赵雪¹, 王锋², 王文静¹, 刘晓峰¹, 卞士权¹, 刘艳华¹, 刘新民¹, 杜咏梅¹, 张忠锋¹, 张洪博^,11 中国农业科学院烟草研究所,山东青岛 266101
2 西南大学农学与生物技术学院,重庆 400716

Splicing Property Analyses of the NRSE1 Element from Tobacco PR3b mRNA After Fusion Expression with GUS Gene

ZHAO Xue¹, WANG Feng², WANG WenJing¹, LIU XiaoFeng¹, BIAN ShiQuan¹, LIU YanHua¹, LIU XinMin¹, DU YongMei¹, ZHANG ZhongFeng¹, ZHANG HongBo^,11 Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, Shandong
2 College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716

通讯作者: 张洪博,E-mail: zhanghongbo@caas.cn

责任编辑: 李莉
收稿日期:2019-09-5接受日期:2019-12-18网络出版日期:2020-04-16

基金资助:

国家自然科学基金.31801279 中国农业科学院“青年英才计划”项目 中国农业科学院科技创新工程.ASTIP-TRIC05 中国烟草总公司云南省公司.2019530000241005 四川省公司项目.SCYC202014

Received:2019-09-5Accepted:2019-12-18Online:2020-04-16
作者简介 About authors
赵雪,E-mail: zhaoxue1007@163.com。












摘要
【目的】烟草（Nicotiana tabacum L.）碱性几丁质酶基因PR3b在低烟碱突变体（nic1和nic2）中存在转录后mRNA可变剪切现象,但其可变剪切的发生机制仍不清楚。将PR3b的可变剪切元件NRSE1（nicotine- synthesis related splicing element 1）与GUS融合表达,分析NRSE1元件的独立可变剪切特性,以揭示其作用机制。【方法】利用PCR扩增方法获得PR3b cDNA序列中的NRSE1元件片段,并利用基因重组技术构建了烟草PR3b可变剪切元件NRSE1与GUS的融合表达载体。将融合表达载体导入农杆菌LBA4404后,通过农杆菌介导的叶盘转化法培育了表达NRSE1与GUS融合子的低烟碱突变体nic1和nic2及野生型烟草转基因植株;通过RT-PCR检测及GUS染色鉴定出阳性植株后,利用RT-PCR分析NRSE1与GUS融合表达后在低烟碱突变体和野生型烟草中的可变剪切特性;对转基因植株的幼苗进行乙烯（ET）和茉莉酸（JA）处理,通过GUS染色方法分析ET和JA处理对转基因植株中GUS活性的影响,并通过RT-PCR方法分析ET和JA处理对转基因植株中NRSE1与GUS融合子的可变剪切特性影响,以及对转基因植株中NRSE1与GUS融合子表达水平的影响。【结果】通过RT-PCR检测及GUS染色鉴定出表达NRSE1元件与GUS融合子的低烟碱突变体和野生型烟草转基因植株;RT-PCR检测及测序分析证明,NRSE1元件与GUS融合表达后仍能在低烟碱突变体发生高水平的可变剪切,剪切修饰区段的序列变化与烟草中PR3b的mRNA可变剪切修饰一致;利用ET和JA处理转基因植株进行的GUS染色表明,ET和JA处理对转基因植株的GUS活性有不同程度的影响;但利用ET和JA处理转基因植株进行的RT-PCR分析表明,ET和JA处理不改变NRSE1元件原有的诱导剪切特性,也不影响转基因植株中NRSE1元件与GUS融合子的表达水平。【结论】PR3b的可变剪切元件NRSE1与GUS在烟草中融合表达后,仍能在低烟碱突变体nic1和nic2中发生高水平的可变剪切;NRSE1在烟草中的可变剪切不依赖PR3b的其他mRNA区段,是烟草PR3b发生可变剪切的独立元件;ET和JA处理对NRSE1元件与GUS融合表达植株的GUS活性具有一定影响,可能存在翻译水平的调控作用。
关键词： 烟草;PR3b;低烟碱突变体;可变剪切;茉莉酸;乙烯

