刘鹏, 田颖哲, 钟永嘉, 廖红^,福建农林大学资源与环境学院根系生物学研究中心,福州350002

Isolation and Application of Effective Rhizobium Strains in Peanut on Acidic Soils

LIU Peng, TIAN YingZhe, ZHONG YongJia, LIAO Hong^,Root Biology Center, College of Resources and Environment, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002

通讯作者: 廖红，E-mail：hliao@fafu.edu.cn

责任编辑: 李云霞
收稿日期:2019-03-25接受日期:2019-06-4网络出版日期:2019-10-01

基金资助:

国家重点研发计划项目.2016YFD0100700

Received:2019-03-25Accepted:2019-06-4Online:2019-10-01
作者简介 About authors
刘鹏,E-mail：448860600@qq.com。






摘要
【背景】 花生（Arachis hypogaea L.）是世界上重要的油料和经济作物。在我国南方产区,大部分花生种植地土壤为酸性。酸性土壤不仅pH值低、瘦瘠,而且还有低磷、铝毒等诸多障碍因素,严重限制了花生的生物固氮及产量。【目的】 本文旨在分离及应用适应酸性土壤的高效固氮根瘤菌,提高花生固氮效率及产量,改良酸性土壤。【方法】 利用平板划线结合镜检的方法,从田间采集的新鲜花生根瘤中分离纯化单菌落;通过PCR技术检测分离物中是否含有结瘤基因nodA和固氮基因nifH,进行根瘤菌的初步分子鉴定;再通过16S rRNA基因序列比对,对根瘤菌进行进一步分子鉴定。候选根瘤菌通过水培回接,检测其与花生的共生结瘤及固氮能力;再通过田间试验评价筛选出来的候选根瘤菌在酸性土壤上的应用效果。【结果】 本研究首先从不同酸性土壤种植区域的花生根瘤中分离、纯化得到256个分离物;其中10株含有nodA和nifH,初步确定为根瘤菌。经16S rRNA基因全长序列测定,发现8株为慢生型根瘤菌（Bradyrhizobium）,2株为根瘤菌属根瘤菌（Rhizobium）。水培回接试验发现,这10株根瘤菌均能够与花生共生、形成有效根瘤,证实是花生根瘤菌。在此基础上,选取4株固氮效率较高的根瘤菌,在酸性土壤上应用。结果表明,4株根瘤菌均能与花生在酸性土壤上形成根瘤,而未接种的花生根部不能形成根瘤。并且接种根瘤菌后显著改善了花生氮营养,提高了花生的生物量和产量。与不接种的对照相比,接种根瘤菌后,花生生物量、产量和氮含量分别提高了27.1%—38.0%、24.7%—104.2%和73.9%—151.3%。【结论】 本研究分离鉴定的花生根瘤菌能够高效固氮和适应酸性土壤,具有重要的应用前景。
关键词： 酸性土壤;花生;根瘤菌;生物固氮

Abstract
【Background】 Peanut (Arachis hypogaea L.) is an important oil and economic crop in the world. Most of the peanut cultivation soils in South China are acidic. Since low pH value, nutrition deficiencies and aluminium (Al) toxicity on acidic soils severely limit yield and biological nitrogen fixation (BNF) capacity in peanut. 【Objective】 The purpose of this paper is to isolate acidic soil adaptive rhizobium stains to improve BNF and yield of peanut, as well as to remediate acidic soils.【Method】 Firstly, strains were isolated and purified from fresh peanut nodules by collecting from the field by streak plate method combined with microscope observation, the nodulation gene nodA and nitrogen fixing gene nifH were detected by PCR to preliminary identification of potential Rhizobia strains, and then 16S rRNA sequencing was used for further taxonomy identification of the isolate strains. The symbiotic nodulation and nitrogen fixation ability of potential Rhizobium strains were validated by inoculation to the peanut under hydroponics conditions. Further, the candidate rhizobium strains in the field trial on acidic soils were evaluated. 【Result】 A total of 256 microbe strains were isolated and purified from nodules of peanuts grown in different sites on acidic soils. Based on the results of 16S rRNA sequencing analysis, ten of them contained nodA and nifH, and were initially identified as potential rhizobium. Of which, 8 strains belonged to Bradyrhizobium sp. and 2 belonged to Rhizobium sp. Hydroponic experiments further confirmed that the 10 strains could form functional nodules with peanuts. Subsequently, 4 strains with higher BNF capacity were selected for field evaluation on acidic soils. The results showed that all the 4 strains successfully formed functional nodules with peanuts in the field. On contrary, none of nodules could be formed in peanuts without rhizobium inoculation. Besides, Rhizobia inoculation significantly improved N nutrition, and increased biomass and yield of peanut. By comparison with CK plants, biomass, yield and N content of peanuts inoculated with rhizobium strains were increased by 27.1%-38.0%, 24.7%-104.2% and 73.9%-151.3%, respectively. 【Conclusion】 Taken together, the peanut Rhizobia isolated and identified in this study could fix N₂ effectively and adapted well to acidic soils, and therefore which had great application potentials.
Keywords：acidic soils;peanut;rhizobia;biological nitrogen fixation


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本文引用格式
刘鹏, 田颖哲, 钟永嘉, 廖红. 酸性土壤上花生高效根瘤菌的分离及应用[J]. 中国农业科学, 2019, 52(19): 3393-3403 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.19.010
LIU Peng, TIAN YingZhe, ZHONG YongJia, LIAO Hong. Isolation and Application of Effective Rhizobium Strains in Peanut on Acidic Soils[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2019, 52(19): 3393-3403 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.19.010

0 引言

【研究意义】花生（Arachis hypogaea L.）,豆科花生属,一年生草本植物,具有产量高、用途广、抗逆性强、经济效益好、营养价值高等特点,是世界上重要的油料和经济作物^[1]。花生作为豆科植物,能与根瘤菌共生形成根瘤进行生物固氮^[2],是农业生产上优良的轮作换茬和间套种作物,具有增加复种指数,改良土壤结构、肥地养地等农业生态功能^[3]。近年来,我国花生供需矛盾日益彰显,已成为全球花生的主要进口国之一^[4]。我国花生产区以长江流域为界,分为南方小花生区和北方大花生区^[5]。其中南方产区的土壤主要为酸性土壤。筛选适应酸性土壤的高效固氮根瘤菌,对提高南方花生产量,缓解我国花生供需矛盾及改良酸性土壤,具有重要的意义。【前人研究进展】研究表明,接种根瘤菌不仅能提高豆科作物的产量和品质,还能提高土壤微生物活性和多样性,提高土壤肥力^[6]。在国外,接种根瘤菌作为花生的主要栽培措施之一,已被大面积推广应用^[7]。在我国,接种根瘤菌在湖北、山东等地的花生生产上也有使用,但面积较小^[8]。接种根瘤菌对豆科作物生长的促进作用主要取决于根瘤菌与作物的匹配性和固氮能力^[9]。根瘤菌的生长与活性受土壤理化性质影响很大,北方豆科作物根瘤菌在南方酸性土壤适应性较差,田间接种效果不明显^[10,11]。因此,想要提高豆科作物根瘤菌的实际应用效果,需要筛选土壤中竞争力和固氮能力较强,适应范围较广的根瘤菌^[12]。【本研究切入点】酸性土壤不仅pH值低,而且土壤酸化加剧了盐基离子如Ca²⁺、Mg²⁺等的淋溶,促进了铝、锰等元素的释放,增强了磷的固定,造成氮、磷、钾等养分匮缺,对作物生长极为不利^[13]。此外,土壤酸化还会限制豆科植物结瘤固氮。据报道,土壤pH值低于5.0时,大部分豆科作物无法正常结瘤^[14]。在花生中,关于筛选适应酸性土壤的高效根瘤菌及应用鲜有报道。【拟解决的关键问题】本研究从来自酸性土壤上不同种植区域的花生根瘤中,分离纯化花生根瘤菌。通过水培回接和田间应用验证,筛选出适应酸性土壤的花生高效固氮根瘤菌,为配制适应酸性土壤的花生高效根瘤菌提供理论依据和应用材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试花生为闽花8号,福建农林大学油料作物所庄伟健教授惠赠。供试花生根瘤采自福建省安溪县龙涓乡（东经117.80°,北纬24.95°）、福建省福安市天香茶园（东经119.51°,北纬26.14°）、福建省尤溪县洋中（东经118.49°,北纬26.28°）。其中,安溪和福安采样点无花生种植历史,洋中采样点连年种植花生。田间试验在安溪县举源茶叶合作社茶园进行。土壤基本理化性质如表1。

