0 引言
【研究意义】牦牛生长在高海拔、无污染的高寒地区,食用天然的牧草,饮用天然的矿泉水,其肉质细嫩、味道鲜美,含有丰富的蛋白质、氨基酸,以及胡萝卜素、钙、磷等微量元素,具有极高的营养价值[1]。但一些不法商贩常受经济利益驱动,以其他牛肉冒充牦牛肉,欺骗消费者,影响牦牛肉的品牌形象,因此开发一套稳定、科学的鉴别技术对其进行监管和保护具有重要意义。【前人研究进展】稳定同位素指纹是用于农产品产地、饲喂信息鉴别的有效技术之一。目前此项技术已用于葡萄酒[2-3]、蜂蜜[4]、奶酪[5]、牛奶[6-7]、咖啡[8-9]、谷物（如小麦、大米等）[10-13]、橄榄油[14-15]、牛肉[16-22]、羊肉[23-25]、鸡肉[26]和猪肉[27]等各种农产品产地溯源与鉴别研究。【本研究切入点】国内专家研究发现不同产地来源的牦牛肉稳定碳、氮、氢同位素组成有显著差异,利用稳定同位素可以区分不同产地的牦牛肉[28],但关于牦牛肉中稳定同位素指纹与牧草、饮水、地形的具体变化规律还不很明确。【拟解决的关键问题】本研究重点分析牦牛肉中稳定碳、氮、氢同位素指纹特征和它们受牧草、饮水的影响,以及随地域海拔的变化情况,揭示牦牛肉中稳定同位素指纹特征及变化规律。1 材料与方法
1.1 试验材料
从青海省海北、海南、玉树3个点采集了32头牦牛的肌肉样品,并采集了13个牧草样品和12个饮水样品,采样具体信息见表1。Table 1
表1
表1样品及来源地信息
Table 1The information of samples and sampling region
| 采样地区 Region | 样品 Sample | 采样量 Samples number | 经度 Longitude | 纬度 Latitude | 平均海拔Altitude (m) |
|---|---|---|---|---|---|
| 海北 Haibei | 肌肉 Yak muscle | 12 | 100°46′E | 37°38′N | 3155 |
| 牧草 Pasture | 6 | ||||
| 水 Water | 6 | ||||
| 海南 Hainan | 肌肉 Yak muscle | 10 | 100°37′E | 36°18′N | 3250 |
| 牧草 Pasture | 3 | ||||
| 水 Water | 3 | ||||
| 玉树 Yushu | 肌肉 Yak muscle | 10 | 97°18′E | 33°25′N | 4333 |
| 牧草 Pasture | 4 | ||||
| 水 Water | 3 |
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1.2 试验方法
1.2.1 采样方法肌肉：屠宰后在每头牛的后臀部取500 g肉,装入自封袋中,-20℃冰箱中冷冻保藏。
牧草：从放牧牦牛的牧场直接取样,装入自封袋保存。
饮水：在放牧牦牛附近的河边采取河水样品,装入塑料瓶中,倒置、低温保存。
1.2.2 样品前处理方法
肌肉：解冻、取50 g切成小块,冷冻干燥后,用球磨机磨碎;磨碎后的牛肉粉用索氏提取器进行脱脂,得到脱脂牛肉和粗脂肪样品[18]。
牧草：70℃烘干、粉碎、过80目筛[17, 29]。
饮水：用孔径为0.45 μm的滤膜过滤后备用。
1.2.3 稳定碳、氮同位素比率检测方法
称取2—3 mg样品,放入锡箔杯中,通过自动进样器进入元素分析仪（vario PYRO cube,Elementar,Germany）,燃烧与还原转化为纯净的CO2和N2,CO2再经过稀释器稀释,最后进入稳定同位素质谱仪（IsoPrime100,IsoPrime,UK）进行检测。具体的工作参数如下：
元素分析仪条件：燃烧炉温度为1 020℃,还原炉温度为600℃,载气He 流量为230 mL·min-1。
