0 引言
【研究意义】弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种细胞内寄生原虫,可以侵染温血动物的有核细胞,诱发弓形虫病,对人类及家畜造成重大危害及经济损伤[1,2]。弓形虫有极其复杂的生活史,可分为有性生殖和无性生殖,仅在终末宿主猫科动物的小肠上皮细胞内发生有性生殖,在终末宿主及中间宿主的有核细胞内均可发生无性生殖,健康宿主体内弓形虫速殖子增殖受阻转化为缓殖子,形成包囊[3,4,5]。弓形虫的卵囊、速殖子和包囊3种形态均具有感染性[1]。人类或动物食入含有速殖子的牛奶或奶制品可引起弓形虫病[6]。因此,掌握弓形虫速殖子的致病性,对了解弓形虫以速殖子形式传播具有重要意义。【前人研究进展】DUBEY等[7]将ME 49株弓形虫的卵囊灌胃Swiss小鼠,发现100—1 000个卵囊可引起小鼠100%死亡,100个卵囊灌胃小鼠后大脑包囊数为618个。另外,DUBEY[8]研究ME 49株弓形虫包囊灌胃小鼠后,引起小鼠感染的最低量为100个,平均包囊量为566,而经皮下注射10个组织包囊即可引起小鼠感染,大脑包囊平均数为680。【本研究切入点】ME 49株弓形虫的基因型为典型的Type II虫株,为弱毒虫株,而在国内流行的虫株主要为弱毒株,基因型为ToxoDB#9[9],未见ME 49虫株对昆明小鼠致病性的相关报道。因此对ME 49株弓形虫对小鼠的致病性特点进行深入研究。【拟解决的关键问题】本研究以ME 49株弓形虫速殖子为研究对象,探讨该虫株对昆明小鼠的致病特点,以期为中国弱毒虫株的毒力特点提供参考依据。1 材料与方法
1.1 试验材料
ME 49株弓形虫、兔抗弓形虫多克隆抗体、弓形虫抗原受赠于美国农业部寄生虫Dubey实验室。ME 49虫株于河南农业大学病理实验室经Vero细胞培养获得速殖子。HRP-鼠抗兔（DAB）试剂盒购买于Abcam公司,批号为ab64264。1.2 试验动物
2016年从郑州大学试验动物中心购买健康昆明小鼠45只,45—55日龄,体重18—25 g,弓形虫检测阴性,许可证号为SCXK（豫）2010-0002（试验动物处理遵守动物伦理与福利相关规定）。小鼠随机分为9组,8个感染组,1个对照组,每组5只小鼠,雌雄分开,饲养于河南农业大学试验动物房,饲养环境温度20—27℃,相对湿度40%—65%,照明采用12 h/12 h交替光照,自由采食清洁级全营养颗粒饲料,饮用高压灭菌水。1.3 弓形虫速殖子的稀释
收集ME 49株弓形虫速殖子细胞培养液,混匀后吸取20 μL滴于一次性血球计数板,在光学显微镜下观察并计数,计算公式为：(4 large squares/4)×10×104,初始速殖子浓度约为106个/mL。将计数后的培养液抽取1 mL,加9 mL的0.85%的生理盐水,依次10倍稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6直至最终稀释梯度液体内不含速殖子记为<100个。选取<100、100—106个/mL浓度的速殖子分别腹腔注射感染组昆明小鼠,接种量为1 mL/只,对照组小鼠腹腔注射无菌生理盐水1 mL/只。1.4 小鼠的监测及处理
每天观察小鼠的临床情况,记录发病和死亡情况。腹腔注射后60 d（days post inoculation,DPI）,采集全部小鼠血清,采用改良凝集试验方法（modified agglutination test,MAT）检测血清中弓形虫IgG抗体,具体步骤参照DUBEY [10],统计小鼠感染率。对60 DPI内死亡的小鼠肺脏及肠系膜淋巴结进行组织涂片,镜检观察是否含有弓形虫速殖子,并用10%的中性福尔马林溶液固定死亡小鼠肺脏,制作常规石蜡切片,采用苏木素与伊红染色法（Hematoxylin-Eosin staining,H.E）和免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）染色技术观察虫体及抗原分布,IHC染色具体步骤见文献[1]。60 DPI后,保留103、104、105感染组小鼠,将<100、100、101和102感染组小鼠乙醚麻醉后处死,显微镜检查其大脑包囊负载量,试验方法见文献 [7]。1.5 数据分析
采用软件Graph Pad Prism 5.0 software（Graphpad Software Inc.,San Diego,CA,USA）对得到的数据进行分析,并绘图。2 结果
2.1 小鼠腹腔注射弓形虫速殖子后的感染情况
0—60 DPI,小鼠血清中弓形虫IgG抗体结果显示,<100、100、101及≥102速殖子浓度组小鼠的弓形虫感染率分别为0、20%、60%及100%（表1）。104速殖子浓度组小鼠有3只分别在12、16、19 DPI 死亡;105速殖子浓度组小鼠有2只在11 DPI死亡,1只在8 DPI死亡;106速殖子浓度组小鼠有2只在9 DPI死亡,在7、8、10 DPI各死亡1只（表1）。对死亡小鼠的肺脏和肠系膜淋巴结涂片,显微镜镜检可见弓形虫速殖子,见图1-A、B;H.E及IHC染色,肺脏可以观察到弓形虫包囊及弓形虫抗原,见图1-D、E、F。感染弓形虫的小鼠生存率为62.07%（18/29）。Table 1
表1
表1腹腔注射ME 49株弓形虫速殖子对昆明小鼠的致病性
