0 引言
【研究意义】高温是近年来影响中国玉米生产的重要因素。华北平原是中国粮食主产区,因受灌浆期高温胁迫的制约[1],该区春玉米现实产量与理论产量差异极大。玉米灌浆期的最适温度低于其他生育阶段,是对高温胁迫最敏感的时期之一。灌浆期遭受高温胁迫会对籽粒的库容[2]、灌浆速率[3]以及源库比[4]等产生影响,从而影响产量。因此,开展灌浆期高温对玉米籽粒发育影响的研究十分重要。【前人研究进展】已有的研究表明高温胁迫对玉米籽粒发育的影响存在品种和粒位的差异。前期研究发现花前（吐丝前0—8 d）和花后（吐丝后0—8 d）高温胁迫下耐热型玉米品种比热敏感型玉米品种具有较高的叶绿素含量和光合能力,产量和品质受高温影响较小[5]。EDREIRA等[6-8]通过研究高温胁迫对不同品种玉米产量构成因素的影响,发现吐丝期和灌浆前期高温胁迫对温带玉米种质资源的影响大于热带种质资源。此外,高温胁迫对强、弱势粒发育影响的研究发现,与强势粒相比,弱势粒由于库容限制[9-10],或同化物供应限制[11-13],或蔗糖-淀粉代谢途径中相关酶活性低[14]等原因,籽粒充实程度较差。同时,高温条件下弱势粒酶活性下降程度明显高于强势粒,从而导致弱势粒的淀粉含量低于强势粒[3]。本课题组前期研究结果表明,玉米籽粒对花后前期高温胁迫的响应存在品种和粒位差异[15]。【本研究切入点】目前研究大多集中在花期或花后前期高温胁迫对玉米籽粒发育的影响方面,对于籽粒灌浆期（授粉后17—28 d）高温胁迫下籽粒发育的影响还相对较少。且籽粒灌浆期高温胁迫对不同耐热型品种、不同粒位籽粒发育的影响及其机理尚不明确,需要进一步研究。【拟解决的关键问题】基于前期研究的基础上,本试验采用籽粒离体培养技术,选用耐热型品种郑单958和热敏感型品种德美亚1号为材料,旨在探明籽粒灌浆期（授粉后17—28 d）高温对不同耐热型品种玉米强弱势粒生长发育的影响及其机制,为生产中制定有效的防控措施提供依据。1 材料与方法
1.1 试验材料与设计
选用郑单958（耐高温）和德美亚1号（热敏感）为材料,种植于中国农业大学上庄实验站,田间管理同常规大田。在玉米吐丝前选穗进行套袋处理,人工统一授粉。在授粉后3 d取穗进行离体培养。两个品种均分别切取强势粒和弱势粒,从顶部向下1 cm为弱势粒,从基部向上第18—20位籽粒为强势粒。授粉后第4天在25℃/25℃（12 h/12 h）下暗培养一天,第5天开始处理,高温处理时间为授粉后17—28 d,高温处理温度为35℃/25℃（12 h/12 h）,授粉后第28天转入25℃/25℃培养至成熟。对照处理温度为25℃/25℃。1.2 籽粒离体培养方法
参考GENGENBACH等[16]方法,果穗经75%酒精灭菌后放入超净台进行操作,按籽粒穗轴比为1:9切取样穗。固体培养基配置方法参照赵丽晓等[3]。1.3 测定项目与方法
1.3.1 籽粒干重 在授粉后10、20、30和40 d取样,测籽粒鲜重,105℃杀青 30 min,80℃烘干,测籽粒干重。1.3.2 籽粒淀粉含量 取授粉后28 d和40 d的籽粒,105℃杀青30 min,80℃烘干,研磨后参照何照范[17]的方法测定淀粉和可溶性糖含量。
1.3.3 淀粉合成相关酶活性 在授粉后28 d,取鲜籽粒液氮冷冻后置超低温冰箱中,用于ADPG焦磷酸化酶、淀粉合成酶、蔗糖转化酶、蔗糖合成酶活性的测定,酶的提取和测定参照NAKAMURA等[18]和ZINSELMEIER等[19]的方法,稍作改进。
提取液为：50 mmol·L-1 Hepes,2 mmol·L-1 MgCl2.6H2O,3%（V/V）乙二醇,1 mmol·L-1 DTT,1 mmol·L-1 EDTA-2Na,1 mol·L-1 NaCl。
ADPG焦磷酸化酶反应体系：50 mmol·L-1 Hepes- NaOH（pH 7.2） 100 μL,10 mmol·L-1 MgCl2.6H2O 50 μL,15 mmol·L-1 DTT 100 μL,1.5 mmol·L-1 ADPG 100 μL,20 mmol·L-1 PPiNa 100 μL,粗酶液200 μL。
