蛋白质组学方法评估转基因抗虫玉米非预期效应

删除或更新信息，请邮件至freekaoyan#163.com(#换成@)

本站小编 Free考研考试/2021-12-26

郝文媛, 李飞武, 闫伟, 李葱葱, 郝东云, 郭长虹. 蛋白质组学方法评估转基因抗虫玉米非预期效应[J]. , 2017, 50(19): 3652-3664 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2017.19.003
HAO WenYuan, LI FeiWu, YAN Wei, LI CongCong, HAO DongYun, GUO ChangHong. Assessment of the Unintended Effects of Four Genetically Modified Maize Varieties by Proteomic Approach[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2017, 50(19): 3652-3664 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2017.19.003

0 引言

【研究意义】植物转基因技术的目标是将有利于植物自身或满足人类需求的特定外源基因整合进入受体植物基因组中,使其获得外源基因所表现的特定性状并能够稳定遗传。这些性状就是转基因植物的目标性状,也称为预期效应。由于外源基因整合位点不确定,加之外源基因产物本身也可能使受体植物的能量代谢和物质代谢发生变化,从而影响其固有的生理代谢过程,乃至改变受体植物的固有性状。这些性状改变均是转基因育种设计过程中无法控制和预期的,这些无法控制和预期的性状改变均称为非预期效应^[1-2]。可见,转基因植物实际上是外源基因发挥预期的目标效应和受体植物基因组因外源基因的导入,而产生的非预期效应的综合体。转基因植物是否会产生非预期效应,以及对非预期效应的安全性评估一直是科学家和公众对转基因植物广泛关注的话题。长期以来,各国相关部门都是基于1993年欧洲经济发展与合作组织OECD（Organization for Economic Co-operation and Development）提出的“实质等同性原则”对转基因植物进行安全性评价的,评价的核心是比较转基因植物与其非转基因受体植物间在农艺性状、环境适应性、营养及物质组成变化等的差异,以确认或排除转基因植物是否存在非预期效应。传统的检测方法不仅难以全面涵盖转基因植物可能出现的非预期效应,且检测指标有限、检测费用高、费时、费力。因此,建立全面、快速、准确、灵敏的检测技术是分析鉴定转基因生物安全性的关键所在^[2-3]。【前人研究进展】近年来,蛋白质组分析技术迅速发展,双向电泳技术、iTRAQ技术等已成为当今蛋白质组学研究的核心技术^[4]。研究人员已经在转基因玉米、水稻、大豆等材料中,对蛋白质组水平上的非预期效应的进行了评估,取得了较好的效果^[5-11]。转基因玉米商业化生产以来,已占全球转基因作物种植总面积的30%,居转基因作物的第二位,涉及的农艺性状主要为玉米螟抗性,转入的基因为种类繁多的来自苏云芽孢杆菌（Bacillus thuringeinsis,Bt）的昆虫内毒素基因^[12-15]（本文统称“Bt基因”）。COLL等^[5]利用2D凝胶电泳、质谱技术分析比较,发现在同一地块种植的2种转Bt基因玉米MON810与其对照株系的籽粒蛋白质组几乎一致,只有几个蛋白质点有1—1.8倍的变化,结果表明,转基因玉米MON810与其对照非转基因材料具有实质等同性;ALBO等^[6]也发现MON810与其非转基因对照的籽粒蛋白质组之间非预期差异基本等同;ZOLLA等^[7]发现同一田间生长的MON810及其对照同一品系的不同世代材料的蛋白质组存在显著差异,且在蛋白质组学水平上,环境因素对非预期变异效应的贡献比转基因插入更大。上述研究结果表明,蛋白质组学技术已逐渐成为检测转基因作物非预期效应的有效方法^[16]。【本研究切入点】不同转Bt基因的抗虫玉米材料不但在目标基因上明显不同,而且由于受体材料差异和回交转育过程的不同,造成了最终的抗虫转基因玉米材料间存在着巨大的差异。这些遗传背景上的差异是否会产生非预期效应仍研究甚少,目前的研究还主要集中在Bt基因的抗虫目标预期效应上^[17-22]。转基因抗虫玉米SK12-5、IE034、Bt799z和 Bt799zd是中国自主研发的具有潜在产业化前景的转基因新材料,围绕上述新材料已开展了大量育种研发工作及所获相应育种材料的环境安全^[23-25]和食用安全评价研究,但是,对这些材料的非预期效应研究未见报道。【拟解决的关键问题】利用双向电泳技术对上述转基因抗虫玉米的4种不同遗传背景材料的转基因材料进行了比较分析,一方面在蛋白质组水平比较不同转基因材料的差异;另一方面从组学的水平初步评估了实验材料蛋白水平上是否发生了影响转基因材料安全性的非预期效应,为非预期效应评价提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料：编号1#为具有转cry1Ab/cry2Aj并有ZD958遗传背景的杂交种SK12-5zd,由浙江大学提供。编号2#为转cry1Ie并有Z58遗传背景的自交系IE034z,由中国农业科学院提供。编号3#为转mcry1Ac并有Z58遗传背景的自交系Bt799z,编号4#为转mcry1Ac并有ZD958遗传背景的杂交种Bt799zd,均由中国农业大学提供。选取非转基因的自交系Z58和杂交种ZD958作为对照材料,编号分别为5#和6#。编号2#和3#的转基因自交系是目标遗传转化体经2代自交后,再与Z58材料进行6代回交转育后获得了具有纯合、稳定遗传背景的转基因自交系。上述转基因材料均已采用国家发布的转基因检测标准进行了外源基因分子特征鉴定,证明均为独立转化事件,并已进入环境释放以上的转基因安全评价试验阶段。
2014年6月,将试验材料种植在吉林省公主岭市的吉林省农业科学院的人工温室中,幼苗长至5叶1心期进行取样,每种试验材料取长势基本一致的6个单株的最上部完全展开叶片,混合作为一个样本。液氮冷冻后,迅速放入干冰中运输至实验室,-80℃保存。

