0 引言
【研究意义】苹果连作障碍严重阻碍了我国苹果老果园生产及更新换代[1],尤其是25年以上的老果园苹果产区,苹果连作障碍危害越来越严重[2,3,4]。苹果连作障碍的主要表现有幼树死亡率高、果树长势参差不齐、果实品质和产量低等。果树连作障碍的原因复杂,被公认的主要因素有土壤微生物群落结构失衡、土壤中酚酸类物质的积累以及土壤营养物质缺乏等。混栽作物不仅可以提高土地的利用效率,还可以通过混栽作物的根系分泌物,改变微生物原有的生存环境,从而增加有益微生物的数量,缓解苹果连作障碍的危害。【前人研究进展】研究表明,造成苹果连作障碍的主要因素为土壤有害真菌的增加,合理的土壤微生物群落结构和较高的微生物活性不仅能够减轻连作障碍,还能够优化土壤环境[5,6,7]。王晓宝等[8]研究表明,镰孢菌属（Fusarium）是引起苹果连作障碍的主要真菌,且串珠镰孢（F. moniliforme）、尖镰孢（F. oxysporum）、层出镰孢（F. proliferatum）和腐皮镰孢（F. solani） 4种镰孢菌是其主要有害种。葱与平邑甜茶幼苗混栽可以有效降低连作危害,其原因之一即为减少了尖镰孢的基因拷贝数[9]。轮作可以有效减轻连作障碍,轮作葱可以显著减轻黄瓜连作障碍的危害,并促进其生长和提高产量[10]。小麦根系分泌物不仅有利于黄瓜幼苗的株高和地径,还可以改善土壤真菌群落结构[11]。吕毅等[12]研究表明,轮作小麦、小葱可以增加土壤细菌数量,同时还可以降低土壤中一些酚酸类物质含量;SMOLINSKA等[13]研究表明,埃塞俄比亚芥菜、黑芥子和芥菜对土壤镰孢菌有很好的抑制作用。【本研究切入点】利用轮作可以防控苹果连作障碍的原理,研究再植幼树与不同作物混栽对减轻苹果连作障碍的效果,目前尚未见报道。【拟解决的关键问题】以老龄苹果园土壤为对象,研究混栽不同作物对连作土壤环境及再植苹果幼树的影响,筛选出最有效的混栽作物以缓解苹果连作障碍,为老果园更新提供技术支撑。1 材料与方法
试验于2016年在山东农业大学园艺科学与工程学院国家苹果中心试验基地完成。1.1 试验材料
老果园土壤取自山东省泰安市满庄镇31年生老龄苹果园,于树干周围1 m,40 cm深处挖取土壤,土壤为棕壤土,土壤基本特征为pH 5.67,EC 0.46 mS·cm-1（25℃）,硝态氮含量为13.75 mg·kg-1,铵态氮含量为4.32 mg·kg-1,速效磷含量为8.32 mg·kg-1,速效钾含量为107.67 mg·kg-1,有机质含量为4.78 g·kg-1。采用盆栽试验,盆高为26.5 cm,上直径为38 cm,下直径为28 cm。供试材料为两年生烟富3/T337。1.2 试验设计
将处理好的老龄果园土壤装盆,每盆35 kg。2016年4月20日将两年生嫁接苗栽于盆中并进行定干、伤口涂抹凡士林,5月20日分别在盆中播种葱（T2）、小麦种子（T3）、芥菜（T4）,密度参照大田确定,生长期至8月25日。溴甲烷熏蒸（T1）,连作土对照（CK）,正常管理。每处理3次重复。2016年8月25日,每处理取土样装于无菌密封塑料袋中,植株整株带回实验室。1.3 指标测定
1.3.1 苹果幼树生物量指标的测定 苹果幼树株高、地径、枝长、幼树干重及鲜重采用常规方法测定,干样需将样品置于信封袋中,在108℃的烘箱中杀青30 min,然后在80℃放至样品恒重[10]。1.3.2 土壤微生物的测定 土壤中细菌、真菌、放线菌的数量均采用平板稀释涂布法测定。细菌采用酵母膏蛋白胨培养基,真菌采用马铃薯葡萄糖培养基,放线菌采用高氏一号培养基[14]。
1.3.3 实时荧光定量PCR技术 土壤中镰孢菌属的基因拷贝数使用CFX96TM Thermal Cycler（Bio-Rad）进行定量分析。首先创建ITS基因片段的标准曲线,培养扩增含有正确基因片段,提取质粒DNA,纯化并定量;并根据SYBR Premix Ex TaqTM Kit（TaKaRa）试剂盒步骤完成。试验所需引物：层出镰孢正向引物序列： GATCGGCGAGCCCTTGCGGCAAG,反向引物序列：CGCCGCGTACCAGTTGCGAGGGT;串珠镰孢正向引物序列：GACTCGCGAGTCAAATCGCG T,反向引物序列：GGGGTTTAACGGCGTGGCC;腐皮镰孢正向引物序列：CGAGTTATACAACTCAT CAAXC,反向引物序列：GGCCTGAGGGTTGTAAT G;尖镰孢正向引物序列：CATACCACTTGTTGTCT CGGC,反向引物序列：GAACGCGAATTAACGCGA GTC。通过熔解曲线和琼脂糖电泳验证PCR产物,以证实其特异性和有效性。根据基因拷贝数、循环阈值（CT）的线性方程以及环境样品的CT值,使用外延方法计算环境样品中相应基因片段的拷贝数。