淀粉合成酶反应体系：50 mmol·L-1 Hepes- NaOH（pH7.2）50 μL,15 mmol·L-1 DTT 50 μL,1.5 mmol·L-1 ADPG 50 μL,1 mg支链淀粉100 μL,粗酶液200 μL。
蔗糖转化酶反应体系：乙酸-乙酸钠缓冲液（pH 4.8）200 μL,100 mmol·L-1蔗糖200 μL,粗酶液100 μL。
蔗糖合成酶反应体系：50 mmol·L-1 Hepes-NaOH（pH7.2）100 μL,10 mmol·L-1 UDP100 μL,10 mmol·L-1 MgCl2.6H2O 50 μL,100 mmol·L-1 蔗糖150 μL,粗酶液100 μL。
1.3.4 激素含量 在授粉后28 d取鲜籽粒液氮冷冻后置超低温冰箱中,用于GA3、ZR、IAA、ABA 4种激素含量测定。具体方法如下：称取0.2 g鲜籽粒,加4 mL样品提取液（80%甲醇,内含1 mmol·L-1 BHT）,在冰浴下研磨成匀浆,摇匀后放置在4℃冰箱中。4℃下提取4 h,1 000×g离心15 min,取上清液。沉淀中加1 mL提取液,搅匀,置4℃下再提取1 h,离心,合并上清液并记录体积。上清液过C-18固相萃取柱。将过柱后的样品用氮气吹干,除去提取液中的甲醇,用样品稀释液定容（一般0.5 g鲜重用1.5—3.0 mL左右样品稀释液定容）。样品按照包被、洗板、竞争、洗板、加二抗、洗板、加底物显色、比色的顺序测定各激素的含量。具体操作步骤参照宋松泉等[20]的酶联免疫法,酶联免疫试剂盒由中国农业大学提供。
1.4 数据分析
用Excel 2010对数据进行整理,SPSS 20.0软件进行单因素方差分析,采用Duncan检验法进行多重比较及差异显著性分析,文中图表数据均为3次或3次以上重复的平均值。2 结果
2.1 籽粒灌浆期高温对籽粒灌浆动态及灌浆速率的影响
籽粒灌浆期高温显著降低了两品种玉米籽粒成熟期的粒重,对德美亚1号的影响大于郑单958（图1）。在40 DAP,德美亚1号强、弱势籽粒的粒重较对照处理显著降低了24.78%和28.08%,郑单958强、弱势籽粒的粒重显著降低了10.5%和18.59%。高温导致两品种弱势粒粒重的降幅高于强势粒。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1籽粒灌浆期高温下不同品种玉米籽粒的灌浆动态
HT：高温处理;CK：对照。根据 Duncan检验*表示在 0.05 水平上差异显著,ns 表示在0.05 水平上差异不显著。下同
-->Fig. 1Dynamics of grain filling process of two maize varieties under high temperature during grain filling period
HT: High temperature; CK: Control. * indicates significance at P<0.05 and ns indicates no-significance at P<0.05 based on the Duncan test. The same as below
-->
两品种玉米籽粒的灌浆速率呈先升高后降低的趋势（图2）。常温处理下,两品种强、弱势粒灌浆速率在30 DAP达最大。库容充实期高温处理加快了两品种强势粒10—20 DAP的灌浆速率,与籽粒粒重变化同步（图1）,但降低了两品种强、弱势粒灌浆中后期的速率。高温处理后两品种强、弱势粒的灌浆速率在20 DAP达到峰值,较对照均有不同程度的提前。中后期灌浆速率的降低,灌浆持续时间的缩短,是导致籽粒干重下降的主要原因。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2籽粒灌浆期高温下不同品种玉米籽粒灌浆速率的变化
-->Fig. 2Dynamics of grain-filling rate per kernel of different maize varieties under high temperature during grain filling period
-->
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3籽粒灌浆期高温处理下不同品种玉米籽粒淀粉含量的变化