Table 1Pathogenicity of the ME 49 strain of T. gondii tachyzoites on Kunming mice by intraperitoneally
| 速殖子浓度 Concentration of tachyzoites | 感染数/接种数 No. infection/ No. inoculation (%) | 存活天数1) Days of survival 1) | 0-60 DPI死亡小鼠数量 Number of died mice in 0- 60 DPI | 每只小鼠大脑包囊数 No. of brain cysts of each mouse | 大脑包囊数平均数±标准误 No. of brain cysts Average ± Standard error |
|---|---|---|---|---|---|
| 106 | 5 /5 (100%) | 7/1, 8/1, 9/2, 10/1 | 5 | 0b, 0, 0, 0, 0 | 0 |
| 105 | 5 /5 (100%) | 8/1, 11/2, 188/1, ≥590/1 | 3 | 0, 0, 0, 20, alive/1 | 5.00±5.00, alive/1 |
| 104 | 5 /5 (100%) | 12/1, 16/1, 19/1, ≥590/2 | 3 | 0, 0, 0, alive/2 | 0, alive/2 |
| 103 | 5 /5 (100%) | 184/1, 435/1, 569/1, ≥590/2 | 0 | 0, 0, 0, alive/2 | 0, alive/2 |
| 102 | 5 /5 (100%) | ≥60/5 | 0 | 20, 40, 40, 60, 0 | 32.00±10.20 |
| 101 | 3 /5 (60%) | ≥60/5 | 0 | 60, 100, 0, -, - | 53.33±29.06 |
| 100 | 1 /5 (20%) | ≥60/5 | 0 | 0, -, -, -, - | 0 |
| <100 | 0(0%) | ≥60/5 | 0 | - | - |
| 对照组 Control group | 0(0%) | ≥60/5 | 0 | - | - |
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显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1ME 49株弓形虫速殖子和包囊 A：小鼠肠系膜淋巴结中弓形虫速殖子（箭头）,肠系膜淋巴结涂片,未染色,7 DPI;B：小鼠肺脏中弓形虫速殖子（箭头）,肺脏涂片,未染色,7 DPI;C：小鼠大脑中弓形虫包囊（箭头）,大脑组织压片,未染色,60 DPI;D：小鼠肺脏弓形虫包囊（箭头）,肺脏H.E染色,7 DPI;E：小鼠肺脏弓形虫包囊（箭头）,肺脏H.E染色,7 DPI;F：小鼠肺脏弓形虫（箭头）,肺脏弓形虫IHC 染色,7 DPI。标尺=50 μm
-->Fig. 1The tachyzoites and cysts of ME 49 T. gondii A: Tachyzoites of T. gondii in the mesenteric lymph nodes of mouse (arrows), mesenteric lymph nodes smear, unstained, 7 DPI; B: Tachyzoites of T. gondii in the lung of mouse (arrow), lung smear, unstained, 7 DPI; C: Tissue cysts of T. gondii in brain of mouse (arrows), brain squash, unstained, 60 DPI; D: Cstys of T. gondii in the lung of mouse (arrows), lung, H.E, 7 DPI; E: Cstys of T. gondii in the lung of mouse (arrow), lung, H.E, 7 DPI; F: T. gondii in the lung of mouse (arrows), lung, IHC, 7 DPI. Bar = 50 μm
-->
60—600 DPI,103速殖子浓度组小鼠在184、435和569 DPI各有1只死亡;105速殖子浓度组小鼠1只在188 DPI死亡。小鼠最长存活时间为590 DPI（表1）。感染组小鼠生存曲线见图2。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2小鼠腹腔注射梯度浓度的ME 49株弓形虫速殖子的生存曲线 A：0-60 DPI小鼠生存曲线;B：60-600 DPI小鼠生存曲线
