是通常需要几万至数百万个细胞作为输入材料用以平均细胞群体的异质性,涉及到复杂、耗时的样品制备过程,且不能同时探究核小体定位、染色质可接近性和TF结合的相互作用。而多数情况下,很多重要且稀少的细胞亚型可能很难提供足够的样品量进行全基因组染色质可及性分析。2013年,Buenrostro等^[36]建立了材料需求量少、过程更为简便、效率更高的ATAC-seq技术。该技术仅需两步就能从500~50,000个细胞捕获染色质开放区域^[36,37]。与其他技术方法不同的是,ATAC-seq利用高度活跃的Tn5转座酶代替DNase I核酸酶、微球菌核酸酶MNase等分析染色质易接近性,能够将目的DNA片段化、末端修复和加上测序所需的接头(adaptor)一步完成,从而使建库步骤变得极为简便,达到投入量更低、通量更高的建库效果。Tn5转座子的深入研究以及高通量技术的快速发展使得ATAC-seq技术能够成功建立并广泛应用,ATAC-seq技术以及其衍生技术如转座子超敏位点测序(transposome hypersensitive sites sequencing, THS-seq)、Omni-ATAC技术使染色质开放区域的获取更加精准、高效,必将成为染色质开放区获取的主流技术之一。

2 ATAC-seq作用机理和过程

2.1 Tn5转座酶的发现及作用机理

20世纪40年代,美国遗传学家Barbara McClintock发现了转座子(transposon)^[39]。转座子也叫跳跃基因或转座因子,是一段可以改变其在基因组中的位置的DNA序列。转座因子几乎存在于所有真核生物的基因组中,其衍生物构成了基因组的很大一部分,从而在基因组功能和进化过程中发挥着重要作用^[40]。根据转座子的结构特点和转座方式可将其分为I型和II型。I型转座子,也称作RNA转座子(即反转录转座子),转座方式为“复制-粘贴”型,即转座时先将自身转录获得RNA,再反转录回DNA,增加自身一倍的拷贝数,增加的DNA再转座至新的位置。II型转座子,也称作DNA转座子,直接以“剪切-粘贴”的方式剪切下自身的DNA序列插入到新的位置,不会增加拷贝数。

Tn5转座子是一种细菌转座子,属于II型转座子的一种^[41],最早是在Escherichia coli中被发现。Tn5由编码卡那霉素(kanamycin, KAN)、新霉素(neomycin, NEO)、链霉素(streptomycin, STR)3种抗生素的核心序列和位于侧翼的两个高度同源且倒置的 IS50(insertion sequence, IS)序列组成,该DNA序列全长5818 bp^{[42,43,44,45]}。其中,IS50序列可编码参与转座的蛋白：转座酶(transposase, Tnp)和转座阻遏蛋白(transposase inhibitor, Inh)。但由于左侧末端的IS50L序列的第1442位碱基处T/A碱基对被C/G碱基对取代发生突变,导致翻译提前终止,因此仅有IS50R能够表达正常有活性的Tnp和Inh^[43]。每个IS50序列具有两个19 bp的倒置末端：外末端(outside end, OE)和内末端(inside end, IE)。两倒置末端有7个bp不同,该末端是Tnp的结合位点^[46,47,48]。

转座发生过程大致分为3个步骤：(1)形成转座复合体。Tnp分子的两个N末端结构域分别结合到Tn5转座子的两个OE末端,形成两个Tnp-OE复合体^[49];随后以末端第2位序列为中心弯曲约36°~ 48°^[50],两个复合体发生联会,Tnp的C末端结构域相互作用而二聚体化,形成一个二聚体蛋白与两分子DNA组成的Tn5转座复合体^[51,52];(2) Tnp切割。形成转座复合体结构后,Tnp便具备了切割DNA的活性^[53],且正因为上述转座复合体结构,结合在左末端的Tnp便会催化右末端的磷酸二酯键水解,而结合在右末端的Tnp负责催化左末端的磷酸二酯键水解,以此有效防止Tnp只对转座子DNA链的一端进行切割^[54,55];(3)插入靶序列。Tnp通过活化水分子水解DNA链,使Tn5两末端分别形成3ʹ-OH亲核基团,该亲核基团对DNA互补链进行亲核攻击,形成发夹结构,另一活化的水分子水解发夹结构,使Tn5的两端均变为平末端,此时整个转座复合体离开供体DNA,向靶序列结合^[56];转座子的3'-OH基团以交错的方式攻击靶序列中的磷酸二酯键,使转座子插入位点间形成9 bp的粘性末端,通过其3'-OH端同靶序列的5ʹ-P之间形成共价键,插入到靶DNA中^[57,58],随后在DNA聚合酶的作用下,Tn5的两侧翼形成9 bp的正向重复序列补齐缺口^[59]。至此,整个转座过程完成。