根据 Duncan检验不同字母表示在 0.05 水平上差异显著。下同
-->Fig. 3Dynamics of kernel starch content of two maize varieties under high temperature during grain filling period
Bars with different letters are significantly different at P<0.05 based on the Duncan test. The same as below
-->
2.2 籽粒灌浆期高温对玉米籽粒灌浆参数的影响
表1中各参数表明,籽粒灌浆期高温处理后,郑单958强势粒的Gmax和Gmean值明显升高,D和t3值明显减小。与郑单958强势粒不同的是,郑单958弱势粒和德美亚1号强、弱势粒的上述参数均呈减小趋势。其中,德美亚1号Gmax和Gmean值下降幅度大于郑单958。这些结果表明,高温处理对灌浆参数的影响存在粒位和品种差异。Table 1
表1
表1籽粒灌浆模型与籽粒灌浆参数
Table 1The grain filling parameters and grain filling process model
| 品种 Variety | 粒位 Grain position | 处理 Treatment | 灌浆方程 Model of grain-filling process | 活跃生长期 D (d) | 最大灌浆速率Gmax (mg·grain-1·d-1) | 平均灌浆速率Gmen (mg·grain-1·d-1) | 实际灌浆终期 t3 (d) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 郑单958 Zhengdan958 | 强势粒 Superior kernel | CK | W=195.01/(1+41.87e-0.1580t) r=0.9925 | 37.97 | 7.31 | 3.46 | 49.21 |
| HT | W=139.89/(1+125.69e-0.2625t) r=0.9901 | 22.86 | 9.18 | 3.9 | 35.91 | ||
| 弱势粒 Inferior kernel | CK | W=163.31/(1+58.63e-0.1801t) r=0.9976 | 33.31 | 7.35 | 3.39 | 48.11 | |
| HT | W=129.54/(1+55.21e-0.1921) r=0.9966 | 31.23 | 6.22 | 2.89 | 44.8 | ||
| 德美亚1号 Demeiya 1 | 强势粒 Superior kernel | CK | W=158.79/(1+57.73e-0.2075t) r=0.9974 | 28.9 | 8.04 | 3.7 | 41.93 |
| HT | W=106.15/(1+52.09e-0.2661t) r=0.9978 | 22.55 | 7.06 | 3.31 | 32.12 | ||
| 弱势粒 Inferior kernel | CK | W=134.87/(1+94.25e-0.2071t) r=0.9999 | 28.97 | 7.71 | 3.25 | 41.45 | |
| HT | W=96.39/(1+69.82e-0.2207t) r=0.9989 | 27.19 | 5.32 | 2.41 | 40.07 |
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2.3 籽粒灌浆期高温对玉米籽粒淀粉含量的影响
籽粒灌浆期高温处理对两品种玉米籽粒的淀粉含量存在不同程度影响（图 3）。与对照相比,郑单958强弱势粒淀粉含量在28 DAP和40 DAP均无显著变化。在28 DAP,德美亚1号强、弱势粒的淀粉含量分别降低了6.73%和9.92%。在40 DAP,德美亚1号强、弱势粒的淀粉含量分别显著降低了13.68%和16.39%。以上结果表明,高温对德美亚1号强、弱势粒淀粉含量的影响显著高于郑单958。2.4 籽粒灌浆期高温对玉米籽粒淀粉合成相关酶活性的影响