Table 1
表1
表1各采样点土壤基本理化性质
Table 1Basic physiochemical properties of soils from different sampling sites

试验点 Site	pH	碱解氮Alkali-hydrolyzable nitrogen (mg·kg-1)	速效磷 Available phosphorus (mg·kg-1)	速效钾 Available potassium (mg·kg-1)	有机质 Organic matter (g·kg-1)
安溪 Anxi	5.10±0.16	128.98±30.33	5.05±0.16	50.61±9.38	13.2±1.1
福安 Fuan	4.22±0.17	86.93±12.50	105.49±32.37	106.33±14.78	19.6±6.0
洋中 Yangzhong	4.73±0.13	105.84±20.22	85.23±10.96	128.88±2.99	14.6±2.1
安溪茶园 Anxi tea garden	4.58±0.02	35.81±1.70	4.90±0.74	100.15±8.83	19.4±0.8

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1.2 土壤理化性质测定

土壤样品测定参照鲍士旦等方法^[15]。pH：电位法（土﹕水=1﹕2.5,质量比）;有机质：高温外加热重铬酸钾氧化-容量法;碱解氮：1 mmol?L^-1 NaOH碱解扩散法;有效磷：BrayⅠ提取-钼锑抗比色法;速效钾：乙酸铵浸提-火焰光度法。

1.3 根瘤菌分离纯化及分子鉴定

根瘤菌分离纯化：参考贾立敏等方法^[16]：挑取新鲜花生根瘤,用超纯水冲洗5—7遍,95%乙醇溶液处理2.5 min;0.2% HgCl₂溶液消毒5 min,无菌水冲洗5—7次。用无菌刀片将消毒根瘤切为两半,将根瘤切面在YMA培养基表面划线,倒置封好,28℃恒温培养。从第2天起,挑取单菌落继代培养,直至获得纯净单菌落。

菌落分子鉴定：参照毕江涛等及李永春等^[17,18]方法,利用nodA和nifH引物（表2）进行PCR扩增,1%凝胶电泳检测初筛。再用16S rRNA基因通用引物（表2）进行PCR扩增,对产物测序分析^[19,20]（上海铂尚生物技术有限公司）。

Table 2
表2
表2根瘤菌分析鉴定所用的PCR引物
Table 2PCR primers used for rhizobia identification

引物 Primer	引物序列 Primer sequence (5′-3′)	PCR反应体积 Reaction volume of PCR (μL)	产物大小 Product size (bp)	退火温度 Annealing temperature (℃)	参考文献 Reference
nifH-F	GTCATGTCYTCSAGYTCNTCCA	10	450	58	[17]
nifH-R	GCTTCCATGGTGATCGGGGT
nodA-F	TGCRGTGGARDCTRYGCTGGGAAA	10	750	56	[18]
nodA-R	GNCCGTCRTCRAASGTCARGTA
16S 27-F	AGAGTTTGATCMTGGCTCAG	25	1470	60	[19-20]
16S 1492-R	AGAGTTTGATCMTGGCTCAG

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扩增的反应体系（以10 μL为例）：2×Taq Mix酶5 μL,引物F/R（10 μmol·L^-1）各0.2 μL,菌液1 μL,无菌水补足至10 μL。PCR反应程序（表2）：95℃预变性5 min;94℃变性1 min,退火30 s,60℃延伸30 s,40循环;72℃延伸10 min,4℃保存PCR产物。取3 μL扩增产物在1.0%的琼脂糖进行凝胶电泳检测。

1.4 水培回接试验

低氮水培回接,营养液配方如下（g·L^-1）：Ca (NO₃)₂·4H₂O 0.03 g,MgSO₄·7H₂O 0.12 g,CaCl₂·2H₂O 0.10 g,KH₂PO₄ 0.10 g,Na₂HPO₄·12H₂O 0.15 g,C₆H₅O₇Fe·5H₂O 0.005 g,微量元素1 mL,蒸馏水1000 mL,pH 5.8—6.0。微量元素配方（g·L^-1）：H₂MoO₄ 0.02 g,MnSO₄ 1.81 g,H₃BO₃ 2.86 g,CuSO₄·5H₂O 0.8 g,ZnSO₄·7H₂O 0.22 g。

根瘤菌培养：将-80℃保存的根瘤菌菌株,划线并培养,后接种于YMA液体培养基培养,28℃,200 r/min,培养至菌液OD₆₀₀=1.2。

将胚根长至3—5 cm的花生幼苗浸泡在根瘤菌菌液2 h进行接种,再移至低氮营养液中,在生长室（日/夜：16 h/8 h,26℃/24℃）生长30 d。本试验包括分别接种10株不同根瘤菌与不接种处理,4个生物学重复,共44盆。收获后,测定植株生物量、结瘤数、含氮量和固氮酶活性等。参照艾文琴等^[21],利用乙炔还原法测定花生根瘤固氮酶活性。

1.5 田间试验

根瘤菌田间试验：在水培试验结果的基础上,选取固氮能力较强4株根瘤菌（AXLQ1-6,FAMB12-6,YZMB13-3和YZMO14-4）,在酸性土壤上进行田间试验,以不接种为对照。随机区组设计,3次重复,共15个小区。每小区长30 m、宽0.8 m,共24 m²。花生株行距为0.30 m×0.15 m,每小区种植花生400株。播种前施钙镁磷肥75 kg·hm^-2。杂草、病虫害控制等按照花生田间日常管理执行。在开花期和成熟期进行取样：种植45 d后（即开花期）,每根瘤菌菌种,每小区取代表性植株10株,共30株测定叶片SPAD值、地上部生物量、氮含量、根瘤个数等指标。种植110 d后（即成熟期）,进行小区测产。

1.6 数据处理

16S rRNA基因系统发育树构建：选取具有较高同源性、已发表根瘤菌序列为参比菌株序列,利用BioEdit软件对供试菌株和参比菌株序列进行16S rRNA基因序列的多序列自动比对,再利用Mega 7.0软件,采用Kimura-2参数,进行邻接法（Neighbor- Joining）分析,生成系统发育树。

试验中所有的数据均用Microsoft Excel 2014（Microsoft Company,美国）和SPSS 18.0（Statistical Product and Service Solutions,美国）等统计软件进行统计分析,用SigmaPlot 12.0（Systat Software,美国）进行作图。

2 结果

2.1 酸性土壤上花生根瘤菌的分离纯化与分子鉴定

利用平板划线法,从花生根瘤中共分离出256个分离物。利用nodA引物和nifH引物对菌液进行PCR目的片段扩增,1%凝胶电泳结果如图1所示。结瘤基因nodA PCR扩增产生750 bp左右的条带,固氮基因nifH扩增产生450 bp左右的条带。通过nodA和nifH PCR扩增检验,256个分离物中,有10个分离物同时含有nodA和nifH,初步预测这些菌株具有固氮结瘤潜力（图1）。

图1

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图1菌株nodA（A）和nifH（B）基因PCR扩增凝胶电泳图

1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11分别代表根瘤菌AXLQ1-6,AXLQ1-7,YZHO5-5,FAMB12-6,YZMB13-3,YZHO13-7,FAMB13-9,YZLH14-3,YZMO10-8,YZMO14-4,CK
Fig. 1Gel electrophoresis of nodA (A) and nifH (B) genes from PCR products of the bacterial strains

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 represent AXLQ1-6, AXLQ1-7, YZHO5-5, FAMB12-6, YZMB13-3, YZHO13-7, FAMB13-9, YZLH14-3, YZMO10-8, YZMO14-4, CK


将上述10株候选花生根瘤菌的16S rRNA基因序列,与从GenBank数据库中获取的6株参比菌株的序列,进行比对,构建系统发育树（图2）。从进化与发育关系来看,本研究获得的根瘤菌主要分为两大类,其中8株属于慢生型根瘤菌属（Bradyrhizobium）,2株属于根瘤菌属（Rhizobium leguminosarum）。8株慢生型根瘤菌,包括菌株YZMB13-3、AXLQ1-7、YZMO14-4、YZLH14-3、YZHO5-5、FAMB12-6、YZHO13-7、FAMB13-9与参比慢生型根瘤菌Bradyrhizobium SEMIA6396、Bradyrhizobium japonicun MN-139聚在一起。2株根瘤菌属根瘤菌,AXLQ1-6和YZMO10-8,与根瘤菌属的参比菌株Rhizobium sp. strain G2312和Rhizobium miluonense strain5502G聚在一起,说明了根瘤菌属和慢生根瘤菌属菌株都具有与花生共生形成根瘤的潜力。