通过上述转座过程不难看出,体外Tn5转座过程仅需4个条件便能完成：Mg²⁺、转座子末端序列、Tnp和靶DNA^[60]。ATAC-seq过程中使用的就是简化后的二聚体转座复合物。复合物仅含有3个部分：转座酶、末端序列和测序接头^[61],能够保证在切割DNA的同时连接上接头以便后续的测序工作。同时,简化复合物的Tnp在Tn5主链上携带了特异的点突变体,使Tnp具有了更高的活性^[60,62]。另外,之所以需要Mg²⁺,是由于Mg²⁺在转座过程中能协同亲核基团,在Mg²⁺的作用下,转座酶上催化转座子运动的DDE基序(天冬氨酸和谷氨酸)与Mg²⁺配位发 生突变,使原本不活跃的转座酶变成高度活跃状 态^[63,64],是完成转座必不可少的因子之一。目前,Tn5转座子以其转座的随机性好、稳定性高、插入位点容易测序等特点,已经成为分子遗传学研究的热门工具^[65,66]。随着高通量测序技术的发展和实验通量的不断增加,Tn5转座酶因其优势被应用得越来越广泛。其中,极速建库、长读长测序技术(single tube long fragment read, stLFR)、单细胞测序、 Mate Pair文库构建、染色质转座酶可及性可视化分析(assay of transposase-accessible chromatin with visualization, ATAC-see),以及近几年发现的Tn5家族对于蛋白结合区域、互作基因片段等研究的帮助都显示Tn5转座酶拥有不可估量的应用潜力^[67,68,69]。Buenrostro等^[36]建立的ATAC-seq技术,正是充分利用了Tn5酶在测序建库中的巨大优势,能高效、精准的从基因组水平鉴别出染色质开放区域,在生命科学领域的遗传学研究中发挥着至关重要的作用。

2.2 ATAC-seq主要过程

ATAC-seq涉及3个主要的步骤^[36,38]：(1)获取细胞核。使用冷裂解缓冲液裂解细胞;(2)转座和纯化(图1A)。细胞核提取后立即将沉淀重悬于转座酶反应混合物中,转座后使用Qiagen MinElute PCR Purification Kit纯化样品;(3) PCR扩增(图1B)。纯化后,进行qPCR定量分析以及PCR扩增。上述过程大概需要3 h,几处细节的处理尤为重要：(1)为减小PCR中的片段大小和GC偏差影响,需要通过qPCR来确定PCR后续的循环数,在饱和前停止扩增,以此保证转座后片段大小在40 bp~1 kb范围而不需要进行大小选择,维持较高的库复杂性;(2)因转座过程产生了9 bp的空隙,因此PCR的第一步需要72℃反应5 min以填补该空隙,且所用的PCR酶是具有链置换功能的非热启动酶;(3)对于一个DNA片段而言,两端接头连接是随机的。Tn5酶切后会出现3类产物：单端接头1、单端接头2以及双端接头1-接头2,只有连接不同接头的片段可用于富集扩增及测序。

图1

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图1转座及扩增过程示意图

A：转座过程;B：扩增过程。
Fig. 1The schematic transposition and PCR amplification process

2.3 数据分析

ATAC-seq的数据分析过程大概可分为4个阶 段^[24]：第一阶段的数据预处理主要包括了过滤、比对和数据质量检测,利用软件CASAVA(Illumina)获得FASTQ文件后过滤掉低质量片段,由于相邻转座的最小间隔为38 bp,通常38 bp以下的片段直接删除^[61],并用Bowtie与参考基因组进行比对,随后利用SAMtools去除重复的以及细胞器的reads;第二阶段是质控、数据可视化和peak calling,第二次的质控标准包括线粒体基因组所占比例高低和插入物大小分布图,使用软件IGV可对数据进行可视化处理,峰可以用软件macs2、Hotspot或者ZINBA寻找;第三阶段是peak注释,以获取基因组中peak的位置信息;最后一步为模体(motif)注释和差异peaks分析,将峰对应序列进行注释以间接确定转录因子信息,同时,利用diffbind、DESeq2等工具分析如不同的实验条件、多个时间节点、不同的发育时期等的差异区域,最终获得转录因子结合位点的染色质可接近性状态信息。