籽粒灌浆期高温处理后,郑单958强、弱势粒和德美亚1号弱势粒的蔗糖合成酶、蔗糖转化酶和ADPG焦磷酸化酶活性的变化趋势一致,均显著小于相应对照。而德美亚1号强势粒上述3种酶的活性均显著高于对照。高温处理后,两品种强、弱势籽粒淀粉合成酶活性均小于对照。郑单958强、弱势粒淀粉合成酶的活性分别降低了13.70%和11.26%,德美亚1号强、弱势粒的淀粉合酶的活性分别降低了19.67%和30.03%。德美亚1号淀粉合成酶活性下降的幅度大于郑单958（图4）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图4籽粒灌浆期高温处理对玉米籽粒淀粉合成相关酶活性的影响
-->Fig. 4Dynamics of activities of enzymes related to starch synthesis in kernel under high temperature during grain filling period
-->
2.5 籽粒灌浆期高温对玉米籽粒激素含量的影响
从表2可以看出,两品种玉米弱势粒的ZR含量均高于强势粒,这可能是由强、弱势粒发育差异引起的。高温处理后,郑单958和德美亚1号强势粒的GA3含量分别显著升高了9.56%和25.29%,而弱势粒无明显变化。两品种玉米强、弱势粒ZR、IAA和ABA含量的变化趋势一致,均表现为ZR降低,IAA和ABA上升。郑单958强、弱势粒ZR含量相比于对照降低了32.88%和16.10%,IAA分别升高了29.44%、27.29%;德美亚1号强、弱势粒ZR含量相比于对照降低了19.2%和31.95%,IAA分别升高了75.52%、58.06%。可见,高温对籽粒的影响不是由单一的某种激素引起的,而是由多种激素共同作用的结果。Table 2
表2
表2籽粒灌浆期高温处理下玉米籽粒激素含量的影响
Table 2Dynamics of hormone content in kernel under high temperature treatment during grain filling period
| 品种 Variety | 粒位 Grain position | 处理 Treatment | 赤霉素 GA3 | 玉米素 ZR | 生长素 IAA | 脱落酸 ABA |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 郑单958 Zhengdan958 | 强势粒 Superior kernel | CK | 5.96±1.13b | 10.52±0.71a | 48.96±0.75b | 62.89±0.33a |
| HT | 6.53±0.91a | 7.06±1.16b | 69.39±1.06a | 64.36±0.92a | ||
| 弱势粒 Inferior kernel | CK | 5.76±0.06a | 18.07±0.15a | 53.48±0.10b | 97.83±0.54b | |
| HT | 5.50±0.73a | 15.16±0.78b | 73.55±0.95a | 119.71±2.06a | ||
| 德美亚1号 Demeiya 1 | 强势粒 Superior kernel | CK | 6.80±1.11b | 9.04±0.08a | 48.65±1.95b | 75.29±1.07b |
| HT | 8.52±2.14a | 7.30±0.09b | 85.39±0.93a | 100.70±1.37a | ||
| 弱势粒 Inferior kernel | CK | 7.13±0.79a | 16.90±0.24a | 35.22±0.40b | 71.21±1.11b | |
| HT | 7.09±2.32a | 11.50±2.57b | 55.67±2.29a | 77.60±0.86a |
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3 讨论
