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利用2b-RAD测序结合HRM分析技术开发与梨矮生性状相关的DNA分子标记

本站小编 Free考研考试/2021-12-26
肖玉雄, 王彩虹, 田义轲, 杨绍兰, 李鼎立, 张海月. 利用2b-RAD测序结合HRM分析技术开发与梨矮生性状相关的DNA分子标记[J]. , 2017, 50(15): 3006-3012 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2017.15.014
XIAO YuXiong, WANG CaiHong, TIAN YiKe, YANG ShaoLan, LI DingLi, ZHANG HaiYue. Development of DNA Molecular Markers for the Dwarf Trait in Pear Through the Method of 2b-RAD Sequencing and HRM Analysis[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2017, 50(15): 3006-3012 https://doi.org/10.3864/j.issn.0578-1752.2017.15.014

0 引言

【研究意义】果树的矮化密植栽培因具有早果、高产、品质优良、易于管理、能够有效节约成本和增加利润等优点,已发展成为国内外极为重要的栽培模式。目前,实现矮密栽培的主要途径是利用矮化砧木和矮生品种,因此,发掘和利用优良的基因资源,进行矮化砧木和矮生品种的培育对果树生产具有重要意义。【前人研究进展】西洋梨矮生型实生变异品种‘Le Nain Vert’具有树体紧凑、矮小的特点,非常适合矮密栽培。研究发现,矮生梨在茎、叶的解剖结构上有区别于普通型梨的显著特征[1]。由于‘Le Nain Vert’的矮生性状受控于显性单基因[2],因此,该基因资源在梨矮生品种的培育方面具有重要应用价值。WANG等[3]将该基因命名为PcDw,并通过SSR标记将其定位于西洋梨基因组第16连锁群上。最近,李炜等[4]依据苹果与梨基因组间高度的保守性和共线性关系,以二者的参考基因组序列为基础,又筛选鉴定了一组与PcDw连锁的DNA分子标记,将该基因定位到了西洋梨的染色体片段scaffold00074上。利用简化基因组测序技术进行大规模高通量SNP分型是当前国际上动植物基因组学研究热点之一。美国Oregon大学发明的RAD(Restriction Association site DNA)技术是广泛应用的简化基因组测序技术[5]。2007年,MILLER等[6]发表了应用芯片杂交的RAD技术。2008年,BAIRD等[7]将RAD和NGS（Next-generation sequencing）结合,建立了RAD-seq技术。2012年,PETERSON等[8]对RAD技术进行改进,提出了ddRAD（double digest RAD）技术。针对RAD技术流程复杂的问题,ELSHIRE等[9]曾提出GBS（genotyping- by-sequencing）技术。随后,WANG等[10]推出基于llB型限制性内切酶的2b-RAD技术,该技术流程简便,重复性和标签代表性高,基于混合泊松分布模型的de novo SNP分型新算法（iML）,可使假阳性率得到较大幅度降低[11]。目前,RAD测序技术在许多物种上得到了应用,例如大麦(Hordeum vulgare L. )[12]、黑麦草（Lolium perenne）[13]等,但在果树上还未见报道。【本研究切入点】为了最终达到分离鉴定PcDw的目的,还需要大量的遗传标记进一步对该基因进行更为精细的染色体定位。因此,在以往研究的基础上,继续高效开发更多与其紧密连锁的遗传标记是十分必要的。将2b-RAD测序技术与HRM分析技术相结合,进行果树重要农艺性状SNP标记的开发,是一个值得探索的途径。【拟解决的关键问题】随着西洋梨全基因组序列的公布[14],使大量获得SNP标记成为可能。本研究利用分离群体分组分析的原理[15],采用2b-RAD技术在矮生型/普通型梨对比基因池间进行比较分析,初步筛查可能与目标性状相关的SNP位点,然后利用高效的高分辨率熔解曲线（HRM）分析技术进行大规模的群体分析,以确认与梨矮生性状决定基因PcDw共分离的SNP标记,为进一步实现该基因的精细定位及分离鉴定提供重要依据。