Abstract
【Objective】Previously, a post-transcriptional splicing of tobacco PR3b gene was observed in the low-nicotine mutants (nic1, nic2) of Nicotiana tabacum L. cv. Burley 21, yet the mechanism underlying this phenomenon is still unclear. In this study, we developed transgenic plants expressing the fusion of the alternative splicing element NRSE1 (nicotine-synthesis related splicing element 1) from PR3b and the GUS gene to investigate the splicing properties of the NRSE1 element after excising from PR3b mRNA, in order to reveal its regulatory mechanism. 【Method】The NRSE1 element was amplified from PR3b cDNA by PCR amplification, and the vector for expressing the fusion of NRSE1 element and the GUS gene was constructed by molecular methods. And, the vector was used to develop transgenic plants expressing the fusion of NRSE1 element and GUS gene with wild type tobacco and the low-nicotine mutants nic1 and nic2 via agrobacterium (LBA4404) mediated transformation method. The transgenic plants were identified by RT-PCR and GUS staining, and the splicing of the fusion of NRSE1 element and GUS gene in the transgenic plants of wild type tobacco and low-nicotine mutants were then analyzed by RT-PCR. Seedlings of the transgenic plants were treated with ethylene (ET) and jasmonic acid (JA), respectively. And, the effects of ET and JA treatment on the GUS activity and the splicing of the fusion of NRSE1 element and GUS gene in the transgenic plants were analyzed by GUS staining and RT-PCR, respectively. The effects of ET and JA treatment on the expression level of the fusion of NRSE1 element and GUS gene were analyzed as well. 【Result】A set of transgenic wild type tobacco and low-nicotine mutants expressing the fusion of NRSE1 element and GUS gene were identified by RT-PCR and GUS staining. Further RT-PCR and sequencing analyses showed that the NRSE1 element could be alternatively spliced at higher levels in the low-nicotine mutants after fusion with the GUS gene, in a pattern consistent with its alternative splicing in the PR3b mRNA as previously report. ET and JA treatments could alter the GUS activity in the transgenic plants, but did not affect the inducible splicing of the NRSE1 element or the expression level of the fusion of NRSE1 element and GUS gene in the transgenic plants. 【Conclusion】 A highly splicing of the NRSE1 element was observed in the low-nicotine mutants after fusion expression with GUS gene. The alternatively splicing of NRSE1 element is independent of the rest regions of PR3b mRNA. ET and JA treatments had an effect on the GUS activities of the transgenic plants expressing the fusion of NRSE1 element and GUS gene, which may result from a translational regulation.
Keywords：Nicotiana tabacum L.;PR3b gene;low-nicotine mutant;alternative splicing;jasmonic acid;ethylene


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本文引用格式
赵雪, 王锋, 王文静, 刘晓峰, 卞士权, 刘艳华, 刘新民, 杜咏梅, 张忠锋, 张洪博. 烟草PR3b转录后剪切元件NRSE1与GUS融合表达后的可变剪切[J]. 中国农业科学, 2020, 53(8): 1524-1531 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.08.003
ZHAO Xue, WANG Feng, WANG WenJing, LIU XiaoFeng, BIAN ShiQuan, LIU YanHua, LIU XinMin, DU YongMei, ZHANG ZhongFeng, ZHANG HongBo. Splicing Property Analyses of the NRSE1 Element from Tobacco PR3b mRNA After Fusion Expression with GUS Gene[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2020, 53(8): 1524-1531 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.08.003