维持较高的灌浆速率和较长的灌浆持续时间有利于籽粒干重的积累。前期有些研究表明籽粒灌浆期长期高温会显著缩短籽粒的灌浆持续时间,而灌浆速率仅有略微的上升[21]。有些研究则表明籽粒灌浆期高温会延长籽粒的灌浆时间,显著降低籽粒的灌浆速率,但是灌浆时间的延长不能弥补灌浆速率下降引起的干重损失[22]。本研究表明高温处理加快了两品种玉米强势粒前期的灌浆速率,但降低了强、弱势粒灌浆中后期的速率,且灌浆持续时间缩短,最终导致粒重下降,这与赵丽晓等[3]的研究结果一致。此外,高温处理后,德美亚1号强、弱势粒的最大灌浆速率和平均灌浆速率的下降幅度均大于郑单958。籽粒灌浆期高温对热敏感品种灌浆速率的影响更显著。本研究表明,两品种强、弱势粒淀粉合成酶的活性均下降,且对德美亚1号和弱势粒的影响更为显著。高温影响淀粉合成酶的活性从而影响淀粉的积累。相较于郑单958和强势粒,德美亚1号和弱势粒本身所含淀粉合成酶的活性低,因此受高温影响更显著。很多报道指出高温会降低酶的活性从而抑制淀粉的积累[23-27]。但是关于淀粉合成过程中的限制性酶尚无定论。本课题组前期研究结果表明花后前期高温影响了籽粒灌浆后期的ADPG焦磷酸化酶和淀粉合酶,使其活性显著降低,影响籽粒淀粉合成[3]。WILHELM等[21]等指出AGPase和淀粉合成酶对高温都十分敏感,但是只有AGPase的活性用温度系数调整后仍呈现下降的趋势。EBRAHIM等[28]和赵福成等[29]研究指出高温降低蔗糖代谢酶的活性,从而降低蔗糖和淀粉的含量。有很多研究则表明高温对淀粉合成的影响至少有一部分是作用在淀粉合成酶的活性上[23, 30-31]。HURKMAN等[32]通过对小麦的基因表达分析,发现高温会使淀粉合成酶的转录子显著减少。李木英等[14]也研究发现高温处理后,早稻籽粒发育后期中的淀粉合成酶活性降低。此外,籽粒灌浆期高温处理后,郑单958强、弱势粒和德美亚1号弱势粒的蔗糖合成酶、蔗糖转化酶和ADPG焦磷酸化酶的活性均显著下降。而德美亚1号强势粒的上述3种酶的活性均显著上升。这可能是由于品种和发育差异引起的,有待进一步研究。
植物激素在作物对环境胁迫的适应性和耐性上起了极为重要的作用。在高温胁迫下,激素的动态平衡、稳定性、含量、生物合成及分布都会发生变化[33]。本研究表明,高温处理后,两种品种玉米强势粒的GA3含量均高于对照,而弱势粒的GA3含量与对照基本保持一致。GA3参与同化物的转运,在籽粒灌浆充实的过程中起重要作用[34]。强势粒GA3含量的增加有利于同化物向籽粒运输。高温处理后,两品种玉米籽粒的ABA含量显著高于对照。ABA主要通过提高籽粒中淀粉合成酶、酸性转化酶的活性从而提高籽粒对蔗糖的卸载和转运能力。有研究指出高温胁迫会导致ABA含量的上升,ABA含量的上升可以诱导热激蛋白家族（HSPs）的表达[35]。MUSATENKO等[36]对玉米耐热性的研究发现,玉米秧苗在受胁迫后ABA的含量也会迅速上升。徐云姬等[37]在温室试验条件下,发现一些观察点的ABA含量很高,说明在高温、干旱等不利环境条件下ABA含量的会增加。本试验研究结果与前人研究结果一致。此外,本研究表明两品种玉米籽粒的ZR含量显著降低,而IAA含量显著上升。ZR对胚乳细胞的增殖起重要的调控作用,很多研究表明,高温处理后,玉米籽粒中的ZR和IAA含量均明显降低[3, 38-40]。IAA含量的变化与前人研究结果不同,可能与高温处理时间不同有关,有待进一步深入研究。
4 结论
高温处理加快了两品种玉米强势粒前期的灌浆速率,但降低了强、弱势粒中后期灌浆的速率,且灌浆持续时间缩短,最终导致籽粒粒重下降。并且,高温对德美亚1号强、弱势粒的影响显著高于郑单958。高温降低了两种品种玉米籽粒淀粉合成酶的活性,从而降低了两品种玉米籽粒的淀粉含量,德美亚1号强、弱势粒淀粉含量的下降幅度大于郑单958。高温处理后,两品种玉米强、弱势粒ZR、IAA和ABA含量的变化趋势一致,均表现为ZR降低,IAA和ABA上升,而强势粒的GA3含量均上升,弱势粒的GA3含量无明显变化。The authors have declared that no competing interests exist.