1.3.4 土壤酶活性的测定 土壤脲酶和蔗糖酶的测定采用比色法,磷酸酶的测定采用磷酸苯二钠比色法,具体方法参照文献[15]。
1.3.5 土壤酚酸类物质含量 先将风干的土壤过12目筛,用电子天平准确称取土壤80 g于研钵中,加入适量石英砂混合均匀后倒入萃取池中,仪器具体操作方法参照文献[16]。
1.4 数据处理与分析
采用Excel 2003完成试验数据的处理。通过SPSS 19.0进行方差分析,采用邓肯氏新复极差法进行差异显著性检测。2 结果
2.1 与3种作物混栽对苹果幼树生物量的影响
由表1可以得出,3种作物和嫁接苹果幼树混栽均能提高其生物量,具体表现为溴甲烷熏蒸老龄苹果园土>与葱混栽>与芥菜混栽>与小麦混栽>老龄苹果园土对照。溴甲烷灭菌处理的苹果幼树的株高、地径、鲜重、干重、新稍平均长度、新梢总长度分别为对照的1.14、1.35、2.43、2.35、1.43、6.97倍,与葱混栽处理分别为对照的1.12、1.31、1.71、1.65、1.25、2.09倍,与小麦混栽处理分别为对照的1.04、1.22、1.43、1.41、1.14、1.91倍,与芥菜混栽处理分别为对照的1.10、1.29、1.48、1.59、1.12、1.88倍。由此可见,与葱进行混栽处理效果最佳。Table 1
表1
表1不同处理对两年生嫁接苗生物量的影响
Table 1Effect of different treatments on seedling biomass of two-year grafted seedling
| 处理 Treatment | 株高 Plant height (cm) | 地径 Ground diameter (mm) | 鲜样质量 Fresh weight (kg) | 干样质量 Dry weight (kg) | 新稍平均长度 Average fresh shoot length (cm) | 新梢总长度 Total fresh shoot length (cm) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| CK | 61.60±1.45c | 13.16±0.17b | 0.21±0.02c | 0.17±0.01c | 44.91±1.64d | 134.74±3.57d |
| T1 | 70.33±1.74a | 17.75±0.55a | 0.51±0.05a | 0.40±0.01a | 64.50±1.20a | 451.48±8.33a |
| T2 | 68.83±2.69ab | 17.29±0.07a | 0.36±0.02b | 0.28±0.04b | 56.54±0.69b | 282.68±5.95b |
| T3 | 67.67±1.59ab | 16.96±0.86a | 0.31±0.05bc | 0.27±0.02b | 51.57±0.83c | 257.83±5.95c |
| T4 | 63.83±0.60bc | 16.10±0.59a | 0.30±0.04bc | 0.24±0.02b | 50.60±0.67c | 252.99±5.95c |
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2.2 与3种作物混栽对苹果幼树土壤微生物环境的影响
由图1可见,嫁接苹果幼树与3种作物混栽均能增加土壤细菌的数量,减少土壤真菌的数量。溴甲烷灭菌、混栽葱、混栽小麦、混栽芥菜与对照相比,土壤中真菌分别降低了81.33%、41.33%、42.67%、40.00%;溴甲烷灭菌与对照相比,土壤细菌数量降低了50.00%,而混栽葱、小麦、芥菜与对照相比,细菌数分别增加了37.93%、31.03%、13.79%;溴甲烷灭菌与对照相比,土壤中放线菌数量降低了32.00%,而混栽葱、小麦、芥菜与对照相比,土壤放线菌分别增加了40.00%、48.00%、52.00%,土壤中细菌与真菌的比值为溴甲烷熏蒸老龄苹果园土>混栽葱>混栽小麦>混栽芥菜>老龄苹果园土对照。可见苹果幼树与这3种作物混栽能有效改变土壤微生物环境且混栽葱后效果最优。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1不同处理对土壤微生物的影响