0 引言

【研究意义】烟草病程相关基因PR3b存在转录后的可变剪切现象^[1,2,3,4,5],因PR3b的可变剪切与烟碱代谢相关,研究PR3b mRNA中可变剪切元件（nicotine- synthesis related splicing element 1,NRSE1）的分子剪切特性,对揭示低烟碱突变体遗传位点nic1和nic2对应基因的分子调控机制有重要价值。【前人研究进展】烟碱吡咯烷环的合成起始于鸟氨酸和精氨酸,由精氨酸脱羧酶（arginine decarboxylase,ADC）^[6,7]、鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase,ODC）^[8]、N-甲基腐胺转移酶（putrescine N-methyltransferase,PMT）^[9,10,11]、N-甲基腐胺氧化酶（N-methylputrescine oxidase,MPO）^[12]等催化酶的作用合成;烟碱吡啶环的合成起始于天冬氨酸,由天冬氨酸氧化酶（aspartate oxidase,AO）、喹啉酸合酶（quinolinate synthase,QS）、喹啉酸核糖转移酶（quinolinate phosphoribosyltransferase,QPT）^[13]等催化酶的作用合成^[14]。然后,吡咯烷环和吡啶环在异黄酮还原酶（isoflavone reductase-like,A622）^[15,16]和小檗碱桥接酶家族成员（berberine bridge enzyme- like,BBL）^[17]的作用下合成烟碱。对Burley 21烟草的低烟碱突变体研究表明,低烟碱突变体的烟碱合成由2个非连锁遗传位点NIC1和NIC2控制^[18,19],这两个遗传位点对应的突变体分别命名为nic1或nic2,含有这两个位点的纯合突变体命名为nic1/nic2^[20]。烟草植株中的烟碱合成主要在根部进行,其合成过程受到植物激素的调控。据报道,烟碱的生物合成受到茉莉酸（JA）、生长素（Auxin）和乙烯（ET）等植物激素的调控,JA能够诱导烟碱合成相关酶基因的表达,进而促进烟碱的合成^[21,22,23];Auxin和ET能够抑制烟碱合成相关酶基因的表达,进而抑制烟碱的合成。乙烯应答因子（ERFs）是植物特有的转录因子家族,在植物病害抗性、胁迫应答^[25]、次生代谢等方面发挥重要调控作用^{[26,27,28,29,30]}。在植物病害抗性调控中,ERF转录因子通过结合病程相关蛋白（PR）基因启动子区域的GCC-box顺式元件发挥调控作用^[31,32]。同时,ERF转录因子也参与了JA/ET信号传导和烟碱合成相关基因的转录调控^[24]。研究发现,烟草NIC2位点含有一个ERF转录因子簇^[33],表明NIC位点可能具有广泛的调控功能。SHOJI等^[24]研究发现,Burley 21的烟碱突变体在逆境胁迫和JA/ET诱导的烟碱合成及抗逆相关基因表达方面均与野生型存在明显差异,nic1/nic2突变体中的抗病相关基因表达水平比野生型烟草有所下降^[34]。这些研究表明烟草抗病相关基因的表达与烟碱合成具有重要关联。【本研究切入点】前期研究发现烟草PR3b在NIC1和NIC2基因座的突变体中存在转录后可变剪切现象,并导致了65 bp核苷酸的缺失,在PR3b的mRNA编码区引入了一个提前终止密码子,从而改变了PR3b的酶活性^[5],但其mRNA可变剪切元件的作用机制还未得到深入研究。【拟解决的关键问题】本研究构建了PR3b可变剪切元件NRSE1与GUS的融合表达载体,并培育了低烟碱突变体和野生型烟草的转基因植株,在鉴定出阳性植株后,通过RT-PCR检测分析了可变剪切元件NRSE1在低烟碱突变体中独立于PR3b其他mRNA区段的分子剪切特征,并分析了JA/ET处理对转基因材料中的GUS活性影响,为分离其可变剪切调控因子,及进一步解析低烟碱突变体遗传位点的分子调控机制提供了重要分子基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

野生型（WT）和低烟碱突变体（nic1和nic2）烟草（Nicotiana tabacum L. cv. Burley 21）材料,在光照周期为14 h光照/10 h黑暗,室温为25℃的室内温室培养。

大肠杆菌（Escherichia coli）菌株DH5α和ccdB^r、根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株LBA4404及载体构建所需的Gateway克隆载体pENTR-D-TOPO和pBin-attR-GUS由中国农业科学院烟草研究所植物功能成分研究中心提供。反转录试剂盒、LA Taq DNA聚合酶购自TaKaRa有限公司;DNA分子标准、限制性内切酶、质粒提取及胶回收试剂盒购自生工生物工程（上海）有限公司;Gateway克隆所需的LR Clonase Ⅱ 酶购自美国Invitrogen公司