1 材料与方法

试验于2016年4—11月在青岛农业大学园艺学院植物遗传改良与育种重点实验室进行。

1.1 基因组DNA 的提取与对比基因池的构建

以‘矮生梨’（Pyrus communis L.）ב茌梨’（P. bretschneideri Rehd.）及‘2-3’（P. communis L.×P. bretschneideri Rehd.）ב绿宝石’（P. Serotina Nakai.）2个F1杂交分离群体（即群体1和群体2）为试材。‘矮生梨’和‘2-3’为矮生型亲本;‘茌梨’和‘绿宝石’为普通型亲本。群体1共有215株,其中矮生型和普通型分别有115株和100株。群体2共有168株,其中矮生型和普通型各有89株和79株。2016年4月取梨树的幼叶,用天根植物基因组DNA提取试剂盒提取并纯化基因组DNA,用琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000超微量分光光度计（Thermo Fisher Scientific, USA）对DNA的质量和浓度进行检测,并将其浓度稀释到10 ng·L-1。
从每个群体中分别抽取15个矮生型杂种和15个普通型杂种,将其DNA等量混合,形成矮生型基因池D1和D2以及普通型基因池S1和S2。

1.2 2b-RAD测序分析与SNP位点筛选

利用2b-RAD技术构建梨4个基因池的标签测序文库,并在Hiseq2500 v2平台进行single-end测序（此项工作由上海欧易生物医学科技有限公司完成）。将原始reads进行质量过滤,剔除不含有BsaXⅠ酶切识别位点的序列,剔除低质量序列（即大于10个碱基的质量分数小于20的序列）,剔除有10个以上连续相同碱基的序列。从梨参考基因组序列（https:// www.rosaceae.org/species/pyrus/pyrus_communis/genome_v1.0）中提取包含BsaXⅠ酶切位点的标签作为参考序列。将每个样本的高质量reads利用SOAP软件[16]（参数设置为：-M4-v2-r0）定位到参考序列上。获得可用于分型的unique标签数目及深度。利用最大似然法（maximum likelihood,ML）进行SNP位点的分型（分型条件：只留取标签内最多有3个SNP的标签位点;分型标签深度设置为500以下。选取在样本间能分型的SNP位点,采用种群结构分析软件对样本间及组间差异SNP位点筛选数据进行分析。

1.3 与PcDw连锁的SNP标记的鉴定

对在4个对比基因池上产生的SNP标记进行分析,筛选出矮生型基因池与普通型基因池间的多态性SNP标记,然后查找位于西洋梨染色体片段scaffold00074上的SNP位点,在其两侧合适位置设计引物（Primer 4.0 software）,用HRM技术分析这些SNP标记在群体上的分离行为,以确定是否为与PcDw紧密连锁的遗传标记。

1.4 高分辨率熔解曲线（HRM）分析

HRM分析在LightCycler®480Ⅱ荧光定量PCR仪（Roche）上进行。反应试剂来自LightCycler®480 High Resolution Melting Master 试剂盒。反应体系为10 μL,内含10 ng基因组DNA 1 μL,1×Master Mix 5 μL,2.0 mmol·L-1 MgCl2 1 μL,上、下游引物（0.2 μmol·L-1）各1 μL,ddH2O 1 μL。PCR扩增程序为95℃预变性10 min,然后按95℃变性10 min、55℃退火15 s、72℃延伸10 s的程序进行45个循环。在PCR循环结束后,立即对扩增产物进行HRM检测,程序为：95℃ 1 min、40℃ 1 min、65℃ 1 s;在65℃升温至95℃的过程中,以25次/℃的频率收集荧光信息,最后降温至40℃。
HRM分析用LightCycler®480的Gene Scanning软件（1.5 version）进行。

2 结果

2.1 2b-RAD测序结果
对4个样本（即4个近等基因池）的2b-RAD标签测序文库的测序结果共产生67 186 260条reads,平均每个样本测序reads数为16 796 565。将原始reads进行质量过滤后的统计结果表明,每个样本获得平均unique标签数目为86 810,平均测序深度为77×。测序深度能够达到准确分型的标准,可以进行下一步SNP标记分型分析。SOAP软件定位结果表明,4个测序文库中含有酶切位点的高质量reads占测序原始reads的70%以上（表1）,表明梨文库的测序质量较好。