1.2 玉米叶片总蛋白提取

将叶片去主脉后剪成1 cm的小段,称取0.5 g叶片加入50 mg PVPP进行充分研磨;加入7.5 mL经-20℃预冷的蛋白提取缓冲液Ⅰ,冰浴研磨5 min,转入预冷的10 mL离心管中,-20℃放置1 h;4℃,13 000 r/min离心45 min,弃上清;加入7.5 mL经-20℃预冷的蛋白质提取液Ⅱ,悬浮振荡,-20℃放置1 h;4℃,13 000 r/min离心45 min,弃上清,重复2次;加入7.5 mL 80%预冷的丙酮,充分悬浮后,离心去上清;沉淀真空干燥并称重。每种材料各重复3次,获得的蛋白用Bradford法^[26]测定浓度后准备进行蛋白质双向电泳分析。

1.3 蛋白质等点聚焦

采用长度24 cm,pH 3—10的线性干胶条（Biorad,美国）,取蛋白提取液与水化缓冲液（8 mol·L^-1Urea、2 mol·L^-1硫脲、4% CHAPS、0.002%溴酚蓝,用前加入65 mmol·L^-1DTT和0.2% IPG Buffer）混合至总体积450 μL（含蛋白质约为1 200 μg）,采用被动水化的方法处理18 h。将水化后的胶条转移到等电聚焦槽上（胶条酸性端置聚焦盘的“+”端,碱性端置聚焦盘“-”端）。每根胶条加入3 mL矿物油,将润湿的滤纸1/3处放在胶条的两端夹上电极夹,扣紧聚焦盘,等点聚焦程序和参数设置参照Biorad产品说明书。等点聚焦结束后,将胶条置于平衡缓冲液（6 mol·L^-1Urea、75 mmol·L^-1Tris-HCl（pH 8.8）、2% SDS、25%甘油、0.002%溴酚蓝）振荡平衡2次,每次15 min。第一次平衡在缓冲液中加入1% DDT;第二次平衡在缓冲液加入2.5%碘乙酰胺（IAM）。平衡完毕后取出胶条轻轻用平衡缓冲液润洗,然后去除多余的平衡缓冲液,准备SDS-PAGE电泳。

1.4 SDS-PAGE

将平衡好的胶条置于第二向凝胶上方,排除气泡使二者紧密接触,用1%琼脂糖凝胶封固胶条,接通电源。第一阶段1 W/gel运行1 h;第二阶段13 W/gel运行直至溴酚蓝到达凝胶底端。双向电泳结束后,SDS-PAGE凝胶置于固定液（10%冰醋酸、40%甲醇、50%超纯水）中固定3 h;凝胶固定后,超纯水冲洗3次,每次15 min;加入考马斯亮蓝染色液染色（0.12% G-250、10%硫酸铵、10%磷酸、20%甲醇）振荡过夜;超纯水脱色至背景满意为止。

1.5 质谱鉴定与数据库分析

Image Scanner扫描仪扫描脱色后的凝胶,用Biorad PDQuest 8.0软件分析不同玉米叶片材料的凝胶图谱,采用YANG等^[4]的方法,使用蛋白相对表达体积（% Vol）来表述每一个匹配蛋白质点的表达丰度。差异蛋白质的表达丰度分析分别以Z58和ZD958材料的凝胶作为参考胶,只有蛋白质点在至少2个重复内被发现才被认为是真实的蛋白质点。定义平均相对表达丰度上调（出现）或下调（消失）差异大于2倍（ratio>2）,并且在统计学T检验上P<0.05的蛋白质为差异蛋白质点。差异蛋白质点使用液质联用质谱仪LC-Q-TOF-MS 6520（Agilent Technologies,USA）进行分析。使用NCBI玉米数据库（NCBI,Taxonomy：Zea mays,Entry：212235,2015/01/20）对蛋白质进行检索。蛋白检索结果的显著性判别标准：一般认为PMF（Peptide Mass Fingerprinting,肽指纹图谱）在MS/MS检索中离子分数≥88分说明该蛋白的鉴定结果有效,其他一些辅助标准包括至少10%的序列覆盖率以及需要有3个肽段的匹配^[27]。