2.4 ATAC-seq优缺点分析

开展染色质开放区域的表观基因组学研究具有巨大的生物学意义,但过去的研究方法受到了复杂工作流程和大量细胞需求量的限制,从而导致该领域进展相对缓慢。直到ATAC-seq的出现,为注释开放染色质的基因组位置、DNA结合蛋白、转录因子结合位点等基因组功能元件提供了新的契机。ATAC-seq技术摆脱了像DNase-seq需要精确控制酶量以及FAIRE-seq需要确定甲醛交联时长等条件的限制,但依然存在影响其精确性的因素,如线粒体及植物细胞中叶绿体DNA的干扰、冷冻组织细胞DNA提取效率低、接头连接的随机性造成DNA片段的损失,以及大量酶切后的DNA 片段过大而无法富集等^{[24,36,38,70]}。针对上述缺陷,同样产生了一系列改进措施。例如,Lu等^[71]开发的FANS-ATAC-seq (fluorescent activated nuclei sorting, FANS)、Roger等^[72]开发的与细胞核基因组序列比对能达90%以上的INTACT (isolation of nuclei tagged in specific cell types)系统,以及与INTACT有相似结果的蔗糖沉淀法(crude)确保了在测定中使用高质量的完整细胞核的同时,能最大限度地减少线粒体和叶绿体中DNA的污染^[73]。Corces等^[74]发明的Omni-ATAC,提高了ATAC-seq对困难细胞系、稀少的原代细胞和临床上相关的冷冻组织中的应用普遍性。此外,针对接头的随机性和剪切后片段过大的问题,Sos等^[75]开发了THS-seq技术,具有比传统EzTn5转座酶活性更高的新型Tn5超突变体(Tn5059)以及更优化的反应溶液和条件。同时设计T7启动子加转录引物替换原Tn5转座复合物中的Adapter 1和2。通过转录生成单链RNA,利用与RNA测序相同的原理获得cDNA并加上衔接子,最终完成建库。该技术避免了接头的随机连接,大大提高了转座效率,使得测序数据更为完整。随着ATAC-seq技术被不断改进,ATAC-seq已逐渐成为目前染色质可及性分析的主流实验方法。

3 ATAC-seq的应用和拓展

3.1 ATAC-seq的应用

自ATAC-seq技术诞生起,该技术凭借其稳定性和高灵敏度已广泛应用于表观基因组学研究。除了能用来确定功能基因组调控区域信息、找出组织特异基因以及预测潜在结合蛋白外,还能跟其他分析技术联合,如RNA-seq、ChIP-seq(chromatin immunoprecipitation followed by high throughput sequencing)以及Hi-C (high-through chromosome conformation capture)等,用以发现潜在的关键调控元件、转录因子和理解控制体内复杂过程的基因调控网络。其应用包括如下方面：