1.2 基因克隆与表达载体构建

根据烟草PR3b（NCBI基因序列号：Z11564）的cDNA序列,设计特异性扩增引物（5′-CACCATGGC AGCACCACAATGTCCTTTTC-3′和5′-ATTCCAAAG CATGACACCTC-3′）,从含有PR3b的cDNA序列载体中扩增目的片段,切胶回收后,将片段与pENTR-D- TOPO载体连接,转化DH5α,重组转化子做菌液PCR并测序鉴定出阳性克隆,提取质粒测序鉴定。随后,通过Gateway克隆方法将带有目的片段的pENTR-D- TOPO载体与pBin-attR-GUS载体在LR Clonase Ⅱ酶催化下进行体外重组,重组反应产物转化大肠杆菌后,用特异性引物（5′-GCATTCTACTTCTATTGCAG-3′和5′-TCAGGAAAAGGACATTGTG-3′）进行PCR扩增及测序鉴定,获得由2×35S启动子驱动的融合表达载体pBin-attR-NRSE1-GUS（图1）。

图1

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图1NRSE1元件与GUS融合载体的构建示意图

A：PR3b示意图以及可变剪切区65 bp碱基序列,剪切的第1个与后64个碱基间有4个碱基间隔;B：NRSE1元件与GUS的融合表达载体结构示意图
Fig. 1Schematic diagram of vector construction for the fusion of NRSE1 element and GUS gene

A: The diagram of PR3b gene and the alternative splicing region, and the first spliced base are separated by 4 bases from the left 64 bases; B: Structural diagram of the vector expressing the fusion of NRSE1 element and GUS gene

1.3 转基因植株的获得

将目的重组载体转化农杆菌菌株LBA4404,于28℃培养箱培养2 d后,进行菌落PCR鉴定获得阳性菌株;将阳性菌株接种于5 mL YEB液体培养基（含50 mg·L^-1 Kan + 50 mg·L^-1 Rif）,28℃培养2 d;然后,转接200 µL菌液接种于50 mL YEB液体培养基（含50 mg·L^-1 Kan + 50 mg·L^-1 Rif + 50 mg·L^-1 Str）,当菌体生长到OD₆₀₀值0.8时,离心收集菌体,用新鲜YEB 液体培养基重悬菌体,用于侵染烟草叶片外植体。所需外植体取自在25℃温室培养的野生型（WT）和低烟碱突变体材料（nic1和nic2）的无菌苗,在超净工作台中将无菌苗叶片剪成0.5 cm²的小块,置于上述菌液中侵染7 min;将侵染后的叶片转移至不含抗生素的MS固体培养基上,于28℃黑暗条件下进行2 d共培养,然后,转移至分化培养基（MS +1 mg·L^-1 6-BA + 500 mg·L^-1 CEF + 50 mg·L^-1 Kan）,在光照为5 000 lux、室温25℃、光周期为14 h光照/10 h黑暗的室内温室进行选择培养;4—6周后,待再生苗长到1 cm左右时,将其切下并转移至生根培养基（1/2MS + 0.1 mg·L^-1 NAA + 50 mg·L^-1 Kan + 500 mg·L^-1 CEF）上进行生根培养,待生根后转移至培养钵培养,并收获转基因植株种子。

1.4 转基因烟草植株的分子鉴定及GUS染色

为鉴定表达目的融合基因的转基因植株,用筛选培养基（1/2MS + 100 mg·L^-1 Kan）鉴定转基因植物的抗性幼苗,并用Trizol提取其总RNA,通过RT-PCR检测目的基因是否正常表达,并对RT-PCR产物进行测序验证。使用pBin-attR-NRSE1-GUS载体的非编码转录区段特异性引物（5′-GCATTCTACTTCTATTG CAG-3′）和NRSE1元件的序列特异性引物（5′-ACAT TAGCACTTGCTTTGGT-3′）进行RT-PCR扩增,扩增片段约300 bp。