1.6 GO和KEGG分析

采用BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）方法对质谱鉴定出的特异性蛋白（E value≤10^-5）与NCBI non-redundant（Nr）蛋白质数据库进行比较,确定相应的蛋白质并获得对应的基因信息,用DAVID方法对这些表达有差异的基因进行基因功能注释（gene ontology,GO）分析^[28],对差异蛋白功能及代谢途径进行KEGG通路分析^[29]。

2 结果

2.1 差异表达蛋白的分离及鉴定

为了比较不同转基因抗虫玉米蛋白质组差异,对供试材料的叶片总蛋白进行了双向电泳分析。结果显示,各受试材料均可检测到超过1 200个清晰蛋白点（图1）。

显示原图|下载原图ZIP|生成PPT
图1转基因玉米叶片及其对照的蛋白质双向电泳
1#：SK12-5zd;2#：IE034z;3#：Bt799z;4#：Bt799zd;5#：Z58;6#：ZD958;#3802：cry1Ab蛋白点cry1Ab protein spot;#4719：cry1Ie蛋白点cry1Ie protein spot;#3707：mcry1Ac蛋白点mcry1Ac protein spot;#3807：mcry1Ac蛋白点mcry1Ac protein spot
-->Fig. 12-D electrophoresis of leaf proteins of GM maize varieties versus their CKs
-->

将电泳胶图扫描后使用Biorad PDQuest8.0软件对每个转基因材料及其对照（1#和6#、4#和6#、2#和5#、3#和5#）进行比较,对电泳凝胶上相对表达体积超过2倍的差异蛋白质点进行质谱仪分析,成功鉴定玉米基因组蛋白61个（图2、表1）。进一步分析特异蛋白点（只在转基因与对照的一个材料中出现）和差异蛋白点发现,这些蛋白点中核酮糖二磷酸羧化酶相关蛋白点15个,ATP合酶类蛋白点4个,放氧增强蛋白点13个,丙酮酸磷酸双激酶相关蛋白点3个,GADPH酶相关蛋白点2个,类萌发素蛋白相关蛋白点4个,草铵膦乙酰转移酶相关蛋白点2个（3#和4#）,其他蛋白点6个,未知功能蛋白点10个。这些蛋白所涉及的生化反应过程主要集中在光合作用、碳固定和能量代谢等方面。根据不同蛋白的功能以及质谱检测结果,对各类蛋白在不同转基因材料中变化的趋势进行了汇总分析（表2）。结果显示,在4种转基因玉米材料中发现被认为参与植物对逆境胁迫响应的类萌发素类蛋白均有显著的表达升高;而只有质体蓝素钠一类蛋白在4#材料中发生了表达显著降低;涉及光合作用及碳固定的相关酶类,如核酮糖二磷酸羧化酶、ATP合成酶、丙酮酸磷酸双激酶等均发生了表达显著上调。在同为ZD958背景的1#和4#材料中,包括类萌发素蛋白、核酮糖二磷酸羧化酶、PSⅡ的放氧增强蛋白的表达均发生了显著的升高;而在同为Z58背景的2#和3#材料中,包括ATP合成酶、放氧增强蛋白、类萌发素蛋白、肽基脯氨酰顺反式异构酶等蛋白的表达发生了显著升高。可以看出遗传背景相同的转基因玉米材料（1#和4#、2#和3#）在转入不同抗虫Bt基因后,其所引起的蛋白水平上的变化也存在着一定的一致性。而不同遗传背景的转基因材料（3#和4#）转入相同抗虫Bt基因后,其蛋白水平上的表达变化则差异较大。

显示原图|下载原图ZIP|生成PPT
图2转基因玉米及其对照叶片蛋白质的双向电泳对比分析
-->Fig. 22-DE profile of pair wise leaf protein comparison between the GM maize varieties and their CKs
-->

Table 1
表1
表1转基因玉米叶片与对照的差异表达蛋白
Table 1Identification of differential leaf proteins between GM maize varieties and their CKs