(1) DNA调控功能元件注释。ATAC-seq最直接的功能就是用来研究各种调控因子如TF、启动子、增强子等的结合区域的开放状态以及对核小体进行定位,如对启动子区域开放状态的研究。Tan等^[76]为探究寿命长且癌症发病率极低的裸鼹鼠的遗传机制,用ATAC-seq探测其染色质开放区域,结果显示裸鼹鼠的重编程基因的启动子区域更多的是处于关闭状态。通过对启动子区域开放状态后进行SV40 LT (large tantigen, LT)抗原处理,发现LT可以抑制抑癌基因Rb,从而提高重编程效率;而LT处理后,启动子区可接近性较处理前更高。上述结果表明裸鼹鼠细胞具有更稳定的表观基因组,提示可以利用这种稳定性为人类癌症预防和治疗提供新见解。同样,还有对转录因子结合区域开放性的研究。Scharer等^[77]为深入了解系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)的表观遗传调控过程,对来自SLE和健康对照的CD19⁺幼稚B细胞进行ATAC-seq分析。他们发现与健康对照相比,参与B细胞活化的基因周围的基因座,以及调节B细胞活化和分化的TF的结合位点在SLE细胞中可接近性更高,该结果验证了与B细胞活化相关的区域的开放状态,为进一步研究SLE疾病机制打下基础,充分体现了ATAC-seq确定染色质开放区域和鉴定顺式调控元件的能力。Kristofer等^[78]利用ATAC-seq比较了致癌蛋白Ras^V12诱导的癌组织在早期肿瘤、晚期肿瘤与正常组织间染色质开放区域的状态。他们发现与正常组织比,肿瘤在发展过程中有数千个更容易接近的区域,从这些区域筛选并鉴定了在Ras依赖性肿瘤发生过程中异常活跃的调节区域,并结合motif分析确定出了结合这些区域的关键转录因子AP-1和Stat92E。后期通过引入突变使Stat92E丧失功能后,发现肿瘤的严重程度降低,证明了转录因子Stat92E在肿瘤治疗发展中重要意义,也对Ras依赖性肿瘤的发展有了新的认知。上述基于ATAC-seq和motif分析的成功案例表明,ATAC-seq可作为一种研究功能基因组调控区域和了解体内复杂基因调控网络的有效方式。另外,转录过程中,转录因子与核小体竞争结合DNA序列,转录因子结合处的核小体水平也因此较低^[79]。所以,获取核小体定位信息,对于了解转录调控、DNA复制和修复等过程也很重要。Quillien等^[80]为鉴定整个斑马鱼基因组中的细胞特异性增强子,对来自Tg (fli1a: egfp)^y1转基因胚胎的内皮细胞的细胞核进行ATAC-seq分析;在FANS技术的辅助下,用绿色荧光蛋白标记内皮细胞,通过荧光分离出细胞核获得高质量的ATAC-seq数据;后续通过分析短DNA片段(<100 bp)和长片段(180~247 bp)分别获得无核小体区及核小体结合区,以此定位核小体的位置。该研究揭示了整个基因组中转录起始位点的核小体定位模式以及与组蛋白修饰间的关联,还提供了在胚胎发育过程中控制基因表达的全基因组范围转录调控网络的动态信息。

此外,还有联合Hi-C分析寻找调控元件如增强子。2018年,Wang等^[89]利用ATAC-seq和Hi-C研究多倍体棉花的三维基因组结构和转录调控之间的关系。他们发现一些由DNase-seq数据获得的DHSs与启动子之间存在互作,并推测这些处于开放状态的区域是潜在增强子,与RNA-seq数据整合进一步确认这些关键候选增强子具有转录活性。Mas等^[90]联合Hi-C、ATAC-seq、ChIP-seq和RNA-seq四种技术,研究敲除甲基转移酶复合体亚基基因MLL2后对基因组三维结构、染色质可接近性、组蛋白修饰以及表达水平的影响。首先利用ChIP-seq和reChIP-seq检测二价修饰,鉴定二价启动子。再通过Hi-C分析发现MLL2的敲除会引起二价基因转录起始位点与上下游互作模式的改变。随后ATAC-seq研究发现敲除MLL2引起二价启动子区的可接近性减少。最终揭示了MLL2通过作用于二价启动子,维持相对集中的二价基因间互作,可接近性状态和转录水平正常的作用。总之,ATAC-seq能够与各种组学构建不同的关联模式,从不同的分析思路获取表观遗传信息或是探究转录调控机制,充分展现了其巨大的应用前景和无限的可能性。

3.2 单细胞ATAC-seq测序技术

染色质状态是以细胞类型特异性的方式动态调节的^[91]。虽然DNase-seq、ATAC-seq等技术用于测定全基因组水平染色质特定区域的可接近性,但测量获得的是群体细胞平均染色质状态,掩盖了细胞类型间和细胞内的异质性。因此,基于单细胞测序的ATAC-seq (single-cell assay for transposase-accessible chromatin, scATAC-seq)被用于探测单细胞水平的染色质可及性^[92]。scATAC-seq可应用于分析细胞亚群的基因调控网络、研究细胞异质性、发现生物标志物、研究单细胞表观基因组学等^[93,94]。