在进行GUS染色时,分别剪取转基因烟草植株的叶片材料,放入含X-Gluc染色液（50 mmol·L^-1磷酸缓冲液（pH7.0）、5 mmol·L^-1亚铁氰化钾、0.1 % Triton X100和1.5 mmol·L^-1 X-Gluc）的离心管中,置于37℃培养箱染色24 h,随后,在70%的酒精中脱色后,观察转基因植株叶片变蓝的情况,并在体视显微镜下拍照。

1.5 NRSE1元件在转基因植株中的可变剪切分析

为检测NRSE1元件与GUS在烟草中融合表达后的可变剪切特性,用上述类似方法以筛选培养基（1/2MS + 100 mg·L^-1 Kan）鉴定转基因植物的抗性幼苗,并用Trizol提取其总RNA,通过RT-PCR扩增（NRSE1元件的序列特异引物5′-AGGAGG TGGAATCAGTGGACA-3′和GUS序列的特异引物5′-ATCCAG ACTGAATGCCCACAG-3′）可变剪切区段,并对RT-PCR扩增产物进行测序验证。烟草Actin内参基因的扩增引物为：5′-TGAGGATATTCA GCCACTCG-3′和5′-GCACCGATGGTAATCACTTG -3′。

1.6 乙烯和茉莉酸处理转基因植株的GUS活性及融合基因表达分析

取转基因烟草材料的叶片,分别喷施100 µmol·L^-1的乙烯利（ET）和100 µmol·L^-1的茉莉酸甲酯（MeJA）,并置于含浸水滤纸的培养皿中处理24 h。随后,剪取适宜大小的叶片材料以上述染色方法进行GUS活性检测,并在体视显微镜下拍照。同时,提取处理叶片的RNA,通过RT-PCR方法检测激素处理对NRSE1元件的分子剪切影响,并通过反转录实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析激素处理对GUS表达水平的影响。qRT-PCR使用Go Taq® qPCR Master Mix试剂盒（Promega）扩增,GUS扩增引物为5′-GAATGGTGAT TACCGACGAAAACG-3′和5′-CACCACTTGCAAAG TCCCGCTAGT-3′,内参基因Actin的扩增引物为：5′-CCACACAGGTGTGATGGTTG-3′和5′-GTGGCTA ACACCATCACCAG-3′。

2 结果

2.1 PR3b可变剪切元件NRSE1的GUS融合表达载体构建

为分析PR3b可变剪切元件NRSE1独立于PR3b其他mRNA区段的分子剪切机制,设计图1所示NRSE1与GUS的融合表达载体,用于转基因材料培育及可变剪切的分子检测。将PR3b中包含可变剪切区（65 bp）的一段300 bp目的基因片段克隆后,构建其与GUS的融合表达双元载体,并对目的载体进行测序鉴定,成功获得了可变剪切元件NRSE1与GUS的融合表达载体（图2）。随后,将构建好的目的载体导入农杆菌LBA4404,筛选抗性菌落并进行菌液PCR鉴定,获得含目的载体的阳性菌株。

图2

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图2重组质粒的菌液PCR鉴定

Marker为DNA分子量标准
Fig. 2PCR test of E. coli clones with recombination plasmids

Marker indicates DNA molecular standards


随后,通过叶盘转化法培育了NRSE1与GUS融合表达载体的低烟碱突变体（nic1和nic2）和野生型烟草转基因植株,通过Kan抗性筛选,获得每个材料的转基因株系7个以上。

2.2 转基因烟草的鉴定与GUS活性检测

获得NRSE1元件的GUS融合表达转基因植株后,对其T₁代种子进行了Kan抗性筛选,并进行了RT-PCR及GUS活性检测,以确定融合基因能够在T₁代植株中稳定表达。图3-A所示,为代表性阳性植株的RT-PCR鉴定结果,以载体非编码转录区段和NRSE1元件的序列特异引物可以从野生型和低烟碱突变体（nic1和nic2）烟草的转基因材料中扩增出约300 bp的目的融合基因表达片段,进一步的测序分析证明目的融合基因在转基因材料中成功表达。随后,利用筛选出的T₁代抗性幼苗,对NRSE1元件的GUS融合表达转基因材料进行了GUS活性检测。图3-B所示,为代表性阳性植株的GUS活性检测结果,野生型和低烟碱突变体（nic1和nic2）烟草的转基因材料叶片在GUS染色后,可以观察到X-Gluc反应后的蓝色产物,表明获得了表达目的融合基因的转基因材料。