序号 Code	蛋白点编号 Spot number	登录号NCBI Accession number	蛋白特性描述 Protein annotation
SK12-5zd和ZD958对比后特异表达蛋白 Specific expression protein after SK12-5zd and ZD958 comparison
1	3709	gi\|162458161	磷酸核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶活化酶,叶绿体前体[玉米] Ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase activase, chloroplastic precursor [Zea mays]
2	4405	gi\|219819651	丙酮酸磷酸双激酶[玉米] Pyruvate orthophosphate dikinase [Zea mays]
3	#4702	gi\|540067394	ATP合酶β亚基（叶绿体CF1）[玉米亚种] ATP synthase CF1 beta subunit (chloroplast) [Zea mays subsp. mays]
4	0301	gi\|413946209	ATP合酶β亚基（叶绿体CF1）[玉米亚种] Putative ATP synthase CF1 beta subunit [Zea mays subsp. mays]
SK12-5zd和ZD958对比后上调表达2倍以上蛋白 Up-regulated expression of more than 2 times the protein after SK12-5zd and ZD958 comparison
5	2503	gi\|413943281	PSⅡ的放氧增强蛋白1[玉米] Oxygen-evolving enhancer protein 1 [Zea mays]
6	5301	gi\|37623879	类萌发素蛋白[玉米] Germin-like protein [Zea mays]
7	6101	gi\|195636562	核酮糖二磷酸羧化酶小链C[玉米] Ribulose bisphosphate carboxylase small chain C [Zea mays]
8	8002	gi\|162463469	核酮糖二磷酸羧化酶小链,叶绿体前体[玉米] Ribulose bisphosphate carboxylase small chain, chloroplastic precursor [Zea mays]
9	0201	gi\|62738112	镁PEP结合丙酮酸磷酸双激酶A链[玉米] A chain, pyruvate phosphate dikinase with bound Mg-PEP from maize [Zea mays]
10	1702	gi\|219819651	丙酮酸磷酸双激酶[玉米] Pyruvate orthophosphate dikinase [Zea mays]
11	2301	gi\|22240	部分GADPH酶（383 AA） GADPH (383 AA), partial [Zea mays]
12	6302	gi\|22240	部分GADPH酶（383 AA） GADPH (383 AA), partial [Zea mays]
13	7502	gi\|540067310	核酮糖二磷酸羧化酶大亚基（叶绿体）[玉米亚种] Ribulose bisphosphate carboxylase large subunit (chloroplast) [Zea mays subsp. mays]
SK12-5zd和ZD958对比后下调表达2倍以上蛋白 Down-regulated expression of more than 2 times the protein after SK12-5zd and ZD958 comparison
14	2205	gi\|413943281	PSⅡ的放氧增强蛋白1[玉米] Oxygen-evolving enhancer protein 1 [Zea mays]
15	2803	gi\|413943281	PSⅡ的放氧增强蛋白1[玉米] Oxygen-evolving enhancer protein 1 [Zea mays]
16	6103	gi\|414592172	TPA：蛋白ZEAMMB73_321092 [玉米] TPA: Hypothetical protein ZEAMMB73_321092 [Zea mays]
17	7001	gi\|162463469	核酮糖二磷酸羧化酶小链,叶绿体前体[玉米] Ribulose bisphosphate carboxylase small chain, chloroplastic precursor [Zea mays]
Bt799zd和ZD958对比后特异表达蛋白 Specific expression protein after Bt799zd and ZD958 comparison
18	7305	gi\|40457466	草铵膦乙酰转移酶[合成物质] Phosphinothricin acetyl transferase [synthetic construct]
19	1702	gi\|414872233	TPA：蛋白ZEAMMB73_352617[玉米] TPA: Hypothetical protein ZEAMMB73_352617 [Zea mays]
Bt799zd和ZD958对比后上调表达2倍以上蛋白 Up-regulated expression of more than 2 times the protein after Bt799zd and ZD958 comparison
20	2503	gi\|413943281	PSⅡ的放氧增强蛋白1[玉米] Oxygen-evolving enhancer protein 1 [Zea mays]
21	4101	gi\|414588566	TPA：5 -磷酸核酮糖二磷酸羧化酶小亚基2[玉米] TPA: Ribulose bisphosphate carboxylase small subunit2 [Zea mays]
22	5601	gi\|195634659	果糖二磷酸醛缩酶[玉米] Fructose-bisphosphate aldolase [Zea mays]
23	6302	gi\|37623879	类萌发素蛋白[玉米] Germin-like protein [Zea mays]
24	7101	gi\|162463469	核酮糖二磷酸羧化酶小链,叶绿体前体[玉米] Ribulose bisphosphate carboxylase small chain, chloroplastic precursor [Zea mays]
25	0206	gi\|670422154	预测：放氧增强蛋白2,叶绿体[玉米] PREDICTED: Oxygen-evolving enhancer protein 2, chloroplastic [Zea mays]
26	9503	gi\|540067310	核酮糖二磷酸羧化酶大亚基（叶绿体）[玉米亚种] Ribulose bisphosphate carboxylase large subunit (chloroplast) [Zea mays subsp. mays]
续表1 Continued table 1
序号 Code	蛋白点编号 Spot number	登录号NCBI Accession number	蛋白特性描述 Protein annotation
Bt799zd和ZD958对比后下调表达2倍以上蛋白 Down-regulated expression of more than 2 times the protein after Bt799zd and ZD958 comparison
27	0102	gi\|413942535	质体蓝素钠1[玉米] Plastocyanin isoform 1 [Zea mays]
28	2401	gi\|540067310	核酮糖二磷酸羧化酶大亚基（叶绿体）[玉米亚种] Ribulose bisphosphate carboxylase large subunit (chloroplast) [Zea mays subsp. mays]
29	8101	gi\|414588566	TPA：5 -磷酸核酮糖二磷酸羧化酶小亚基2[玉米] TPA: Ribulose bisphosphate carboxylase small subunit2 [Zea mays]
30	9001	gi\|162463469	核酮糖二磷酸羧化酶小链,叶绿体前体[玉米] Ribulose bisphosphate carboxylase small chain, chloroplastic precursor [Zea mays]