目前scATAC-seq主要通过两种技术手段来高效获取单细胞全基因组范围染色质开放信息,分别为微流控技术^[92]和ATAC-seq组合标签方法(single-cell combinatorial indexed ATAC-seq, sciATAC- seq)^[95]。单细胞ATAC-seq目前最常用的平台为 10× Genomics。其核心的微流控技术原理是将带有barcode信息的凝胶珠与转座酶处理后的细胞核混合,包裹在油滴中形成GEMs(Gel Beads-in- emulsion)。一个特定barcode序列标记一个细胞核的所有序列以此区别各个细胞。单细胞 ATAC-Seq微流控技术因其捕获率高、容纳量大和价格相对较低等优点,被广泛应用于探索由表观遗传变化引起的细胞异质性、探索生物标志物、了解基因表达上游的基因调控网络等方面^[93]。另外,2015年,华盛顿大学的Jay Shendure团队开发了ATAC-seq组合标签技术sciATAC-seq^[95]。该方法不必依赖微流控平台,而是利用细胞标签技术对细胞核进行分子标记,通过两次稀释标记-混匀-再稀释标记-再混匀,使单个细胞能够被唯一标记而无需物理分离细胞。以此获得大量单细胞的染色质开放信息。该技术与微流控scATAC-seq相比,每个实验可共同测定数百万个单细胞,获得更多的单细胞信息。sciATAC-seq的局限性是由于数据的稀疏性导致产生的数据集难以分析,无法获得较高的精确性^[96,97]。不过,相信随着数据集分析工具的不断改进,能够有效地提高分析精确性。如最新的分析工具Scasat可将开放的染色质信息作为二进制数据进行处理,并在保持数据的二进制特性的同时校正批次效应,使得该工具在分析scATAC-seq数据方面优于其他工具^[98]。sciATAC-seq常用于获取单细胞的染色质调控信息以研究转录调控机制^[99,100]。

单细胞测序也同样发展到了单细胞水平的多组学整合分析,这对于准确解析细胞群中的细胞间差异至关重要。通过单细胞多组学联合分析,如通过联合scATAC-seq和RNA-seq技术,同时获得单细胞的表观基因组和转录组学信息,能够鉴定引起这些不同细胞表型的致病的顺式和反式作用元件,揭示基因表达调控特异性。如用于研究肿瘤异质性^[93]、揭示造血系统异质性^[101]等。Cusanovich等^[94]为深入研究细胞亚群的基因表达调控机制,应用组合标签技术sciATAC-seq分析13个成年小鼠组织的10万个单细胞的基因组范围内染色质的可接近性,采用了一种label-transfer的方法,整合RNA-seq和ATAC-seq数据对细胞进行聚类分析,共鉴定出30个主要细胞亚群,随后确定出85种不同的染色质可接近性模式,以及近40万个差异可接近性元件。并使用这些数据将调节元件与其靶基因建立联系,鉴定出了许多组织特异性的转录因子。之后,通过将小鼠染色质开放性与人类全基因组相关联,揭示了部分人类遗传病与开放染色质间的潜在关系,拓展了该研究的意义。整个实验为组织结构,发育和分化,各组织器官的调控网络的研究提供了丰富的参考。scATAC-seq组合标签的方式进一步提高了单细胞ATAC-seq的通量,标签组合作为单细胞基因组学的一种推广策略^[102],sciATAC-seq具有不可估量的发展潜能。总之,单细胞多组学联合分析无论是在疾病研究还是了解基因组功能等领域上都有广泛的应用前景。

4 结语与展望

鉴定染色质开放区域并对其进行精确定位,对表观遗传学的研究具备重要意义。随着高通量测序技术的不断发展,以ATAC-seq为代表的染色质开放区域获取技术,将能系统发掘全基因组上的启动子、增强子、绝缘子和转录因子等重要调控元件的结合位点,对深入了解整个基因调控网络具有重要意义。除了应用于寻找组织特异基因、定位核小体外,将ATAC-seq的染色质开放信息进一步整合基因组、转录组、甲基化组等多组学数据,可更加立体、直观地了解复杂基因之间的相互作用及其对表型的影响效应。

当前,ATAC-seq技术已成为研究表观遗传调控的重要手段,其更加简便的操作过程和更易满足的实验材料,已在染色质开放区获取方面展现出无可比拟的优势和应用潜能。尽管该技术目前的数据分析工具还不够成熟,但不容质疑的是,其已成为表观遗传学研究的突破性技术。随着相应实验技术的进一步提高,可以预期,ATAC-seq将成为复杂性状遗传解析的研究利器之一,从而进一步推动人类、小鼠及其他动植物等生命科学领域的稳步向前发展。

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