2.2 根瘤菌在水培试验中与花生的结瘤固氮能力

将上述根瘤菌进行水培回接,检验其与花生共生结瘤及固氮的能力。结果表明,所有供试根瘤菌均能与花生共生形成根瘤,而不接种处理的花生植株不能形成根瘤。其中,接种处理每株花生平均结瘤数为11—39个（表3）。与对照相比,结瘤植株生物量、SPAD值变化不显著,但大部分植株含氮量显著增加,高于对照43.2%—507.7%（表3）。表明本研究分离鉴定的10株根瘤菌,确实具有与花生共生,形成根瘤以及固氮的能力。

Table 3
表3
表3水培试验中接种不同根瘤菌对花生结瘤及生长的影响
Table 3Effects of inoculation with different Rhizobium stains on peanut nodulation and growth in hydroponic experiments

根瘤菌 Strain of rhizobia	根瘤数 Nodule number (NO./plant)	生物量 Biomass (g/plant)	SPAD值 SPAD value	含氮量 N content (mg/plant)
CK	0	0.62±0.06	18.83±3.88	8.45±0.74
AXLQ1-6	23±6	0.67±0.18	26.53±1.96**	51.35±1.37***
AXLQ1-7	39±8	0.65±0.24	25.93±2.89*	14.11±0.53*
YZHO5-5	18±3	0.59±0.00	24.07±1.43*	25.99±2.74**
YZMO10-8	21±6	0.63±0.17	27.80±2.26**	12.10±1.90*
FAMB12-6	11±1	0.60±0.30	22.73±1.95*	17.35±1.22**
YZMB13-3	18±4	0.67±0.05	25.43±5.06*	25.06±6.43**
YZHO13-7	19±7	0.54±0.13	20.87±3.55	20.33±3.33**
FAMB13-9	28±6	0.51±0.11	19.60±4.44	19.89±5.30**
YZLH14-3	16±8	0.61±0.15	24.53±4.65	28.16±3.24**
YZMO14-4	22±5	0.69±0.19	23.60±4.16	13.40±0.98*

The data in the table were the mean ± standard error (n=4). *, **, *** present the significant differences between inoculated with and without rhizobium stain through Student t-test for the same trait at 0.01<P<0.05, 0.001<P<0.01 and P<0.001 level, respectively
表中的数据为 4次重复的平均值及其标准误差。*表示同一性状接种根瘤菌植株与对照的Student t 检验结果。*：0.01<P<0.05;**：0.001<P<0.01;***：P<0.001

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根瘤固氮酶活性测定结果表明,所有供试根瘤菌与花生形成的根瘤,均具有固氮酶活性。但不同根瘤菌所形成的根瘤,固氮酶活性差异显著。最高可达28 μmol (C₂H₄ )·g^-1(FW)·h^-1,最低仅为0.3 μmol (C₂H₄ )·g^-1(FW)·h^-1（图3）,差异近100倍,说明了不同的花生根瘤菌之间的固氮能力差异明显。

图3

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图3水培试验中不同根瘤菌固氮酶活性比较分析

图中的数据为 3 次重复的平均值及其标准误差。***：单因素方差分析差异极显著,P<0.001。不同小写字母表示不同根瘤菌处理间差异达 0.05 显著水平
Fig. 3Comparative analysis on nitrogenase activity of different rhizobia in the hydroponic experiment

The data in the figure were the mean ± standard error (n=3). ***: Significant at P<0.001 level through One-way ANOVA. Different letters indicated significantly different among different rhizobium strain at 0.05 level

2.3 花生高效根瘤菌在酸性土壤上田间应用效果

在水培试验结果的基础上,选取4株固氮酶活性较高的根瘤菌进行大田应用。结果表明,所选的4株根瘤菌在田间都能与花生正常结瘤,并促进花生生长（表4）。供试根瘤菌在酸性土壤上,与花生具有较强共生结瘤能力。表现在接种后不仅结瘤率100%,而且单株结瘤数高达69—195个（表4）,不接种的对照植株不能形成根瘤。此外,接种不同根瘤菌均能显著促进花生生长、提高花生植株生物量。接种后所形成的根瘤固氮酶活性在1.8—6.0 μmol C₂H₄·g^-1·h^-1 之间。其中,来自低氮土壤的根瘤菌FAMB12-6固氮酶活性较高,而筛选自高氮土壤的根瘤菌AXLQ1-6固氮酶活性较低（表1,图4）。与对照相比,接种4种不同根瘤菌,分别提高了花生生物量33.6%、37.7%、38.0%和27.1%（表4）。

Table 4
表4
表4田间接种不同根瘤菌对花生结瘤及生长的影响
Table 4Effects of inoculation with different rhizobium stains on peanut nodulation and growth in field trails

根瘤菌 Species of rhizobia	根瘤数 Nodule number (NO./plant)	生物量 Biomass (g/plant)	SPAD值 SPAD value	植株含氮量 Nitrogen content (g/plant)	产量 Yield (g/plant)	单株荚数 Pod number (NO./plant)
CK	0b	24.12±1.40b	37.97±2.71b	0.27±0.03c	19.02±1.48d	15.14±0.81c
AXLQ1-6	98.20±47.66a	32.23±1.03a	47.10±3.78a	0.47±0.03b	31.50±1.99b	22.50±1.00b
FAMB12-6	146.80±40.39a	33.21±2.61a	46.38±1.23a	0.58±0.08b	38.84±3.57a	28.71±1.91a
YZMB13-3	194.50±35.40a	33.28±2.10a	48.88±1.56a	0.70±0.07a	29.41±0.84b	26.38±1.11a
YZMO14-4	68.70±17.57a	30.66±1.72a	46.24±2.41a	0.48±0.04b	25.25±1.23c	27.25±1.01a

The data in the table were mean ± standard error (n=30). Different letters indicated significantly different at 0.05 level
表中的数据为 30株苗的平均值及其标准误差。同列数据后不同小写字母表示处理间差异达0.05显著水平

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图4

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图4田间试验中不同根瘤菌的固氮酶活性比较分析

图中的数据为 10 次重复的平均值及其标准误差。***：单因素方差分析差异极显著,P<0.001。不同字母表示不同根瘤菌处理间差异达 0.05 显著水平
Fig. 4Comparative analysis on nitrogenase activity of different rhizobia in the field trials

Each bar was the mean ± standard error (n=10). ***: significant at P<0.001 level through One-way ANOVA. Different letters indicated significantly different among different rhizobium strain at 0.05 level


此外,接种根瘤菌显著改善了花生氮营养、提高花生产量。SPAD值是衡量植株叶绿素含量的重要指标,SPAD值的高低可间接体现植物氮营养的高低。接种根瘤菌显著提高了花生叶片的SPAD值,其中接种根瘤菌YZMB13-3,对花生SPAD值提高较为明显,提高了28.7%（表4,图5）。与对照相比,接种根瘤菌显著改善了花生氮营养。尤其是接种YZMB13-3后,植株氮含量增加了151.0%（表4,图5）。接种根瘤菌后,花生产量也显著增加。接种根瘤菌FAMB12-6对花生增产最为明显,增幅为104.2%（表4,图5）。接种根瘤菌促进花生增产主要原因为增加单株结荚数（表4,图5）。

图5

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图5酸性土壤条件下接种YZMB13-3根瘤菌对花生生长的影响

Fig. 5Effects of inoculation with YZMB13-3 rhizobium stains on peanut growth on acidic soils

3 讨论

3.1 酸性土壤上花生根瘤菌的发现及意义

我国南方土壤主要为酸性土壤,南方土壤由于自然发育、酸沉降、淋溶作用造成土壤pH值低,且土壤中可供植物利用的氮、磷、钾、镁等元素严重缺乏,不利于作物生长^[22]。已有研究发现,接种根瘤菌可显著提高豆科作物的抗逆性,还可提高土壤养分利用率^[18]。因此在酸性土壤上种植花生,在选择耐酸性花生种质的同时,还要利用适应酸性土壤和花生匹配的花生根瘤菌^[23]。接种花生根瘤菌作为提高花生产量的重要策略,在20世纪60年代已有报道^[24]。但是国内大部分的研究主要集中在华北、华中以及西北地区的花生根瘤菌,但对华南地区酸性土壤花生根瘤菌的研究较为少见^[25]。本研究在连续种植以及未种植花生的华南地区酸性土壤上,利用田间、盆栽的方式通过分离、鉴定得到具有结瘤固氮功能的花生根瘤菌（表1,图2）。与之前报道的筛选自中性或碱性土壤的花生根瘤菌相比,具有耐酸的特性。同时本研究利用了多个花生品种对花生根瘤菌进行捕捉,利用水培与田间试验对根瘤菌进行根瘤固氮能力的筛选,最终得到固氮效率高、竞争力强和适应性广的花生根瘤菌（表3,表4,图4）。本研究分离得到的花生根瘤菌应用于南方酸性土壤中不仅可以改善宿主植株的氮营养,还可以提高花生产量,提高土壤氮素,培肥地力,减少肥料应用,改善生态环境,具有重要的应用前景。