图3

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图3转基因植株的鉴定

A：转基因植株的RT-PCR分子鉴定;B：转基因材料GUS染色鉴定。Ctrl为非转基因野生型烟草对照;WT⁺为转基因野生型烟草;nic1和nic2为低烟碱突变体转基因材料。PR3b-GUS表示PR3b的NRSE1元件与GUS融合表达
Fig. 3Identification of transgenic plants

A: Identification of transgenic plants by RT-PCR; B: Identification of transgenic plants by GUS staining. Ctrl indicates untransgenic wild type tobacco. WT⁺ indicates transgenic wild type tobacco; nic1 and nic2 indicate the transgenic plants of low-nicotine mutants. PR3b-GUS indicates the fusion of NRSE1 element and GUS gene

2.3 NRSE1元件与GUS融合表达后的可变剪切分析

分别提取野生型和低烟碱突变体（nic1和nic2）转基因材料的叶片总RNA,以目的融合基因序列为模板,进行RT-PCR扩增。电泳结果表明,野生型烟草的转基因材料中只能扩增出1条约300 bp的条带,而低烟碱突变体（nic1和nic2）的转基因材料中均能扩增出2条条带,一条约300 bp的条带和一条不足200 bp的条带（图4）。将扩增条带切胶回收后,测序发现约300 bp的条带为未剪切的扩增片段,而不足200 bp的条带为剪切后的扩增片段,剪切后的序列变化与前期观察到的结果一致（图4）。结果表明,PR3b的可变剪切元件NRSE1在与GUS融合表达后,仍能进行可变剪切,其可变剪切不依赖于PR3b其他区段的mRNA序列,为鉴定其可变剪切调控因子提供了重要信息。

图4

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图4PR3在nic1和nic2突变体转基因材料中的分子剪切

WT⁺为野生型转基因烟草,nic1和nic2为低烟碱突变体转基因材料,Ctrl为未转基因野生型烟草对照。NRSE1-GUS表示PR3b的NRSE1元件与GUS融合表达。星号为引物二聚体
Fig. 4Molecular splicing analysis of the fusion of NRSE1 element and GUS in nic1 and nic2 mutants

WT⁺ indicates transgenic wild type tobacco; nic1 and nic2 indicate the transgenic plants of low-nicotine mutants. Ctrl indicates untransgenic wild type tobacco. PR3b-GUS indicates the fusion of NRSE1 element and GUS gene. Asterisk indicates primer dimers

2.4 乙烯和茉莉酸处理对转基因材料GUS活性的影响分析

为分析乙烯和茉莉酸对融合基因翻译水平的可能影响,检测了NRSE1元件与GUS融合表达转基因植株在乙烯和茉莉酸处理后的GUS活性。未处理的野生型和低烟碱（nic1和nic2）转基因植株叶片在GUS染色后,均呈现深蓝色,但在乙烯和茉莉酸处理后,其染色程度出现了变化（图5-A）。乙烯处理后,除野生型转基因材料外,其他材料叶片的染色程度明显弱于未处理的对照材料;茉莉酸处理后,所有材料叶片的染色产物近于消失（图5-A）。随后,通过RT-PCR分析了乙烯和茉莉酸处理对融合基因在野生型和低烟碱（nic1和nic2）材料中的剪切模式影响,结果表明,乙烯和茉莉酸对NRSE1元件的转录后剪切有抑制作用（图5-B）。此外,还通过qRT-PCR检测了乙烯和茉莉酸处理后融合基因在野生型和低烟碱（nic1和nic2）材料中的表达情况,但没有发现明显的表达水平变化（图5-C）。推测乙烯和茉莉酸可能对融合基因的翻译有一定抑制作用。