31	9203	gi\|540067310	核酮糖二磷酸羧化酶大亚基（叶绿体）[玉米亚种] Ribulose bisphosphate carboxylase large subunit (chloroplast) [Zea mays subsp. mays]
IE034z和Z58对比后特异表达蛋白 Specific expression protein after IE034z and Z58 comparison
32	2107	gi\|195610088	M-型硫氧还蛋白[玉米] Thioredoxin M-type [Zea mays]
33	7006	gi\|2981214	PS I复合物亚基前体的部分亚基[玉米] Photosystem I complex PsaN subunit precursor, partial [Zea mays]
IE034z和Z58对比后上调表达2倍以上蛋白 Up-regulated expression of more than 2 times the protein after IE034z and Z58 comparison
34	0207	gi\|540067310	核酮糖二磷酸羧化酶大亚基（叶绿体）[玉米亚种] Ribulose bisphosphate carboxylase large subunit (chloroplast) [Zea mays subsp. mays]
35	3511	gi\|413943281	放氧增强蛋白1[玉米] Oxygen-evolving enhancer protein 1 [Zea mays]
36	4301	gi\|670422154	预测：放氧增强蛋白2,叶绿体[玉米] PREDICTED: Oxygen-evolving enhancer protein 2, chloroplastic [Zea mays]
37	4408	gi\|414592172	TPA：蛋白ZEAMMB73_321092[玉米] TPA: Hypothetical protein ZEAMMB73_321092 [Zea mays]
38	4715	gi\|414590290	TPA：ATP合成酶CF1β亚基[玉米] TPA: ATP synthase CF1 beta subunit [Zea mays]
39	4715	gi\|168586	丙酮酸磷酸双激酶[玉米] Pyruvate, orthophosphate dikinase [Zea mays]
40	5102	gi\|37623879	类萌发素蛋白[玉米] Germin-like protein [Zea mays]
41	5103	gi\|226491656	肽基脯氨酰顺反式异构酶[玉米] Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase [Zea mays]
42	5301	gi\|670422154	预测：放氧增强蛋白2,叶绿体[玉米] PREDICTED: Oxygen-evolving enhancer protein 2, chloroplastic [Zea mays]
43	6006	gi\|162463469	核酮糖二磷酸羧化酶小链,叶绿体前体[玉米] Ribulose bisphosphate carboxylase small chain, chloroplastic precursor [Zea mays]
44	6406	gi\|414592172	TPA：蛋白ZEAMMB73_321092[玉米] TPA: Hypothetical protein ZEAMMB73_321092 [Zea mays]
IE034z和Z58对比后下调表达2倍以上蛋白 Down-regulated expression of more than 2 times the protein after IE034z and Z58 comparison
45	4102	gi\|670422154	预测：放氧增强蛋白2,叶绿体[玉米] PREDICTED: Oxygen-evolving enhancer protein 2, chloroplastic [Zea mays]
46	4103	gi\|414592172	TPA：蛋白ZEAMMB73_321092[玉米] TPA: Hypothetical protein ZEAMMB73_321092 [Zea mays]
Bt799z和Z58对比后特异表达蛋白 Specific expression protein after Bt799z and Z58 comparison
47	1109	gi\|414592172	TPA：蛋白ZEAMMB73_321092[玉米] TPA: Hypothetical protein ZEAMMB73_321092 [Zea mays]
48	4706	gi\|413943281	放氧增强蛋白1[玉米] Oxygen-evolving enhancer protein 1 [Zea mays]
49	5201	gi\|40457466	草铵膦乙酰转移酶[化学合成] Phosphinothricin acetyl transferase [synthetic construct]
Bt799z和Z58对比后上调表达2倍以上蛋白 Up-regulated expression of more than 2 times the protein after Bt799z and Z58 comparison
50	5501	gi\|363543235	未知蛋白[玉米] Hypothetical protein [Zea mays]
51	6503	gi\|414592172	TPA：蛋白ZEAMMB73_321092[玉米] TPA: Hypothetical protein ZEAMMB73_321092 [Zea mays]
续表1 Continued table 1
序号 Code	蛋白点编号 Spot number	登录号NCBI Accession number	蛋白特性描述 Protein annotation
52	7301	gi\|37623879	类萌发素蛋白[玉米] Germin-like protein [Zea mays]
53	7302	gi\|413950290	肽基脯氨酰顺反式异构酶家族蛋白[玉米] Putative peptidyl-prolyl cis-trans isomerase family protein [Zea mays]
54	8404	gi\|670422154	预测：放氧增强蛋白2,叶绿体[玉米] PREDICTED: Oxygen-evolving enhancer protein 2, chloroplastic [Zea mays]
55	8502	gi\|414592172	TPA：蛋白ZEAMMB73_321092[玉米] TPA: Hypothetical protein ZEAMMB73_321092 [Zea mays]
56	9204	gi\|414592172	TPA：蛋白ZEAMMB73_321092[玉米] TPA: Hypothetical protein ZEAMMB73_321092 [Zea mays]
57	3701	gi\|540067394	ATP合酶β亚基（叶绿体CF1）[玉米亚种] ATP synthase CF1 beta subunit (chloroplast) [Zea mays subsp. mays]
58	3602	gi\|413943281	放氧增强蛋白1[玉米] Oxygen-evolving enhancer protein 1 [Zea mays]
59	2201	gi\|269993586	部分叶绿体铜/锌氧化物歧化酶[玉米] Chloroplastic Cu/Zn superoxide dismutase, partial [Zea mays]
Bt799z和Z58对比后下调表达2倍以上蛋白 Down-regulated expression of more than 2 times the protein after Bt799z and Z58 comparison
60	2701	gi\|413943281	PSⅡ的放氧增强蛋白1[玉米] Oxygen-evolving enhancer protein 1 [Zea mays]
61	1201	gi\|11467200	5-磷酸核酮糖二磷酸羧化酶/加氧酶-1-大亚基（叶绿体）[玉米] Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/ oxygenase large subunit (chloroplast) [Zea mays]