质谱仪条件：分析过程中,每12个样品穿插一个实验室标样IAEA 600（δ13CPDB=(-27.771±0.043)‰,δ15Nair=(1.0±0.2)‰）对测定结果进行校正。
稳定同位素比率计算如下：
δ（‰）=（R样品/R标准-1）×1000
式中,R为重同位素与轻同位素丰度比,即13C/12C 和15N/14N,δ13C的相对标准为V-PDB,δ15N的相对标准是空气中氮气。测定时,δ13C和δ15N的连续测定精度<0.20‰。
1.2.4 稳定氢同位素比率检测方法
采用高温裂解-同位素比率质谱法（HT-IRMS）进行测定。对于固体样品,称取1 mg样品装入银杯中（高6 mm,直径4 mm）,折成小球,每个样品有3个重复样,并按顺序放入96孔酶联免疫板中,松散地盖上盖子,在实验室的室温环境下平衡72 h;通过固体自动进样器进入元素分析仪（vario PYRO cube,Elementar,Germany）,1 450℃高温裂解生成CO和H2,经过稀释器稀释,最后进入质谱仪（IsoPrime 100,Isoprime,UK）进行检测。对于水样品,利用液体进样器的针头吸取0.4 μL 样品直接进入元素分析仪,1 450°C高温裂解成H2,进入质谱仪进行检测。具体的工作参数如下：
元素分析仪条件：He载气流速为120 mL·min-1。
质谱仪条件：分析过程中,每12个样品穿插一个国际标样IAEACH-7（δ2HV-SMOW=(-100.3±2)‰）对测定结果进行校正。
稳定氢同位素比率计算如下：
&=(R样品/R标准-1)×1000
式中,R为重同位素与轻同位素丰度比,即2H/1H,δ2H的相对标准为V-SMOW。测定时,δ2H的连续测定精度<1.00‰。
1.3 数据处理
用SPSS 18.0软件对数据进行方差分析、Duncan多重比较分析等。2 结果
2.1 牦牛肉中稳定同位素组成特征
脱脂肌肉、粗脂肪中的δ13C平均值分别为（-23.99± 0.25）‰和（-28.77±0.50）‰,说明牦牛采食的牧草主要是C3植物。脱脂肌肉中的δ13C值显著高于粗脂肪,平均高5‰。脱脂肌肉中的δ15N和δ2H平均值分别为（4.04±0.91）‰和（-107.99±11.08）‰（表2）。可见,牦牛肉中稳定同位素指纹具有独特的特征。Table 2
表2
表2牦牛肉中δ13C、δ15N和δ2H值
Table 2The δ13C, δ15N and δ2H values in yak muscle
| 同位素 Isotopes | 牦牛肉 Yak muscle | 平均值±标准偏差 Average ± SD (‰) | 最小值 Minimum values (‰) | 最大值 Maximal Values (‰) | 变异系数 CV (%) |
|---|---|---|---|---|---|
| δ13C | 脱脂肌肉 De-fatted muscle | -23.99±0.25 | -24.33 | -23.47 | 1.03 |
| 粗脂肪 Crude fat | -28.77±0.50 | -30.22 | -27.83 | 1.73 | |
| δ15N | 脱脂肌肉 De-fatted muscle | 4.04±0.91 | 1.80 | 5.94 | 22.57 |
| δ2H | 脱脂肌肉 De-fatted muscle | -107.99±11.08 | -128.85 | -94.40 | 10.26 |
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2.2 牦牛肉中稳定同位素组成与地域海拔的关系
玉树牦牛肉中的δ13C值显著高于海北和海南,但δ15N值在3个地域之间无显著差异。海北、海南、玉树3个地域的牦牛肉中δ2H值均有极显著差异,由高到低的顺序依次为海南>海北>玉树,玉树牦牛肉中的δ2H值比海北、海南约低20‰左右。玉树的平均海拔（4 333 m）比海北（3 155 m）、海南（3 250 m）高1 000 m,这说明牦牛组织中的δ13C值有随海拔的增加而增大的趋势,而δ2H值有随海拔的增加而减小的趋势（表3）。Table 3