图2

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图2根瘤菌系统发育树

①慢生型根瘤菌属,②根瘤菌属,③葡萄球菌属。各参比菌株后面括号里是 16S rRNA 基因全序列在基因库中的登录号
Fig. 2Phylogenetic tree of the rhizobium strains

①, ② and ③ represent Bradyrhizobium, Rhizobium and Staphylococcus, respectively. The number in the bracket was the 16S rRNA accession number of each reference stain in GenBank

3.2 花生根瘤菌的宿主范围及土壤适应性

根瘤菌属于革兰氏阴性细菌,在土壤中分布广泛。有报道指出,根瘤菌受环境胁迫和宿主植株选择的影响,向着不同方向进化,经过长期的演变与进化形成表型和遗传基因的高度多样性^[26]。细菌是一种生命活体,对生存环境的要求比较高。因此,不同的根瘤菌在不同土壤的生长状况也不尽相同。据报道,一般根瘤菌在中性或中碱性的土壤中结瘤固氮效果最好,而在酸性土壤中效果较差^[27]。田间试验结果表明,本研究筛选到的花生根瘤菌在土壤pH为5.1时,还能正常结瘤固氮、促进花生植株生长（表4,图5）,说明其具有较好的适应酸性土壤的能力。究其原因,本研究在筛选根瘤菌时,同时兼顾到根瘤菌土壤环境和宿主种类两个方面。在土壤环境方面,根瘤菌来自pH值为4.2—5.1的3种典型酸性土壤,氮磷含量差异较大的土壤类型,以及不同的花生种植历史。本研究所得菌株可初步划分为根瘤菌属和慢生型根瘤菌属。与刘璐等人研究发现的结果相一致,豆科植物长期共生的根瘤菌具有高度区域特异性^[28]。本研究中有6株根瘤菌菌株主要来自洋中（图2）,说明相对其他的取样地点（安溪、福安）长期种植花生的洋中土壤中,花生土著根瘤菌可能具有较高的丰富度。因此,获得的花生根瘤菌类型较广泛,可以应对不同的环境类型。根瘤固氮酶活性受土壤含氮量影响较大,土壤的含氮量较高,根瘤菌的固氮酶活性受到抑制^[29]。如本研究田间试验中,由福安较低含氮量的土壤筛选到的根瘤菌表现较高固氮酶活性,而筛选自安溪含氮量较高的土壤的根瘤菌则固氮酶活性较低（表1,图4）。并且,来自于洋中的根瘤菌YZMB13-3所形成根瘤最多,可能为当地的优势菌株,竞争能力较强（表4）。

在宿主方面,为了提高研究分离得到的根瘤菌菌株具有较广宿主适应性,本研究采用来自18种不同花生的根瘤作为根瘤菌的来源。此外,田间应用的根瘤菌菌株是通过分子鉴定和水培回接试验的层层筛选,选取固氮酶活性较高的菌株,具有较强的固氮效率。因此,本研究所获得的根瘤菌,具有可以适应酸性土壤、宿主范围广和固氮效率较高的特点。

3.3 花生高效根瘤菌在酸性土壤上的应用前景

氮是植物生长必需大量营养元素之一,植物生长对氮的需要量较大。氮素供应是农业生产上限制作物产量的重要因素之一。花生属豆科植物,花生与花生根瘤菌通过有效的共生固氮作用可为提供花生整个生育期所需氮素的50%以上^[30]。本研究结果表明,接种花生根瘤菌可以显著提高花生植株生物量,增强花生对酸性土壤的适应性。这一结果和目前许多报道通过接种根瘤菌提高宿主植物的耐受逆境的能力是一致的。例如,接种根瘤菌或者其他微生物可以显著提高宿主植物对逆境的适应,比如盐碱,干旱等^{[29, 31-32]}。并且程凤娴等在研究中发现,接种根瘤菌不仅增加了大豆植株氮含量,也增加了植株磷含量^[23]。可见,接种根瘤菌也可促进豆科作物对其他的养分吸收,从而提高产量。这与本研究发现一致,在酸性土壤上接种根瘤菌,不仅可以通过生物固氮为花生提供氮素,还可促进花生的生殖生长（单株结荚数显著增加,表4）。

目前,我国土壤酸化越来越严重。以福建省为例,其耕地土壤酸化面积占总面积66.47%^[33]。铝毒、低磷、低氮是酸性土壤上限制豆科作物产量的重要因素。在农业生产上,需要施加大量的复合肥来提高土壤的氮、磷养分水平,这也是造成土壤进一步酸化,破坏自然生态的主要原因^[34]。此外,酸性土壤地区豆科作物种植比较少,土壤中土著根瘤菌丰度较低。人工接种根瘤菌是提高豆科作物固氮能力和产量主要措施之一^[35]。本研究结果表明,在未种植过花生的酸性土壤上,如果不接种根瘤菌,花生基本没有根瘤,进一步说明酸性土壤中能与花生匹配共生的根瘤菌非常少。接种根瘤菌后,不仅能够形成具有固氮功能的根瘤,还能促进花生生长,显著提高花生生物量以及植株含氮量,最终增加花生产量（表4,图5）。说明接种高效根瘤菌确实是提高花生对酸性土壤的适应性,最终提高花生产量的有效措施。

4 结论

本研究分离、纯化并鉴定了酸性土壤上的10株花生高效根瘤菌。这些根瘤菌分别属于慢生型根瘤菌与根瘤菌属根瘤菌;在水培条件下,与花生共生,形成具有高效固氮的根瘤;进一步选取4株结瘤固氮能力较强的根瘤菌进行田间试验,发现这些高效根瘤菌都能显著促进酸性土壤上花生的生长,可分别提高花生生物量、产量和含氮量27.1%—38.0%、24.7%—104.2%和73.9%—151.3%。因此本研究分离鉴定的花生根瘤菌能够适应酸性土壤和高效固氮,具有重要的应用前景。

参考文献 View Option 原文顺序
文献年度倒序
文中引用次数倒序
被引期刊影响因子

[1] 蔡长久 . 农民稳增收的大田作物—花生
农村实用科技信息, 2005,10(3):8-9.
[本文引用: 1]

CAI C J . Field crops for farmers' steady income increase—peanut
Rural Practical Science and Technology Information, 2005,10(3):8-9. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[2] 杨江科, 谢福莉, 周俊初 . 江汉平原及其周边地区花生根瘤菌的遗传多样性
生态学报, 2003,23(3):504-511.
Magsci [本文引用: 1]
采用 RAPD分析技术和 1 6S- 2 3S r RNA间隔区段 (IGS) RFLP分析 ,分别对分离自江汉平原及其周缘地区的花生根瘤菌进行了遗传多样性和系统发育研究。结果表明 ,全部供试菌株分别在 48%和 50 %的相似性水平分为 I、II两群。供试花生根瘤菌与参比菌株 B. japonicum和 B. elkanii聚在群 I,参比菌株Rhizobium Sinorhizobium、Mesorhizobium和 Agrobacterium聚在群 。供试花生根瘤菌的遗传多样性及其在系统发育中的地位主要受地域因素的影响 ,来自江汉平原中心地带天门和潜江的菌株在 76%以上的相似性水平上聚在一起。处于周边地带的武汉和荆州 ,由于其特定的地理因素的影响 ,菌株的多样性更为丰富 ,部分菌株在分类上与其它地域的菌株相互融合 ,并在较高的相似水平存在一定摆动性。来自外缘随州的菌株 ,表现了明显的地理分隔作用 ,其在系统演化中的地位相对独立。总体上从平原腹地到外缘地区 ,根瘤菌地理分隔作用逐渐明显 ,在平原外缘的交接地带 ,根瘤菌的多样性最为丰富。
YANG J K, XIE F L, ZHOU J C . Genetic diversity of peanut rhizobia isolated from in Jianghan Plain and the adjacent areas.
Journal of Ecology, 2003,23(3):504-511. (in Chinese)
Magsci [本文引用: 1]
采用 RAPD分析技术和 1 6S- 2 3S r RNA间隔区段 (IGS) RFLP分析 ,分别对分离自江汉平原及其周缘地区的花生根瘤菌进行了遗传多样性和系统发育研究。结果表明 ,全部供试菌株分别在 48%和 50 %的相似性水平分为 I、II两群。供试花生根瘤菌与参比菌株 B. japonicum和 B. elkanii聚在群 I,参比菌株Rhizobium Sinorhizobium、Mesorhizobium和 Agrobacterium聚在群 。供试花生根瘤菌的遗传多样性及其在系统发育中的地位主要受地域因素的影响 ,来自江汉平原中心地带天门和潜江的菌株在 76%以上的相似性水平上聚在一起。处于周边地带的武汉和荆州 ,由于其特定的地理因素的影响 ,菌株的多样性更为丰富 ,部分菌株在分类上与其它地域的菌株相互融合 ,并在较高的相似水平存在一定摆动性。来自外缘随州的菌株 ,表现了明显的地理分隔作用 ,其在系统演化中的地位相对独立。总体上从平原腹地到外缘地区 ,根瘤菌地理分隔作用逐渐明显 ,在平原外缘的交接地带 ,根瘤菌的多样性最为丰富。