新窗口打开
此外,对4份转基因材料获得的特异蛋白点与转基因材料中所转入的Bt蛋白序列进行比对,发现了特异蛋白点#3802、#4719、#3707、#3708分别对应Bt蛋白cry1Ab、cry1Ie、mcry1Ac、mcry1Ac（图1）。说明转基因材料中转入的Bt基因在玉米中能够正常表达,并且这些Bt蛋白能够通过双向电泳被分离和鉴定,最终体现在蛋白质组分析所获得的特异蛋白点中。
Table 2
表2
表2转基因玉米差异表达蛋白汇总
Table 2Summary of differentially expressed proteins in different GM maize varieties

结果描述 Result description	倍数 Fold	蛋白特性描述 Protein annotation
1#表达量显著升高 1 # expression was significantly increased	5.7	类萌发素蛋白[玉米] Germin-like protein [Zea mays]
1#表达量显著升高 1 # expression was significantly increased	4.8	核酮糖二磷酸羧化酶[玉米] Ribulose bisphosphate carboxylase [Zea mays]
	3.6	PSⅡ的放氧增强蛋白1[玉米] Oxygen-evolving enhancer protein 1 [Zea mays]
	3.6	部分GADPH酶（383 AA）[玉米] GADPH (383 AA), partial [Zea mays]
	3	丙酮酸磷酸双激酶[玉米] Pyruvate orthophosphate dikinase [Zea mays]
4#表达量显著升高 4# expression was significantly increased	261	类萌发素蛋白[玉米] Germin-like protein [Zea mays]
4#表达量显著升高 4# expression was significantly increased	25	果糖二磷酸醛缩酶[玉米] Fructose-bisphosphate aldolase [Zea mays]
	3.7	PSⅡ的放氧增强蛋白1[玉米] Oxygen-evolving enhancer protein 1 [Zea mays]
	3.3	核酮糖二磷酸羧化酶[玉米] Ribulose bisphosphate carboxylase [Zea mays]
	3.3	ATP合成酶β亚基（叶绿体CF1）[玉米亚种] ATP synthase CF1 beta subunit (chloroplast) [Zea mays subsp. mays]
2#表达量显著升高 2 # expression was significantly increased	41	ATP合成酶CF1 β亚基[玉米亚种] ATP synthase CF1 beta subunit (chloroplast) [Zea mays subsp. mays]
2#表达量显著升高 2 # expression was significantly increased	41	丙酮酸磷酸双激酶[玉米] Pyruvate orthophosphate dikinase [Zea mays]
	32	放氧增强蛋白[玉米] Oxygen-evolving enhancer protein [Zea mays]
	4.6	核酮糖二磷酸羧化酶[玉米] Ribulose bisphosphate carboxylase [Zea mays]
	3.3	类萌发素蛋白[玉米] Germin-like protein [Zea mays]
	2.1	肽基脯氨酰顺反式异构酶[玉米] Putative peptidyl-prolyl cis-trans isomerase family protein [Zea mays]
3#表达量显著升高 3# expression was significantly increased	9.6	TPA：蛋白ZEAMMB73_321092[玉米] TPA: hypothetical protein ZEAMMB73_321092 [Zea mays]
3#表达量显著升高 3# expression was significantly increased	4.3	放氧增强蛋白[玉米] Oxygen-evolving enhancer protein [Zea mays]
	3.6	类萌发素蛋白[玉米] Germin-like protein [Zea mays]
	2.7	肽基脯氨酰顺反式异构酶家族蛋白[玉米] Putative peptidyl-prolyl cis-trans isomerase family protein [Zea mays]
	2.1	未知蛋白[玉米] Unknown protein [Zea mays]
	2.1	ATP合酶β亚基（叶绿体CF1）[玉米亚种] ATP synthase CF1 beta subunit (chloroplast) [Zea mays subsp. mays]
4#表达量显著降低 4 # expression was significantly reduced	2.4	质体蓝素钠1[玉米] Plastocyanin isoform 1 [Zea mays]