表3
表3不同地域来源牦牛组织中δ13C、δ15N和δ2H值
Table 3The δ13C, δ15N and δ2H values in yak tissues from different regions (‰)
| 同位素 Isotopes | 牦牛组织 Yak tissues | 地域 Region | ||
|---|---|---|---|---|
| 海北 Haibei | 海南 Hainan | 玉树 Yushu | ||
| δ13C | 脱脂肌肉 De-fatted muscle | -24.01±0.26b | -24.17±0.13b | -23.77±0.14a |
| 粗脂肪 Crude fat | -28.95±0.57b | -28.93±0.34b | -28.39±0.33a | |
| δ15N | 脱脂肌肉 De-fatted muscle | 4.12±1.30a | 3.81±0.48a | 4.19±0.69a |
| δ2H | 脱脂肌肉 De-fatted muscle | -102.24±2.06b | -99.32±2.72a | -123.56±3.70c |
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2.3 牦牛肉稳定同位素组成与牧草和水的关系
海北、海南、玉树3个地区牧草中δ13C平均值分别为（-26.99±0.36）‰、（-27.16±0.17）‰、（-26.77±0.48）‰（表4）,说明均为C3牧草。3个地区牧草中δ13C值、δ15N值均无显著差异（表4）,其平均值分别为（-26.96±0.37）‰和（-0.50±1.68）‰。3个地区牦牛脱脂肌肉中的δ13C、δ15N平均值分别为-23.99‰和4.04‰（表2）,即牦牛脱脂肌肉相对牧草δ13C平均富集了2.87‰,相对牧草δ15N平均富集了4.54‰。3个地区牧草和水中的δ2H值均有极显著差异,牧草中δ2H值由高到低的顺序依次为海南>海北>玉树,水中δ2H值由高到低的顺序依次为海北>海南>玉树（表4）。牦牛肌肉中δ2H值由高到低的顺序依次为海南>海北>玉树（表3）,与牧草中δ2H值的地域变化顺序一致。说明牦牛肉中的δ2H值与牧草、饮水密切相关,均有随海拔升高而降低的趋势,且牧草对牦牛组织中氢同位素组成的影响可能大于水的影响,但这还需要进一步研究证实。Table 4
表4
表4不同地域来源牧草和饮水中δ13C、δ15N和δ2H值
Table 4The δ13C, δ15N and δ2H values in diets from different regions (‰)
| 地域 Region | 牧草 Pasture | 饮水 Drinking water | ||
|---|---|---|---|---|
| δ13C | δ15N | δ2H | δ2H | |
| 海北 Haibei | -26.99±0.36a | -0.76±1.42a | -112.60±7.11b | -46.93±5.13a |
| 海南 Hainan | -27.16±0.17a | -1.01±2.59a | -103.36±4.48a | -59.60±3.90b |
| 玉树 Yushu | -26.77±0.48a | 0.28±1.52a | -129.11±3.15c | -91.30±1.08c |
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3 讨论