[3] 姚瑞林 . 花生根瘤菌的应用技术及其肥效
花生学报, 1989,3(4):15-17.
[本文引用: 1]

YAO R L . Application technology and fertilizer efficiency of peanut Rhizobium
Journal of Peanut Science, 1989,3(4):15-17. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[4] 农业部经济与经济信息司. 2016年我国花生市场运行情况及2017年市场展望
[N]. 中国粮食信息网,2017 , 2017-01-24.
[本文引用: 1]

Department of Economic and Economic Information,Ministry of Agriculture. Peanut Market Operation in 2016 and Market Prospect in 2017
[N]. China National Grain Information Center, 2017, 2017-01- 24. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[5] 张怡 . 中国花生生产布局变动解析
中国农村经济, 2014, 11(2): 73-82+95.
[本文引用: 1]

ZHANG Y, . Analysis on the change of peanut production distribution in China
Chinese Rural Economy, 2014, 11(2): 73-82+95.(in Chinese)
[本文引用: 1]

[6] 韩华君, 张磊, 谢德体 . 耐酸苜蓿根瘤菌在酸性黄壤中的定殖研究
西南农业大学学报(自然科学版), 2006,28(5):722-726.
[本文引用: 1]

HAN H J, ZHANG L, XIE D T . Dynamics of root colonization of acid-tolerant Rhizobium meliloti strains in an acid yellow soil.
Journal of Southwest Agricultural University (Natural Science Edition), 2006,28(5):722-726. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[7] 朱增改, 张文敏 . 花生根瘤菌剂及促生菌剂使用方法研究
土壤肥料, 2004,1(2):45-46.
[本文引用: 1]

ZHU Z G, ZHANG W M . Study on the application of peanut Rhizobium agent and growth promoting agent.
Journal of Soil and Fertilizer, 2004,1(2):45-46. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[8] 崔玉兰 . 不同根瘤菌剂对花生生长及产量的影响研究
现代农村科技, 2013,14(5):62-63.
[本文引用: 1]

CUI Y L . Effects of different Rhizobium agents on peanut growth and yield
Journal of Modern Rural Science and Technology, 2013,14(5):62-63. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[9] 吴海燕, 刘春光, 张桂芝 . 花生根瘤菌高效菌株的筛选及固氮效应的研究 Ⅱ.花生根瘤菌高效菌株的筛选及固氮效应田间试验
吉林农业科学, 2004,29(4):28-34.
[本文引用: 1]

WU H Y, LIU C G, ZHANG G Z . Screening of high efficient Rhizobium strains and study on nitrogen fixation effect of peanut Rhizobium II. screening of high efficient Rhizobium strains and field test of nitrogen fixation effect.
Journal of Jilin Agricultural Sciences, 2004,29(4):28-34. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[10] 王晶, 许修宏 . 根瘤菌与大豆在不同类型土壤中的生态适应性研究
中国土壤与肥料, 2009,5(5):72-76.
[本文引用: 1]

WANG J, XU X H . Eco-adaptability of Rhizobium and soybean in different soils.
Soils and Fertilizers Sciences in China, 2009,5(5):72-76. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[11] 杨江科 . pH对土壤中土著快、慢生大豆根瘤菌结瘤的影响
应用生态学报, 2001,12(4):639-640.
[本文引用: 1]

YANG J K . Effect of pH on nodulation of fast-growing and slow-growing soybean Rhizobium in soil.
Journal of Applied Ecology, 2001,12(4):639-640. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[12] 张艳华 . 辽宁省花生根瘤菌的系统发育及应用研究
[D]. 沈阳: 沈阳农业大学, 2016.
[本文引用: 1]

ZHANG Y H . Phylogeny and application of peanut Rhizobium in Liaoning Province
[D]. Shenyang: Shenyang Agricultural University, 2016. ( in Chinese)
[本文引用: 1]

[13] 徐根娣, 刘鹏, 许敏 . 铝胁迫对大豆同工酶的影响
湖北农业科学, 2005,5(29):85-88.
[本文引用: 1]

XU G D, LIU P, XU M . Effects of aluminum stress on soybean isozymes
Hubei Agricultural Sciences, 2005,5(29):85-88. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[14] 吴甫成, 彭世良, 王晓燕 . 酸沉降影响下近20年来衡山土壤酸化研究
土壤学报, 2005,42(2):219-224.
[本文引用: 1]

WU P C, PENG S L, WANG X Y . Soil acidification in Hengshan in the past 20 years under the influence of acid deposition
Journal of Soil Science, 2005,42(2):219-224. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[15] 鲍士旦 . 土壤农化分析. 北京: 中国农业出版社, 2000: 30-107.
[本文引用: 1]

BAO S D. Soil Agricultural Chemistry Analysis. Beijing: China Agricultural Press, 2000: 30-107. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[16] 贾立敏, 蔡扩军, 李爱巧 . 牛圈舍空气中放射根瘤菌的分离鉴定
新疆畜牧业, 2017,4(7):25-26.
[本文引用: 1]

JIA L M, CAI K J, LI A Q . Isolation and identification of radiorhizobium in the air of cowshed
Journal of Xinjiang Xumuye, 2017,4(7):25-26. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[17] 毕江涛, 贺达汉, 谢瑞梅, 韦革宏 . 沙冬青根瘤菌结瘤基因nodA PCR-RFLP分析
中国沙漠, 2009,29(4):703-710.
Magsci [本文引用: 1]
<FONT face=Verdana>利用结瘤基因nodA PCR-RFLP和nodA PCR产物序列分析技术,对36株分离自沙冬青根瘤菌菌株的共同结瘤基因nodA进行了遗传类型和系统发育关系分析。试验结果表明,36株根瘤菌nodA PCR-RFLP分析显示在80%的相似水平上聚为两个类群5个亚群;选取不同基因型代表菌株的nodA进行序列测定和系统发育关系分析表明,测试菌株CCNWNX0117、CCNWNX0068、CCNWNX0083、CCNWNX0062、CCNWNX0058与中慢生根瘤菌聚在一起,系统发育地位相近;测试菌株CCNWNX0089、CCNWNX0081、CCNWNX0064与中华根瘤菌聚在一起,有较高的序列相似性。本研究中nodA基因所揭示的沙冬青根瘤菌遗传多样性和系统发育关系说明沙冬青根瘤菌nodA基因遗传多样性较高,宿主结瘤范围较宽。</FONT>
BI J T, HE D H, XIE R M, WEI G H . PCR-RFLP analysis of nodulation gene nodA of Rhizobia from Ammopiptanthus mongolicus
Journal of Desert Research, 2009,29(4):703-710. (in Chinese)
Magsci [本文引用: 1]
<FONT face=Verdana>利用结瘤基因nodA PCR-RFLP和nodA PCR产物序列分析技术,对36株分离自沙冬青根瘤菌菌株的共同结瘤基因nodA进行了遗传类型和系统发育关系分析。试验结果表明,36株根瘤菌nodA PCR-RFLP分析显示在80%的相似水平上聚为两个类群5个亚群;选取不同基因型代表菌株的nodA进行序列测定和系统发育关系分析表明,测试菌株CCNWNX0117、CCNWNX0068、CCNWNX0083、CCNWNX0062、CCNWNX0058与中慢生根瘤菌聚在一起,系统发育地位相近;测试菌株CCNWNX0089、CCNWNX0081、CCNWNX0064与中华根瘤菌聚在一起,有较高的序列相似性。本研究中nodA基因所揭示的沙冬青根瘤菌遗传多样性和系统发育关系说明沙冬青根瘤菌nodA基因遗传多样性较高,宿主结瘤范围较宽。</FONT>