新窗口打开

2.2 差异蛋白的GO分析和KEGG分析

虽然通过BLASTx对试验所得的差异蛋白点进行了初步鉴定,获得了蛋白信息,但这些蛋白在是否在细胞组成、生物途径和分子功能上具有共性,是否富集于某一代谢途径,仍无法准确推断。通过对这些差异蛋白质的生物学功能和代谢通路富集分别进行GO（图3）和KEGG分析（图4）。发现转基因材料与对照材料相比虽有差异,但也主要集中在光合作用相关蛋白,并未发现特殊蛋白或特殊代谢途径的明显改变。SK12-5zd与ZD958比较发现,共有5个不同生物途径的相关蛋白发生了差异表达,分别为光合作用（photosynthesis）相关蛋白3个、还原型戊糖磷酸循环途径（reductive pentose-phosphate cycle）相关蛋白2个、钙离子结合（calcium ion binding）蛋白2个、不同细胞组成相关蛋白4个（具体为膜外蛋白（extrinsic component of membrane）2个和光合系统Ⅱ放氧复合体（photosystem Ⅱ oxygen evolving complex）相关蛋白2个。
Bt799zd与ZD958比较发现,有7个不同生物途径相关蛋白发生了差异表达,分别为光合作用相关蛋白4个,光呼吸（photorespiration）相关蛋白质2个和碳固定途径（carbon fixation）相关蛋白2个;发现4个不同分子功能的蛋白发生了差异表达,分别为2个核酮糖-二磷酸羧化酶的活性蛋白（ribulose- bisphosphate carboxylase activity）和2个单加氧酶活性蛋白（monooxygenase activity）;按照细胞组成分析也发现了4个蛋白发生了差异表达,分别为膜外蛋白（extrinsic component of membrane）2个和光合系统Ⅱ放氧复合体（photosystem II oxygen evolving complex）相关蛋白2个。
IE034z与Z58比较发现,有4个不同生物途径相关蛋白发生了差异表达,均属于光合途径相关蛋白;
有5个细胞组成相关蛋白发生了差异表达,分别为膜外蛋白3个和光合系统Ⅱ放氧复合体相关蛋白2个;按照分子功能分析则发现了钙离子结合的蛋白发生了差异表达3个。
Bt799z与Z58比较发现,有4个生物途径相关蛋白发生了差异表达,均属于光合途径相关蛋白;按照细胞组成分析有6个蛋白发生了差异表达,分别为膜外蛋白3个和光合系统Ⅱ放氧复合体相关蛋白3个;还发现有3个分子功能为钙离子结合的蛋白发生了差异表达。
通过2倍上下调控表达水平来筛选转基因材料与其非转基因对照材料的差异蛋白质进行KEGG分析则发现,在SK12-5zd与ZD958的比较中,差异蛋白在光合生物碳固定途径（carbon fixation in photosynthetic organisms）中显著富集;而在Bt799zd和ZD958的比较中,差异蛋白则分别在光合生物碳固定途径、光合作用和碳代谢（carbon metabolism）几个代谢途径中显著富集。在IE034z和Z58以及Bt799z和Z58的比较中均为光合作用代谢途径中的差异蛋白显著富集（图4）。

显示原图|下载原图ZIP|生成PPT
图3转基因玉米叶片与其对照的差异蛋白GO分析
-->Fig. 3GO analysis of differentially expressed proteins between GM maize leaves and their CKs
-->

显示原图|下载原图ZIP|生成PPT
图4转基因玉米叶片与其对照的差异蛋白KEGG分析
-->Fig. 4KEGG analysis of differentially expressed proteins between GM maize leaves and their CKs
-->