-->Fig. 2The survival curve of mice after inoculation with gradient concentration of ME 49 strain T. gondii tachyzoites intraperitoneally A: The survival curve of mice in 0-60 DPI; B: The survival curve of mice in 60-600 DPI
-->
2.2 接种弓形虫速殖子后小鼠大脑包囊负载量
60 DPI,对处死的感染组小鼠,取大脑并研磨镜检计数,结果发现<100和100感染组阳性小鼠大脑中弓形虫包囊数为0;101感染组阳性小鼠大脑中弓形虫包囊数分别为60、100和0;102感染组阳性小鼠大脑中弓形虫包囊数量分别为20、40、40、60和0。60—600 DPI,103感染组3只死亡小鼠的大脑中未发现弓形虫包囊;105感染组1只死亡小鼠的大脑弓形虫包囊数为20。平均包囊负载量为0—53个包囊/小鼠大脑（表1）,包囊形态见图1-C,ME 49株弓形虫的大脑成囊率为53.85%（7/13）。
3 讨论
摄入弓形虫卵囊污染的蔬菜、水果和水,食入生的或未煮熟的含有弓形虫包囊的肉类,是引起人兽共患弓形虫病的主要传播途径[1,11-14]。此外,弓形虫速殖子可存在于血液、唾液、尿液、泪液、精液及乳汁中,可在输血、受精和哺乳过程感染弓形虫病[1,15]。弓形虫速殖子由于其抵抗外界环境的能力较弱,经口很容易被胃蛋白酶水解而降低感染率,但有研究提出在极少数的情况下,速殖子在到达胃之前经口腔或食道黏膜进入宿主血液或淋巴系统,另外,速殖子可以在酸性胃蛋白酶溶液中存活短时间（最多2 h）[16,17,18,19],因此多采用腹腔注射接种速殖子使小鼠感染弓形虫。研究不同弓形虫虫株的致病性可了解其基本的生物学特征,为弓形虫致病机制的研究和筛选疫苗候选虫株提供参考依据。研究发现,同为II型的ME 49和TgNmBr1虫株对Swiss小鼠的100%致死剂量分别为102—103个和大于103个卵囊,102个ME 49株弓形虫的卵囊接种小鼠后大脑约有618个包囊,103个TgNmBr1株弓形虫接种小鼠后约有526个包囊[7],而本研究中ME 49株弓形虫速殖子接种昆明小鼠后,1个速殖子即可引起昆明小鼠感染,引起小鼠100%致死剂量的速殖子浓度为106,可在大脑中查到组织包囊（0—53个）,说明ME 49株弓形虫速殖子对昆明小鼠的致死性和包囊形成率均低于卵囊灌胃接种的Swiss小鼠。与已报道的同为Type II的PRU株弓形虫速殖子接种昆明小鼠比较,其感染率及包囊形成率情况基本一致[20]。有研究结果发现ME 49株弓形虫速殖子和组织包囊对小鼠的致病性中等,但卵囊对小鼠致病性较强,这也解释了本研究中ME 49虫株速殖子在高浓度情况下才能引起小鼠死亡与DUBEY研究的100—1 000个卵囊即可引起小鼠100%死亡的不同原因[7,8]。ME 49株弓形虫的速殖子和VEG株弓形虫分别为II型和III型的标准虫株,1个VEG株弓形虫卵囊即可感染昆明小鼠,最低引起小鼠死亡的卵囊浓度为102个,且小鼠大脑包囊数量为9—857个/只[21],从研究结果可以得知,ME 49株弓形虫速殖子对昆明小鼠的致病性和包囊形成率均低于VEG株弓形虫卵囊。除此之外,判定弓形虫的毒力,还需要考虑虫株的基因型、虫株的接种方式和形态,且同一虫株的不同形态其致病性也不同,卵囊对小鼠的毒力最大,其次是组织包囊,最弱的为速殖子[22]。
根据现有资料发现,ToxoDB#9（Chinese 1）为中国的主要虫株,在斯里卡兰、南美、哥伦比亚及墨西哥都有相关报道[23,24,25]。基因型同为ToxoDB#9的不同分离株,虫株的致病性也各有差异[26]。研究报道,从河南焦作绵羊分离的同为ToxoDB#9型弓形虫TgSheepHn1虫株速殖子对小鼠的致病性（104浓度速殖子在30 DPI内小鼠的死亡率为80%）大于TgSheepHn2虫株速殖子对小鼠的致病性（104浓度速殖子在30 DPI内小鼠的死亡率为60%）,而从猫中分离到的TgCatCHn4（ToxoDB#9）和TgCatCHn2（ToxoDB#17）株弓形虫卵囊（104）接种小鼠在60 DPI内未见死亡[27,28,29,30]。ME 49株弓形虫为弱毒株,104—106个速殖子组的小鼠死亡率较高,急性期死亡时间为7—19 DPI,106个速殖子浓度可引起小鼠在7—10 DPI内全部死亡,研究发现强毒虫株104个ToxoDB#216卵囊即可引起小鼠在一周之内100%死亡[31]。101和102速殖子浓度组小鼠在60 DPI均可见大脑包囊,105个速殖子接种组死亡小鼠大脑中存在包囊,可以推断ME 49株弓形虫感染小鼠后在依然存活的小鼠大脑中可能存在组织包囊。本试验研究了典型的Type II虫株ME 49株弓形虫对我国昆明小鼠的致病性,这一结果为我国分离虫株的致病性研究提供了参考依据。
4 结论
ME 49株弓形虫速殖子对昆明小鼠的致病性中等,≥102速殖子浓度可引起小鼠100%感染,106速殖子浓度可引起小鼠100%死亡,小鼠死亡的时间为7 —19 DPI,感染小鼠生存率为62.07%（18/29）,大脑包囊成囊率为53.85%（7/13）,包囊量为0—53个包囊/小鼠大脑,最长存活时间为590 DPI。（责任编辑 林鉴非）
The authors have declared that no competing interests exist.