[18] 李永春, 孔令如, 王焱, 孔文尧, 杨统一, 邹爱兰, 戚金亮, 杨永华 . 酸性土壤中大豆优势根瘤菌的分离、鉴定及其生物学特性
中国油料作物学报, 2011,33(4):384-390.
Magsci [本文引用: 2]
从两个酸性土壤生态实验点（江西鹰潭、浙江金华）种植的不同大豆品种根瘤中，分离纯化出29个分离物，并对其进行了分子鉴定和生物学特性分析。从其中16个分离物中扩增出nifH基因，测序分析结果表明，分离纯化出的菌株主要为慢生根瘤(Bradyrhizobium)属的菌株。10个分离自浙江金华的菌株，在大豆品种之间的种属差异并不大。在6个分离自江西鹰潭的菌株中，耐铝和敏感的大豆品种根瘤菌株存在明显的基因型差异。通过基于nifH 基因的系统发育分析选取代表性菌株，并进行16S rDNA序列测定和菌株回接结瘤实验，进一步明确和验证了其种属特性。同时，对经过初筛能结瘤的4株根瘤菌进行了生长曲线和生理生化特性的测定。本文结果表明在酸性土壤中，优势根瘤菌的地域差异性。 <BR><BR><BR><BR>
LI Y C, KONG L R, WANG Y, KONG W Y, YANG T Y, ZOU A L, QI J L, YANG Y H . Isolation, identification and biological characteristics of Predominant rhizobia associated with soybean in acidic soil
Chinese Journal of Oil Crop Sciences, 2011,33(4):384-390. (in Chinese)
Magsci [本文引用: 2]
从两个酸性土壤生态实验点（江西鹰潭、浙江金华）种植的不同大豆品种根瘤中，分离纯化出29个分离物，并对其进行了分子鉴定和生物学特性分析。从其中16个分离物中扩增出nifH基因，测序分析结果表明，分离纯化出的菌株主要为慢生根瘤(Bradyrhizobium)属的菌株。10个分离自浙江金华的菌株，在大豆品种之间的种属差异并不大。在6个分离自江西鹰潭的菌株中，耐铝和敏感的大豆品种根瘤菌株存在明显的基因型差异。通过基于nifH 基因的系统发育分析选取代表性菌株，并进行16S rDNA序列测定和菌株回接结瘤实验，进一步明确和验证了其种属特性。同时，对经过初筛能结瘤的4株根瘤菌进行了生长曲线和生理生化特性的测定。本文结果表明在酸性土壤中，优势根瘤菌的地域差异性。 <BR><BR><BR><BR>

[19] AKHGAR A, ARZANLOU M, BAKKER P, HAMIDPOUR M . Characterization of 1-Aminocyclopropane-1-Carboxylate (ACC) deaminase-containing Pseudomonas spp. in the rhizosphere of salt-stressed canola
Pedosphere, 2014,24(4):461-468.
[本文引用: 1]

[20] 张小娟 . 青海省不同生态区蚕豆根瘤菌16S rDNA分析
干旱地区农业研究, 2018,36(4):259-263.
[本文引用: 1]

ZHANG X J . 16S rDNA of rhizobium isolated from faba bean of different ecotopes in Qinghai Province
Agricultural Research in the Arid Areas, 2018,36(4):259-263. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[21] 艾文琴, 姜瀚原, 李欣欣, 廖红 . 一种高效研究大豆根瘤共生固氮的营养液栽培体系
植物学报, 2018,53(4):519-527.
[本文引用: 1]

AI W Q, JIANG H Y, LI X X, LIAO H . An efficient nutrient solution system to study symbiotic nitrogen fixation in soybean
Chinese Bulletin of Botany, 2018,53(4):519-527. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[22] 张永春 . 长期不同施肥对土壤酸化作用的影响研究
[D]. 南京: 南京农业大学, 2016.
[本文引用: 1]

ZHANG Y C . Research of long term fertilization on soil acidification
[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2016. ( in Chinese)
[本文引用: 1]

[23] 程凤娴, 曹桂芹, 王秀荣 . 华南酸性低磷土壤中大豆根瘤菌高效株系的发现及应用
科学通报, 2008,53(23):2903-2910.
Magsci [本文引用: 2]
<p>在大豆栽培历史不同的酸性缺磷土壤上, 从磷效率不同的两个大豆品系的根瘤中分离纯化出12株根瘤菌菌株. 16S rDNA测序分析结果表明, 分离纯化出的12株根瘤菌菌株为慢生根瘤菌(<em>Bradyrhizobium</em>)属的慢生根瘤菌菌株, 与对照大豆慢生型根瘤菌(<em>Bradyrhizboium japonicum</em>) USDA110菌株相比, 具有较高的固氮酶活性. 选取其中固氮酶活性最高的3株根瘤菌株系混合制成的根瘤菌菌剂, 在华南地区典型的酸性缺磷土壤上进行田间实验, 结果表明, 不接种根瘤菌, 3个供试大豆品系完全不能结瘤; 接种根瘤菌后, 供试大豆品系的结瘤率为100%, 不仅能形成较多根瘤, 而且能显著提高大豆地上部生物量和产量, 改善植株氮、磷营养状况. 其中, 大豆品种华春3号的地上部干重、氮和磷含量分别比不接种提高了154.3%, 152.4%和163.2%. 研究结果表明, 本研究在华南酸性缺磷土壤中发现了土著的高效根瘤菌株系, 这些株系具有宿主范围广、高效结瘤、固氮效率高和耐酸、耐低磷的特点, 对华南地区酸性缺磷土壤具有较好的适应性; 土壤环境、宿主类型是筛选高效根瘤菌株系需考虑的关键因素, 综合选择不同酸度范围土壤、不同磷效率大豆品种可提高获得高效根瘤菌株系的几率; 增加氮营养、促进根系生长是酸性缺磷土壤上接种高效根瘤菌增加大豆磷吸收的可能机理; 在酸性缺磷土壤上接种高效根瘤菌, 能显著促进大豆生长、改善大豆氮、磷营养状况, 是提高该地区大豆种植水平、发展大豆生产的有效途径. 因此, 在实际生产中大力推广豆科作物接种高效根瘤菌技术具有重要的经济、环境和生态效益.</p>
CHENG F X, CAO G Q, WANG X R . Discovery and application of soybean Rhizobium strains with high efficiency in acidic low phosphorus soil in South China
Chinese Science Bulletin, 2008,53(23):2903-2910. (in Chinese)
Magsci [本文引用: 2]
<p>在大豆栽培历史不同的酸性缺磷土壤上, 从磷效率不同的两个大豆品系的根瘤中分离纯化出12株根瘤菌菌株. 16S rDNA测序分析结果表明, 分离纯化出的12株根瘤菌菌株为慢生根瘤菌(<em>Bradyrhizobium</em>)属的慢生根瘤菌菌株, 与对照大豆慢生型根瘤菌(<em>Bradyrhizboium japonicum</em>) USDA110菌株相比, 具有较高的固氮酶活性. 选取其中固氮酶活性最高的3株根瘤菌株系混合制成的根瘤菌菌剂, 在华南地区典型的酸性缺磷土壤上进行田间实验, 结果表明, 不接种根瘤菌, 3个供试大豆品系完全不能结瘤; 接种根瘤菌后, 供试大豆品系的结瘤率为100%, 不仅能形成较多根瘤, 而且能显著提高大豆地上部生物量和产量, 改善植株氮、磷营养状况. 其中, 大豆品种华春3号的地上部干重、氮和磷含量分别比不接种提高了154.3%, 152.4%和163.2%. 研究结果表明, 本研究在华南酸性缺磷土壤中发现了土著的高效根瘤菌株系, 这些株系具有宿主范围广、高效结瘤、固氮效率高和耐酸、耐低磷的特点, 对华南地区酸性缺磷土壤具有较好的适应性; 土壤环境、宿主类型是筛选高效根瘤菌株系需考虑的关键因素, 综合选择不同酸度范围土壤、不同磷效率大豆品种可提高获得高效根瘤菌株系的几率; 增加氮营养、促进根系生长是酸性缺磷土壤上接种高效根瘤菌增加大豆磷吸收的可能机理; 在酸性缺磷土壤上接种高效根瘤菌, 能显著促进大豆生长、改善大豆氮、磷营养状况, 是提高该地区大豆种植水平、发展大豆生产的有效途径. 因此, 在实际生产中大力推广豆科作物接种高效根瘤菌技术具有重要的经济、环境和生态效益.</p>