2.2 矮生型/普通型对比基因池间SNP位点筛选

选取在样本间能分型的SNP位点,分别在来自群体1和群体2的4个对比基因池间进行比较分析,共筛查出可在矮生型/普通型表型间进行分型的SNP标记1 317个,进一步的标签筛查结果表明,其中有8个SNP位于西洋梨染色体片段scaffold00074（即PcDw的定位染色体片段,长度441 741 bp）上,其染色体位置及样品分型结果见表2。
Table 1
表1
表12b-RAD测序结果
Table 1The result of 2b-RAD sequencing
基因池
Gene bulks		原始reads数
No. of raw reads		高质量reads数
No. of filtered reads		高质量reads百分率
Percentage of high quality reads		unique标签数
Unique tags		标签深度
Tags depth
D1167965651255838074.80%8850368
D2167965651500910889.40%8495483
S1167965651433692985.40%9015176
S2167965651444225186.00%8363581

D1 and D2 represent the dwarf bulk from population 1 and population 2, respectively. S1 and S2 represent the standard bulk from population 1 and population 2, respectively. The same as belowD1、D2：分别来自群体1和群体2的矮生型基因池;S1、S2：分别来自群体1和群体2的普通型基因池。下同
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Table 2
表2
表2定位到西洋梨染色体片段scaffold00074上的8个SNP标记及其分型信息
Table 2Eight SNP markers mapped on chromosome scaffold00074 of P. communis and their genotypes of each sample
SNP位点
SNP locus		2b-RAD标签参考序列
2b-RAD tags reference sequence		染色体起始位置
Starting locus in the chromosome		样本分型 Sample genotypes
D1D2S1S2
SNP1TAACTTTTAACATGGGCTCCTGTTTGT18140AGAGGGGG
SNP2GGCGGAAGGAGAAACGGTTTCTTGATA70046CTCTCCCC
SNP3CCGTAACGGAGACAGGGTACCAAATAG99471ACACAAAA
SNP4GGCGAGTGGAGACCGTGTGTAAACAAA196511CGCGCCCC
SNP5CGAACGACCACGCGCTCTCCATGTCAC267146AGAGGGGG
SNP6GCTCAGCCTACTGAGCCTCCTGAGCAA333036AGAGGGGG
SNP7GTTAAGGGGAGGTGGTGTGGGGGAATG353951AGAGGGGG
SNP8TTCCTTGGGAGAGGGTGTTTATATAGT429465CTCTTTTT

方框为碱基差异位点位置 The box represents the position of the base difference
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2.3 与PcDw位点共分离的SNP标记鉴定

针对以上8个定位于scaffold00074上的SNP位点,分别设计8对PCR引物（表3）,并分别在群体1和群体2上进行HRM分析,最终在群体1上检测到SNP1和SNP7两个与PcDw 位点共分离的SNP标记,在群体2上检测到SNP1、SNP6、SNP7和SNP8 4个可与PcDw 位点共分离的SNP标记。根据其扩增子的熔解曲线形状差异,可有效地区分矮生型和普通型表型（图1、图2）。在群体1的215个杂种后代和群体2的168个杂种后代中,未发现有标记与性状的重组类型。
Table 3
表3
表38个SNP位点群体分型检测所用的HRM 引物
Table 3HRM primers designed for 8 SNPs genotyping in the whole populations
SNP 位点 SNP loci正向引物序列 Forward primer sequence (5′-3′)反向引物序列 Reverse primer sequence (5′-3′)
SNP1GGGATTCTCTTCGGATCCTTTCTTCTGCGCCGTTGAAAATTGA
SNP2GTGAGTTTGGCGGAAGGAGATGGCACAATTGAGCGGTACA
SNP3TGTTGGTGGCCATGAAGAGGCCACTATTTGGTACCCTGTCTCC
SNP4GGATTCTCTCGATGCGCTTATTACACACGGTCTCCACTCG
SNP5TGGGAGGAGGGATCTTGCATAAAGGGGTGACATGGAGAGC
SNP6TCGACTGTCCCACCCATTAAACAGACCGTTGGATTTTGATCC
SNP7TGGCGATTCTTTGTGGATTGGTGCCCTATTCTCCATCCGAT
SNP8TCTCGACAACGGGCATGTTAGTCCAGATTCGGCGTACAGA