3 讨论

随着转基因植物的研发和推广,转基因生物及其产品的分析鉴定,以及转入基因的直接表达产物和间接调控产物对转基因生物生长发育、生态环境、食物链及人类食品安全的影响越来越受到关注。由于现有转基因生物中多数外源基因的表达或调控产物都是蛋白质,因而在蛋白质水平上对转基因生物进行评价显得尤为重要,蛋白质组学的兴起和发展为在蛋白质水平上对转基因生物进行评价提供了可能^[30-31]。
本研究对4种转基因抗虫玉米材料及其非转基因对照玉米材料进行了蛋白质组分析。每份材料经双向电泳凝胶分离后均可检测到1 200个蛋白质点,利用PDQuest8.0软件对蛋白质组表达谱进行分析,已检测到4份转基因材料与对照之间差异表达的Bt杀虫蛋白,还鉴定出61个表达量发生显著变化的蛋白质点,主要集中于光合作用、同化物的积累及能量代谢过程。不同转基因材料中均检测到光合生物碳固定途径中的差异蛋白,如光合作用中决定碳同化速率的关键酶——核酮糖1,5二磷酸羧化酶、C4植物光合作用途径中二氧化碳固定的关键酶——丙酮酸磷酸双激酶、放氧增强蛋白;植物中对逆境响应的类萌发素蛋白、以及ATP合成酶类等在4个转基因材料中均有显著的上调表达,这些差异蛋白不仅是遗传背景的差异,可能也与转基因玉米具有抗虫性相关,而GO分析和KEGG分析的结果也证实了上述差异的存在。理论上光合作用的增强,生物体抗逆能力增强,生长会更健壮,植物的光合能力也会提高,这有待于后期对材料的观察和分析;同时光合作用和碳固定过程增强,均涉及大量的能量物质流动,这些能量物质的去向与外源Bt蛋白的表达是否存在关联,有待深入分析。
本研究发现类萌发素蛋白在所有转基因材料中均有显著的上调表达,该蛋白是在植物中普遍存在的位于胞外基质的可溶性糖蛋白,绝大多数为稳定的低聚物,其作用为参与植物对逆境胁迫的响应。这类蛋白的上调表达可能预示着抗虫转基因玉米材料中,除依赖表达针对靶标生物的毒蛋白已达到抗虫的目的外,还可能存在某种共有的变化机制,对其他逆境胁迫响应产生作用,而具体作用机制需通过后续的逆境胁迫响应评估及分析深入研究。
转基因作物的蛋白质组差异一方面是由于外源基因的插入造成的,另一方面还有可能由环境因素造成^[7]。本研究材料均在温室内培养至5叶1心期,极大程度地避免了环境因素的影响,其结果所反应出的差异应主要为外源基因插入造成的蛋白质组差异。在此基础上,发现受体材料的遗传背景可能影响转基因材料的蛋白表达差异。本研究中所用的转基因自交系材料均是经过高世代选育获得的稳定材料,其基因组差异极小,因此,在与其回交亲本材料比较中所发现的蛋白质差异,应主要来源于外源基因的插入及表达所引起的蛋白质组变化。研究结果也证明在相同遗传背景的转基因材料中,其蛋白表达变化的一致性较高,而经过杂交配制的转基因杂交种材料,由于杂交过程中的不确定性,外源基因的表达和杂交过程均会对蛋白质组产生影响,因此导致检测出了更多的差异表达蛋白,本研究结果也再次证实了不同遗传背景但转入相同基因的材料间（3#和4#）其蛋白水平上的表达差异较大。这与抗虫玉米Mon810的相关蛋白质组的比较分析结果基本一致,即在转基因玉米个体的蛋白质表达谱之间没有显著的个体差异,其主要差异源于基因组遗传背景的差异^[5-7]。
抗虫转基因玉米生物安全评价过程中非常重视其食用和饲用安全性。综合分析本研究结果,在4份转基因玉米材料中并没有发现影响其食用或饲用安全的新蛋白,未发现植物生理、生化和代谢过程中发挥重要功能的蛋白质或致敏和毒素蛋白质产生或发生明显的表达变化。由于蛋白质是具有生物功能的特殊大分子物质,转基因植物的食用安全性变化会直接体现在蛋白质水平上。本研究表明抗虫转基因玉米在蛋白质水平上并未产生可检出的影响其安全性的蛋白成分。转基因材料中发生变化的蛋白多集中于光合作用、同化物的积累及能量代谢过程,这些过程也与转基因材料安全性关系小,并非影响转基因材料安全性的非预期效应。

4 结论

SK12-5zd、IE034z、Bt799z、Bt799zd等4种转基因抗虫玉米材料与对照蛋白质组相似性较高,仅有少数几个与光合作用、碳固定和ATP合成途径等基础代谢过程相关基因出现上调表达,但未见基因的异常表达。测试的4种转基因材料在蛋白质水平未发生影响其安全性的非预期效应。
The authors have declared that no competing interests exist.