[24] 华北农业科学研究所土壤肥料研究室. 一九五○年花生根瘤菌拌种工作总结
中国农业科学, 1951(4):24-25.
[本文引用: 1]

Soil and Fertilizer Research Office, North China Institute of Agricultural Sciences. Summary of peanut rhizobia seed dressing in 1950
Scientia Agricultura Sinica, 1951(4):24-25. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[25] KHALID R, ZHANG Y J, ALI S, SUI X H, ZHANG X X, AMARA U, CHEN W X, HAYAT R . Rhizobium Pakistanensis Sp. Nov., isolated from groundnut(Arachis Hypogaea) nodules grown in rainfed Pothwar, Pakistan
Antonie van Leeuwenhoek, 2015(107):281-290.
[本文引用: 1]

[26] 康凯 . 花生慢生根瘤菌的多样性研究
[D]. 武汉: 华中农业大学, 2007.
[本文引用: 1]

KANG K . Study on diversity of slow-growing rhizobia isolated from Arachis hypogaea
[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2007. ( in Chinese)
[本文引用: 1]

[27] 李智燕, 邢学峰, 唐华 . 铝和酸胁迫对苜蓿根瘤菌生长和抗氧化酶系的影响
草业学报, 2013,22(3):146-153.
DOI:10.11686/cyxb20130319Magsci [本文引用: 1]
<p>在铝和酸胁迫下，比较分析了天蓝苜蓿和紫花苜蓿根瘤菌的生长及ＳＯＤ（超氧化物歧化酶）、ＣＡＴ（过氧化氢酶）、ＰＯＤ（过氧化物酶）、及ＧＲ（谷胱甘肽还原酶）等抗氧化酶系响应特点。铝胁迫设５ 个梯度，即０，２５，５０，７５，１００&mu;ｍｏｌ／Ｌ；酸胁迫设４个ｐＨ 水平，即４，５，６，７。结果表明，铝和酸胁迫下，２种苜蓿根瘤菌的ＯＤ_Ａ６００均显著降低，生长受到抑制，且天蓝苜蓿根瘤菌的ＯＤ_Ａ６００显著高于紫花苜蓿根瘤菌。在ｐＨ 水平为４和５时，紫花苜蓿根瘤菌没有生长。在铝毒胁迫下，天蓝苜蓿根瘤菌的ＳＯＤ 酶活性一定程度减小后缓慢上升，而ＣＡＴ、ＰＯＤ 和ＧＲ 酶活性随铝浓度增大显著下降；紫花苜蓿根瘤菌的ＳＯＤ，ＣＡＴ 及ＧＲ 酶活在低Ａｌ胁迫下无显著变化，在高铝胁迫下显著下降。随着ｐＨ 水平的下降，天蓝苜蓿和紫花苜蓿根瘤菌均表现为ＳＯＤ、ＣＡＴ、ＰＯＤ、ＧＲ 酶活性的显著下降。在不同铝及酸胁迫下，天蓝苜蓿根瘤菌各抗氧化酶活性显著高于紫花苜蓿根瘤菌。综合分析认为天蓝苜蓿根瘤菌较之紫花苜蓿根瘤菌有较强的耐酸、耐铝性。</p>
LI Z Y, XING X F, TANG H . Effects of aluminum and acid stress on growth and antioxidant enzymes of alfalfa Rhizobium
Acta Prataculturae Sinica, 2013,22(3):146-153. (in Chinese)
DOI:10.11686/cyxb20130319Magsci [本文引用: 1]
<p>在铝和酸胁迫下，比较分析了天蓝苜蓿和紫花苜蓿根瘤菌的生长及ＳＯＤ（超氧化物歧化酶）、ＣＡＴ（过氧化氢酶）、ＰＯＤ（过氧化物酶）、及ＧＲ（谷胱甘肽还原酶）等抗氧化酶系响应特点。铝胁迫设５ 个梯度，即０，２５，５０，７５，１００&mu;ｍｏｌ／Ｌ；酸胁迫设４个ｐＨ 水平，即４，５，６，７。结果表明，铝和酸胁迫下，２种苜蓿根瘤菌的ＯＤ_Ａ６００均显著降低，生长受到抑制，且天蓝苜蓿根瘤菌的ＯＤ_Ａ６００显著高于紫花苜蓿根瘤菌。在ｐＨ 水平为４和５时，紫花苜蓿根瘤菌没有生长。在铝毒胁迫下，天蓝苜蓿根瘤菌的ＳＯＤ 酶活性一定程度减小后缓慢上升，而ＣＡＴ、ＰＯＤ 和ＧＲ 酶活性随铝浓度增大显著下降；紫花苜蓿根瘤菌的ＳＯＤ，ＣＡＴ 及ＧＲ 酶活在低Ａｌ胁迫下无显著变化，在高铝胁迫下显著下降。随着ｐＨ 水平的下降，天蓝苜蓿和紫花苜蓿根瘤菌均表现为ＳＯＤ、ＣＡＴ、ＰＯＤ、ＧＲ 酶活性的显著下降。在不同铝及酸胁迫下，天蓝苜蓿根瘤菌各抗氧化酶活性显著高于紫花苜蓿根瘤菌。综合分析认为天蓝苜蓿根瘤菌较之紫花苜蓿根瘤菌有较强的耐酸、耐铝性。</p>

[28] 刘璐, 詹庆才, 彭伟正 . 根瘤菌生物地理学的研究进展
微生物学报, 2018,58(2):202-208.
DOI:10.13343/j.cnki.wsxb.20170165Magsci [本文引用: 1]
根瘤菌是一类革兰氏阴性菌，能与特定的宿主植物共生形成根瘤，将空气中的分子态氮转变为植物可以利用的氨态氮。研究根瘤菌的生物地理分布格局及形成机制，不仅具有理论上的意义，还对根瘤菌接种剂的选择具有指导意义。目前，随着分子生物学技术的发展，以及根瘤菌多样性研究数据的积累，根瘤菌生物地理学取得了较大的进展。本文综述了根瘤菌生物地理学的研究方法及现状，并对今后的重点研究方向作了展望。
LIU L, ZHAN Q C, PENG W Z . Advances in biogeography of rhizobia
Journal of Microbiology, 2018,58(2):202-208. (in Chinese)
DOI:10.13343/j.cnki.wsxb.20170165Magsci [本文引用: 1]
根瘤菌是一类革兰氏阴性菌，能与特定的宿主植物共生形成根瘤，将空气中的分子态氮转变为植物可以利用的氨态氮。研究根瘤菌的生物地理分布格局及形成机制，不仅具有理论上的意义，还对根瘤菌接种剂的选择具有指导意义。目前，随着分子生物学技术的发展，以及根瘤菌多样性研究数据的积累，根瘤菌生物地理学取得了较大的进展。本文综述了根瘤菌生物地理学的研究方法及现状，并对今后的重点研究方向作了展望。