牦牛生长的青藏高原地区牧草大多为C3植物,致使食用天然牧草的牦牛肉中δ13C值均在-23‰以下,显著低于我国普通牛肉中的δ13C值[20]。WANG等[30]从海拔为2 700—5 400 m青藏高原采集的牧草样品分析结果也表明,61个植物样品中仅有4个是C4植物,其余均为C3植物,且C3植物δ13C值的变幅为-22.2‰—-28.3‰,平均值为（-25.7±1.4）‰（n=56）。本研究从青海海北、海南、玉树采集的13个牧草饲料均为C3植物,其δ13C平均值为（-26.96±0.37）‰。玉树牦牛组织中δ13C值显著高于海北和海南,说明牦牛组织中的δ13C值有随海拔的增加而增加的趋势。前人在对植物δ13C值的海拔效应研究中也发现此变化规律[31-33]。与前人研究结果比较,食用天然牧草的牦牛肉中δ13C值与国外纯牧草喂养的牛肉中δ13C值比较一致,均低于-23.00‰,而显著低于中国主产区牛肉的δ13C值;牦牛肉中δ15N值显著低于国外牧草喂养的牛肉,而与中国主产区牛肉的δ15N值接近[17,20];牦牛肉中δ2H值显著低于中国主产区牛肉的δ2H,尤其高海拔地区牦牛肉中δ2H值很低,基本在-120.00‰以下[20]。牦牛组织中δ15N值平均在4‰左右,比前人研究报道的牦牛骨骼化石中δ15N值（3.2‰,n=5）略高[34]。牦牛组织中δ15N值与我国农区普通牛肉中δ15N比较接近,但低于牧区普通牛肉和国外牧草喂养的牛肉[17, 20]。海北、海南、玉树3个地域的牦牛组织中δ15N值无显著差异。动植物组织中δ15N值受地域土壤类型、施肥、牧草等影响因素,同一地域的变幅比较大,常导致不同地域之间的差异不显著。
本研究牦牛组织中δ2H值有随海拔的升高而显著降低的趋势,此变化与牧草、饮水的变化趋势一致。前人在动物组织δ2H值与地域海拔关系方面也有相关研究,但研究结论存在一定异议。HOBSON等[35]对厄瓜多尔安第斯山脉的蜂雀进行研究发现,在高度为400 m以上的区域,蜂雀羽毛中的δ2H值随着高度的增加而降低（r=0.53,P<0.001）;在高度为1 300— 3 120 m的范围内,鸟羽毛中的δ2H值与高度也呈显著负相关（r=0.34,P<0.001）。他们认为,羽毛中的δ2H值是研究鸟迁徙高度或群居高度比较好的指标。但KELLY等[36]研究却发现威尔逊鸣鸟羽毛中δ2H与高度之间的相关性不显著。我国四大肉牛产区的普通牛肉中δ2H与海拔的关系也不明显[37]。动物组织中δ2H值海拔效应不显著的研究结果可能是由于采样地区之间的海拔变化不明显导致。本研究确证了动物肌肉中δ2H值的海拔效应,即随着海拔的升高而降低。牦牛肉中δ2H值主要与牧草和饮水密切相关,本研究中牦牛肉δ2H值与牧草δ2H值的地域变化顺序一致,推测牧草对牦牛肉中氢同位素组成的影响可能大于水的影响,此推测与前人的研究结果有一致性。O’BRIEN等[38]研究发现饮水对人毛发中δ2H值的贡献率约为36%;SHARP等[39]研究发现饮水对人毛发中δ2H值的贡献率约为31%;HOBSON等[40]研究发现饮水对鹌鹑羽毛中δ2H值的贡献率约为26%—32%,对鹌鹑趾甲中δ2H 值得贡献率约为27%,其余70%的贡献率是受饮食的影响。牧草和饮水对牦牛组织中δ2H值的影响贡献率还有待进一步研究。
4 结论
食用天然牧草的牦牛肌肉中δ13C一般低于-23.00‰,显著低于中国主产区牛肉的δ13C值;牦牛肉中δ15N值与中国主产区牛肉的δ15N值接近,平均值为4.04‰;牦牛肉中δ2H值显著低于中国主产区牛肉的δ2H,尤其高海拔地区牦牛肉中δ2H值很低,基本在-120.00‰以下。牦牛组织中δ13C、δ15N值主要受其食用的牧草影响,δ2H值与其饮水和牧草密切相关;牦牛组织中δ13C值有随海拔的增加而增加的趋势,而δ2H值有随海拔的升高而降低的趋势。牦牛肉中稳定同位素指纹具有独特的特征。The authors have declared that no competing interests exist.