图5

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图5乙烯（ET）和茉莉酸（JA）处理对转基因烟草的GUS活性影响

A：转基因烟草的GUS活性检测;B：融合表达基因的分子剪切分析,星号为引物二聚体;C：ET、JA处理后转基因植株的GUS基因相对表达量。WT⁺为转基因野生型烟草,nic1和nic2为转基因低烟碱突变体材料;Mock为未处理材料,ET和JA分别为乙烯和茉莉酸处理材料
Fig. 5Effects of ET and JA treatment on the GUS activities of transgenic tobacco plants

A: GUS activity of transgenic tobacco; B: Splicing analysis of the fusion of NRSE1 element and GUS. Asterisk indicates primer dimers; C: Relative expression of GUS gene after transgenic plants treated with ET and JA. WT⁺ indicates transgenic plant of wild type; nic1 and nic2 indicate transgenic plant of low-nicotine mutants. Mock indicates control treatment; ET and JA indicate ethylene and jasmonate treatment, respectively

3 讨论

基因的转录后剪切调控是一个非常有趣的科学问题。前期对低烟碱突变体nic1和nic2的研究,在抗病相关基因PR3b的mRNA中发现了一个与烟碱代谢关联的转录后可变剪切标记。这一剪切在PR3b的cDNA序列中引起65个碱基缺失,并提前引入了终止密码子,通过移码突变导致翻译提前终止改变了PR3b的酶活性^[5]。该现象表明烟碱代谢调控因子NIC1和NIC2参与了抗病相关基因的表达调控,并建立了烟碱代谢与病害抗性调控间的分子关联。深入研究PR3b基因mRNA的分子可变剪切机制,有助于鉴定其分子剪切调控蛋白,从而揭示烟碱代谢调控位点（NIC1和NIC2）与病害抗性间的分子调控通路。

本研究创制了NRSE1元件与GUS融合表达的低烟碱突变体（nic1和nic2）和野生型烟草转基因植株。以RT-PCR和GUS染色方法鉴定出阳性植株后,通过RT-PCR试验分析了NRSE1元件与GUS融合表达后的可变剪切特性。结果证明,NRSE1元件与GUS融合表达后,仍能在低烟碱突变体nic1和nic2中发生与前期发现一致的可变剪切现象,其在野生型烟草中无明显可变剪切发生。这一结果表明,NRSE1元件的可变剪切不依赖PR3b的其他区段mRNA序列。这一特性为后期利用可视报告蛋白（如GUS、LUC或GFP等）进行可变剪切调控因子鉴定提供了关键分子基础,对揭示烟碱代谢调控因子NIC1和NIC2的调控机制有重要帮助。

烟草中PR3b的mRNA可变剪切受到乙烯和茉莉酸的调控^[5],这一现象暗示存在一些受乙烯或茉莉酸诱导并与剪切区段相互作用的调控因子。本研究进一步通过GUS活性测定及表达特性分析,解析了乙烯和茉莉酸对NRSE1元件可变剪切的其他分子调控。研究结果表明,乙烯和茉莉酸处理改变了表达NRSE1元件与GUS融合基因的野生型和低烟碱（nic1和nic2）材料中的GUS活性。然而,乙烯和茉莉酸处理并不改变NRSE1元件原有的诱导剪切特性,也未对其与GUS融合基因的表达水平产生明显影响。从研究结果推测,乙烯和茉莉酸处理可能通过抑制NRSE1元件与GUS融合基因的翻译降低了转基因植株中的GUS活性,即存在翻译水平的调控作用。这些研究结果为NRSE1元件可变剪切调控因子的分离鉴定及作用机制研究提供了重要参考。

4 结论

烟草PR3b mRNA中NRSE1元件的可变剪切不依赖PR3b其他mRNA序列,在与GUS融合表达后仍能发生可变剪切,可利用其与报告基因的融合表达材料开展可变剪切因子筛选。乙烯和茉莉酸处理会改变表达NRSE1元件与GUS融合基因烟草中的GUS活性,但在转录水平未观察到明显变化,可能存在翻译水平的调控作用。

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