[29] 刘丽, 马鸣超, 姜昕 . 根瘤菌与促生菌双接种对大豆生长和土壤酶活的影响
植物营养与肥料学报, 2015,21(3):644-654.
DOI:10.11674/zwyf.2015.0311Magsci [本文引用: 2]
<p>【目的】 慢生大豆根瘤菌和胶质类芽孢杆菌单一菌株固氮或促生效果及机理已有较多研究,但两者双接种对作物的作用和增产机理尚未有所报道。本研究以慢生大豆根瘤菌5136与胶质类芽孢杆菌3016为研究对象,通过田间小区试验研究根瘤菌与促生菌不同施用模式对大豆生长和土壤酶活的影响,以期为开发新型高效复合菌剂提供理论依据。【方法】 试验设对照(T1)、接种胶质类芽孢杆菌3016菌剂(T2)、接种慢生大豆根瘤菌5136菌剂(T3),胶质类芽孢杆菌3016和慢生大豆根瘤菌5136双接种(T4)和常规施肥(T5)5个处理,分别于大豆不同生育期调查大豆的农艺性状和结瘤状况,测定土壤酶活性,用BOX-PCR技术监测慢生大豆根瘤菌5136的占瘤率。【结果】 1)在大豆成熟期,双接种(T4)处理的大豆单株分枝数、单株粒数、收获指数和产量均为最高,分别比T1高11.3%、9.7%、41.0%和9.3%,且单株空荚数最低,比T1降低了44.0%。2)在花荚期,双接种(T4)处理的占瘤率为25.4%,比T3处理高8.0%,且单株根瘤数和单株根瘤干重均为最高,分别比T1高41.6%和47.1%;说明双接种处理下,胶质类芽孢杆菌 3016能够促进慢生大豆根瘤菌5136结瘤固氮。 3)接种微生物菌剂均可不同程度地提高土壤酶活性,以双接种(T4)处理的效果最为显著,在大豆成熟期,土壤过氧化氢酶、脲酶和蔗糖酶活性均为最高,分别比对照高12.9%、8.9%和9.4%。 4)相关性分析表明,土壤酶活性与大豆收获指数显著正相关或极显著正相关(P&lt;0.01或P &lt;0.05),其中过氧化氢酶与产量显著正相关;单株根瘤数和单株根瘤干重均与收获指数和蔗糖酶活性呈极显著正相关,与产量呈显著正相关。【结论】 慢生大豆根瘤菌和胶质类芽孢杆菌双接种可以促进大豆生长,显著增加大豆的单株分枝数、单株粒数、收获指数和占瘤率,降低单株空荚数,增加大豆产量,同时可显著提高相关土壤酶活性,是一种节本增效的农艺措施。</p>
LIU L, MA M C, JIANG X . Effect of Rhizobia and PGPR co-inoculant on soybean characteristics and soil enzyme activities
Journal of Plant Nutrition and Fertilizer, 2015,21(3):644-654. (in Chinese)
DOI:10.11674/zwyf.2015.0311Magsci [本文引用: 2]
<p>【目的】 慢生大豆根瘤菌和胶质类芽孢杆菌单一菌株固氮或促生效果及机理已有较多研究,但两者双接种对作物的作用和增产机理尚未有所报道。本研究以慢生大豆根瘤菌5136与胶质类芽孢杆菌3016为研究对象,通过田间小区试验研究根瘤菌与促生菌不同施用模式对大豆生长和土壤酶活的影响,以期为开发新型高效复合菌剂提供理论依据。【方法】 试验设对照(T1)、接种胶质类芽孢杆菌3016菌剂(T2)、接种慢生大豆根瘤菌5136菌剂(T3),胶质类芽孢杆菌3016和慢生大豆根瘤菌5136双接种(T4)和常规施肥(T5)5个处理,分别于大豆不同生育期调查大豆的农艺性状和结瘤状况,测定土壤酶活性,用BOX-PCR技术监测慢生大豆根瘤菌5136的占瘤率。【结果】 1)在大豆成熟期,双接种(T4)处理的大豆单株分枝数、单株粒数、收获指数和产量均为最高,分别比T1高11.3%、9.7%、41.0%和9.3%,且单株空荚数最低,比T1降低了44.0%。2)在花荚期,双接种(T4)处理的占瘤率为25.4%,比T3处理高8.0%,且单株根瘤数和单株根瘤干重均为最高,分别比T1高41.6%和47.1%;说明双接种处理下,胶质类芽孢杆菌 3016能够促进慢生大豆根瘤菌5136结瘤固氮。 3)接种微生物菌剂均可不同程度地提高土壤酶活性,以双接种(T4)处理的效果最为显著,在大豆成熟期,土壤过氧化氢酶、脲酶和蔗糖酶活性均为最高,分别比对照高12.9%、8.9%和9.4%。 4)相关性分析表明,土壤酶活性与大豆收获指数显著正相关或极显著正相关(P&lt;0.01或P &lt;0.05),其中过氧化氢酶与产量显著正相关;单株根瘤数和单株根瘤干重均与收获指数和蔗糖酶活性呈极显著正相关,与产量呈显著正相关。【结论】 慢生大豆根瘤菌和胶质类芽孢杆菌双接种可以促进大豆生长,显著增加大豆的单株分枝数、单株粒数、收获指数和占瘤率,降低单株空荚数,增加大豆产量,同时可显著提高相关土壤酶活性,是一种节本增效的农艺措施。</p>

[30] 杨庆锋, 杜迎辉, 赵伟杰 . 不同氮肥处理下花生根瘤菌的应用效果
安徽农业科学, 2013,41(21):8860-8861.
[本文引用: 1]

YANG Q F, DU Y H, ZHAO W J . Application of peanut Rhizobium under different nitrogen fertilizer treatment
Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2013,41(21):8860-8861. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[31] 姜华, 赵雅丽, 何承刚 . 紫花苜蓿根瘤菌及其共生系统耐酸性的研究
云南农业大学学报(自然科学), 2013,1(10):56-60.
[本文引用: 1]

JIANG H, ZHAO Y L, HE C G . Study on acid tolerance in Rhizobium meliloti and its symbiosis system
Journal of Yunnan Agricultural University (Natural Science), 2013,1(10):56-60. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[32] 张媚佳, 徐淑韵, 徐苏凌 . 接种耐酸根瘤菌对紫花苜蓿生长的影响
贵州农业科学, 2011,39(5):164-166.
[本文引用: 1]

ZHANG M J, XU S Y, XU S L . Effect of acid-tolerant Rhizobium on the growth of alfalfa
Guizhou Agricultural Sciences, 2011,39(5):164-166. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[33] 陈敬慈, 张炳铃, 陈旭东 . 安溪茶园土壤酸化问题与改良措施
北京农业, 2014,29(8):115-116.
[本文引用: 1]

CHEN J C, ZHANG B L, CHEN X D . Soil acidification and improvement measures in Anxi Tea Garden
Beijing Agriculture, 2014,29(8):115-116. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[34] 曹立耘 . 根据土壤性质合理施肥
湖南科技报, 2015 -01-06(7).
[本文引用: 1]

CAO L Y, . Rational fertilization based on soil properties
Hunan Science and Technology Daily, 2015 -01-06(7). (in Chinese)
[本文引用: 1]

[35] 黎健龙, 涂攀峰, 陈娜, 唐劲驰, 王秀荣, 年海, 廖红, 严小龙 . 茶树与大豆间作效应分析
中国农业科学, 2008,41(7):2040-2047.
Magsci [本文引用: 1]
【目的】分析幼龄茶树与大豆间作对土壤养分状况、茶叶生长、病虫害防治等的影响。【方法】采用两个大豆品种和两个茶树品种，分春、夏两季在广东省农业科学院茶叶研究所英德基地酸性土茶园进行田间试验，分别调查了茶、豆间作对土壤pH、氮、磷、钾、钙、镁等养分状况，茶树株高、株宽及百芽重等生长指标以及杂草控制和病虫害防治等的影响。【结果】幼龄茶园中间种大豆，大豆秸秆回田后能改良土壤养分状况，能显著降低交换性铝含量，提高土壤pH值，增加土壤有机质、有效氮和全氮含量；茶、豆间作能有效促进茶树生长，增加茶叶产量、增强幼龄茶园的树势、培养树冠，为成龄茶园的丰产打下基础；茶、豆间作还能有效改善茶园小气候、减少虫害和杂草的发生，从而显著地提高茶园的经济效益。【结论】选择适宜的大豆品种进行茶、豆间作，在增收两季大豆的情况下，能提高土壤肥力，改善微生态环境，提高茶叶产量，是一种生态和经济效益俱佳的栽培方式。
LI J L, TU P F, CHEN N, TANG J C, WANG X R, NIAN H, LIAO H, YAN X L . Effects of tea intercropping with soybean
Scientia Agricultura Sinica, 2008,41(7):2040-2047. (in Chinese)
Magsci [本文引用: 1]
【目的】分析幼龄茶树与大豆间作对土壤养分状况、茶叶生长、病虫害防治等的影响。【方法】采用两个大豆品种和两个茶树品种，分春、夏两季在广东省农业科学院茶叶研究所英德基地酸性土茶园进行田间试验，分别调查了茶、豆间作对土壤pH、氮、磷、钾、钙、镁等养分状况，茶树株高、株宽及百芽重等生长指标以及杂草控制和病虫害防治等的影响。【结果】幼龄茶园中间种大豆，大豆秸秆回田后能改良土壤养分状况，能显著降低交换性铝含量，提高土壤pH值，增加土壤有机质、有效氮和全氮含量；茶、豆间作能有效促进茶树生长，增加茶叶产量、增强幼龄茶园的树势、培养树冠，为成龄茶园的丰产打下基础；茶、豆间作还能有效改善茶园小气候、减少虫害和杂草的发生，从而显著地提高茶园的经济效益。【结论】选择适宜的大豆品种进行茶、豆间作，在增收两季大豆的情况下，能提高土壤肥力，改善微生态环境，提高茶叶产量，是一种生态和经济效益俱佳的栽培方式。