-->Fig. 1Effect of different treatments on soil microorganisms
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2.3 与3种作物混栽对土壤酶活性的影响
由图2可见,嫁接苹果幼树与葱、小麦、芥菜混栽,均能提高土壤酶活性,脲酶活性与对照相比分别增加了31.80%、24.92%、44.59%,溴甲烷灭菌与对照相比则减少了26.56%;磷酸酶活性对照相比分别增加了35.13%、59.26%、37.67%,溴甲烷灭菌与对照相比则减少了30.07%;蔗糖酶与对照相比分别增加了23.55%、50.37%、34.31%,溴甲烷灭菌与对照相比则减少了30.57%。总体表明,溴甲烷熏蒸处理抑制了土壤酶活性,与葱进行混栽处理的效果较好。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2不同处理对土壤酶活性的影响
-->Fig. 2Effect of different treatments on soil enzyme activity
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2.4 与3种作物混栽对土壤镰孢菌基因拷贝数的影响
土壤镰孢菌属基因拷贝数采用实时荧光定量PCR技术进行定量分析。由图3可见,与对照相比,溴甲烷灭菌、混栽葱、小麦、芥菜的镰孢菌基因拷贝数均有所降低,且表现出显著性差异。各处理均能有效减少有害镰孢菌的数量;与对照相比,溴甲烷灭菌、混栽葱、小麦、芥菜的串珠镰孢分别降低了68.55%、61.01%、37.74%、57.23%;尖镰孢分别降低了48.11%、37.11%、5.11%、35.34%;腐皮镰孢分别降低了62.88%、40.97%、41.70%、29.68%;层出镰孢分别降低了68.67%、53.11%、18.30%、61.47%。溴甲烷熏蒸能有效降低土壤中镰孢菌的数量,但由于溴甲烷的危害性,可选择混栽处理代替,其中混栽葱的效果较好。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3不同处理对土壤镰孢菌基因拷贝数的影响
-->Fig. 3Effect of different treatments on the copies of Fusarium spp. fungal genes
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2.5 与3种作物混栽对土壤酚酸类物质的影响
由表2可见,混栽葱、小麦、芥菜土壤中根皮苷的含量明显降低,分别降低了81.23%、20.56%、86.11%;与老果园土壤对照相比,混栽葱能明显减少土壤中儿茶素、香豆酸、香兰素、阿魏酸、根皮苷和咖啡酸的含量,酚酸总量与对照相比减少了28.27%,与其他处理相比效果较好。由此可见,与葱进行混栽处理的效果较好。Table 2
表2
表2不同混栽处理对土壤酚酸类物质的影响
Table 2The influence of different mixed treatments on phenolic acids content of soil
| 处理 Treatment | CK | T2 | T3 | T4 |
|---|---|---|---|---|
| 儿茶素Catechins (mg·100 g-1) | 0.145±0.020a | 0.114±0.004a | 0.681±0.467a | 0.116±0.003a |
| 香豆酸Coumaric acid (mg·100 g-1) | 0.407±0.054a | 0.370±0.079a | 1.532±0.154a | 2.628±2.270a |
| 香草酸Vanillic acid (mg·100 g-1) | 1.366±0.302b | 1.596±0.100b | 3.296±0.159a | 0.317±0.067c |