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图 1SNP1和SNP7在‘矮生梨’ב茌梨’群体中的HRM分析结果
-->Fig. 1Results of HRM analysis of SNP1 and SNP7 in the population produced by ‘Aishengli’בChili’
-->

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图 2SNP1、SNP6、SNP7和SNP8在‘2-3’ב绿宝石’群体中的HRM 分析结果
-->Fig. 2Results of HRM analysis of SNP1, SNP6, SNP7 and SNP8 in the population produced by ‘2-3’ בLvbaoshi’
-->

3 讨论

单核苷酸多态性（SNP）是基因组中最常见的遗传多态性。SNP标记已在果树的遗传图谱构建、基因标记与定位等研究中发挥了重要作用[17-20]。与RFLP、AFLP、SSR等传统基因分型技术相比,SNP分子具有分布广泛、代表性强、稳定性好、易于分析等优势。SNP分子标记的获得往往依赖于大规模、高通量的基因组数据分析[21]。对果树来说,其复杂的基因组是造成测序分析成本高的主要原因。
简化基因组测序技术2b-RAD是改进的RAD技术,使测序更加简易、精确,已在高密度遗传图谱的构建、群体的遗传学研究、群体进化分析、标记开发等领域得到了应用[22-28]。高分辨率熔解曲线分析是一种高效的遗传变异检测方法,被广泛的应用于突变扫描、基因分型和标记开发等方面。目前,HRM技术已发展成为SNP标记分型的重要手段[29-31]。李炜等[4]曾依据苹果与梨基因组间高度的保守性和共线性关系,以苹果基因组序列为参考设计了大量引物,通过HRM分析仅筛查到1个与梨矮生性状决定基因PcDw紧密连锁的SNP标记。为了提高SNP位点的检测效率,本研究利用2b-RAD测序技术通过对4个对比基因池间共有标签的序列分析,筛查到了大量的可能与目标性状相关的SNP位点,对于初步筛查到的SNP标记,再利用高通量的HRM分析技术进行群体上的大规模验证,以确定其是否为与目标性状紧密连锁的遗传标记。这样,可避免了在群体上继续用2b-RAD技术进行验证分析造成的高成本问题。本研究基于这一策略,鉴定获得了一组与梨矮生性状决定基因PcDw位点连锁的新标记。可见,将2b-RAD测序技术与HRM分析技术相结合,进行果树重要农艺性状分子标记的开发,是一种行之有效的方法。
根据不同亲本构建的杂交群体的遗传背景是有差异的,因此,依据不同群体开发的遗传标记是不可能完全相同的。本研究结果显示,在群体1上,鉴定出了2个与PcDw连锁的SNP标记;在群体2上,鉴定出了4个与PcDw连锁的SNP标记。另外,对在不同群体上鉴定到的相同的SNP标记来说,其HRM分析熔解曲线形状也可能会出现差异。出现这一现象的原因,也与群体的遗传基础差别有关。本研究从2个不同的杂种群体上共检测到了4个新的与梨PcDw紧密连锁的DNA分子标记。这些标记,不仅可以作为目标基因定位的参考依据,也可成为目标性状标记辅助选择的有力工具。

4 结论

应用2b-RAD技术对2对矮生型/普通型对比基因池进行基因组测序分析,在对比基因池间筛选出单核苷酸多态性（SNP）位点1 317个,其中有8个SNP位点位于PcDw的定位染色体scaffold0007上。用HRM分析技术对这8个SNP位点进行群体上的进一步检测,共鉴定出4个与PcDw位点共分离的SNP标记,其中SNP1和SNP7为2对群体共有的SNP标记。这一研究结果对PcDw的精细定位及其候选基因的筛查具有重要参考。
The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献 原文顺序
文献年度倒序
文中引用次数倒序
被引期刊影响因子

相关话题/基因 技术 序列 遗传 鉴定

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