| 香兰素Vanillin (mg·100 g-1) | 0.582±0.256b | 0.433±0.007b | 1.477±0.031a | 0.379±0.036b |
| 阿魏酸Ferulic acid (mg·100 g-1) | 0.563±0.041a | 0.336±0.010c | 0.462±0.021b | 0.337±0.004c |
| 根皮苷Phloridzin (mg·100 g-1) | 1.506±0.058a | 0.283±0.020a | 1.196±0.928a | 0.209±0.007a |
| 咖啡酸Caffeic acid (mg·100 g-1) | 1.316±0.243a | 0.741±0.072b | 0.783±0.1568b | 0.643±0.0554b |
| 肉桂酸Cinnamic acid (mg·100 g-1) | 0.022±0.006c | 0.362±0.008a | 0.093±0.023bc | 0.205±0.066b |
| 酚酸总量Total phenolic acids (mg·100g-1) | 5.907±0.006b | 4.237±0.006d | 9.521±0.006a | 4.834±0.006c |
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3 讨论
在中国主要的苹果栽植区域,传统老果园苹果连作障碍普遍发生。随着苹果树生命周期的缩短和更新品种加快,轮作耗时太长,满足不了苹果产业的需求,这使苹果连作障碍的问题越来越显著[16]。苹果连作障碍的原因复杂多样,主要包括土壤营养物质缺乏,微生物群落结构的改变以及酚酸类化感物质积累[16,17]。前人研究发现,轮作、间作和套作不仅可以提高土地的利用效率,还能够防治病、虫、草对单一栽培作物产生的危害,从而提高作物的单位面积产量[15]。本试验采用葱、小麦、芥菜与果树混栽的方式,不仅能够提高土地利用率,还可促进果树生长。土壤酶直接参与土壤中养分的转化,能量代谢和营养物质的释放和固定过程,与土壤肥力状况密切相关,土壤酶活性的高低可以反映土壤的质量[18,19,20]。蔗糖酶活性的强度反映了底物的成熟程度和生育水平,并且在营养生长中起着重要作用;脲酶是对尿素转化起关键作用的酶,其酶促反应产物是可供植物利用的氮源,活性可以用来显示土壤的氮供应能力[21];磷酸酶是植物根系和微生物的分泌物,它可以促进有机磷化合物或无机磷酸盐转化为植物可利用的无机磷,是衡量土壤肥力的重要指标[22]。本试验表明,与老果园土壤相比,与葱、小麦和芥菜混栽的处理均能提高土壤相关酶活性,并且与葱混栽处理时土壤的酶活性显著增加。
果树连作后土壤微生物结构发生明显变化,主要表现为有益微生物减少、致病微生物增加,打破了原有的根际微生态平衡[23,24]。土壤中细菌、真菌和放线菌的组成和比例在一定程度上反映了土壤肥力的水平。通常,细菌含量越高,土壤肥料和水分条件越好[25]。而病原真菌的积累能显著降低农作物产量,增加病虫害[26]。土壤微生物在植物残体降解,营养转化周期等方面起着重要作用[27,28]。有研究表明,苹果连作障碍的发生主要是生物因素引起的,其中有害真菌的积累是主要原因,如镰孢菌、腐霉和丝核菌[29,30,31,32]。本试验采用平板稀释涂布法和实时荧光定量PCR技术研究老果园土壤中的微生物数量和镰孢菌属的基因拷贝数。结果表明,苹果幼树与3种作物混栽均能增加土壤的细菌数量,减少有害真菌的数量。其中与葱混栽效果最为显著,说明其可以优化微生物群落体系。
土壤中酚酸类物质的积累是导致苹果连作障碍的一个重要发生原因,其主要来源于植物和土壤生物的分泌,并具有很强的生物活性[33]。王青青等[34]研究表明,适量的根皮苷会降低与TCA循环相关酶的活性,导致苹果幼苗呼吸速率下降。本试验中老果园土壤经过混栽葱后,土壤中的根皮苷含量显著下降,这可能与混栽后土壤微生物群落结构优化有关,在微生物的作用下,一些酚酸类物质可以转化为其他无害物质,减少了其对苹果幼树的毒害作用。
4 结论
葱、小麦、芥菜3种作物与再植幼树混栽均能提高苹果幼树生物量,优化微生物群落结构,提高连作土壤主要酶活性,降低土壤中根皮苷含量,从而减轻苹果连作障碍。且苹果幼树与葱混栽效果明显好于苹果幼树与小麦、芥菜混栽。（责任编辑 岳梅）
The authors have declared that no competing interests exist.
