宫安东, 朱梓钰, 路亚南, 万海燕, 吴楠楠, CheeloDimuna, 龚双军, 文淑婷, 侯晓信阳师范学院生命科学学院/河南省茶树生物学重点实验室,河南信阳 464000

Functional Analysis of Burkholderia pyrrocinia WY6-5 on Phosphate Solubilizing, Antifungal and Growth-Promoting Activity of Maize

GONG AnDong, ZHU ZiYu, LU YaNan, WAN HaiYan, WU NanNan, Cheelo Dimuna, GONG ShuangJun, WEN ShuTing, HOU XiaoCollege of Life Science, Xinyang Normal University/Henan Key Laboratory of Tea Plant Biology, Xinyang 464000, Henan

收稿日期:2018-10-30接受日期:2019-01-15网络出版日期:2019-05-01

基金资助:

国家自然科学基金项目.31701740 河南省科技攻关项目.172102110260 河南省科技攻关项目.182102110018 河南省科学技术研究重点项目.16A180036

Received:2018-10-30Accepted:2019-01-15Online:2019-05-01
作者简介 About authors
宫安东,E-mail： gongad@xynu.edu.cn











摘要
【目的】筛选兼具高效溶磷和抑菌作用的微生物,检测其溶磷效果和抑菌活性,鉴定抑菌代谢产物,并分析筛选微生物对植物生长的作用,为新型多功能抑菌微生物菌肥的研发提供材料。【方法】采集信阳毛尖茶车云山茶厂百年龄茶树根际土壤,稀释后涂布难溶性无机磷或难溶性有机磷培养基表面,培养后检测溶磷活性,测定溶磷圈直径,筛选具有高效溶磷作用的微生物,进行后续溶磷效果分析。高效溶磷菌WY6-5接种于培养液和土壤中,检测不同培养时间下,可溶性磷含量的变化规律,分析菌株WY6-5的溶磷活性;玉米盆栽土壤中接种菌株WY6-5菌液,种植27 d后分析玉米植株长势,检测溶磷菌WY6-5对苗期玉米生长的影响;采用双皿对扣培养法,验证菌株WY6-5产挥发性物质的抑菌作用,检测其对不同病原真菌的广谱抑菌效果,气相色谱串接质谱（GC-MS/MS）分析挥发性代谢物质,鉴定主效抑菌成分。【结果】筛选到3个兼具有降解难溶性无机磷和有机磷作用的微生物菌株,尤以菌株WY6-5溶磷效果最优。培养基培养条件下,对难溶性无机磷的溶解直径达2.3 cm,溶磷圈直径与菌落直径比为4.6;对难溶性有机磷溶解直径3.6 cm,溶磷圈直径与菌落直径比达7.2。表型观察、生理生化鉴定和系统发育树分析表明,菌株WY6-5为乳白色细菌,16S rRNA序列与Burkholderia pyrrocinia CIP 105874和Burkholderia stabilis CIP 106845两个菌株的同源性最高,进化树中聚成独立一支。另外,WY6-5与Burkholderia pyrrocinia具有高度相同的生理生化反应结果。因此,本研究将WY6-5鉴定为吡咯伯克霍尔德菌（Burkholderia pyrrocinia）。WY6-5在液体培养和土壤中均具有较好的溶磷活性,20 d培养时间内,液体培养液中磷含量最高达520.4 mg·L ^-1,为对照组176倍;土壤试验3—20 d期间,WY6-5处理组可溶性磷含量均高于对照组,且在盆栽试验中,能高效促进苗期玉米植株的生长,处理组叶长、叶宽、叶片数、茎粗、株高、鲜重等指标显著优于对照组;同时,菌株WY6-5还可产生挥发性抑菌物质,高效广谱抑制8种重要病原真菌的生长,抑菌率最高达100%,经GC-MS/MS检测发现,挥发性物质含有一种主效抑菌物,相对丰度达97%以上,鉴定为二甲基二硫。 【结论】吡咯伯克霍尔德菌（Burkholderia pyrrocinia）WY6-5分离自茶树根际土壤,在培养基、培养液和土壤环境下,均具有高效的溶磷效果,将难溶性的无机磷转化为植物可吸收的可溶性磷,并促进苗期玉米植株的生长;同时该菌还可产生挥发性抑菌物质二甲基二硫,高效抑制8种重要植物病原真菌的生长,抑制率最高达100%。菌株WY6-5兼具有提升土壤磷肥力、促进植物生长和和抑制真菌病害等多种重要作用,具有较好的生物学功能。
关键词： 溶磷;气体抑菌;吡咯伯克霍尔德菌;二甲基二硫;微生物肥料;玉米

Abstract
【Objective】 The study was carried out to screen microbe with phosphate solubilizing (P-solubilizing) and antagonistic activity, to evaluate their efficacies for P-solubilizing, fungal inhibition and plant growth promoting, and to identify antifungal compounds, so as to provide new resources for the development of microbial fertilizers. 【Method】 Rhizosphere soil samples of tea trees were collected from Cheyun mountain factory in Xinyang, Henan, China. Each sample was diluted, and spread onto the surface of insoluble organic and inorganic media. The diameter of P-solubilizing zone was measured after 5 days of incubation. The strain WY6-5 was chosen for further studies because it showed the highest P-solubilizing activity on insoluble phosphate. Additionally, the strain WY6-5 was inoculated in liquid medium and soil for 20 days to test P-solubilizing activity, and inoculated in maize grown soil to test plant growth promoting effects. Moreover, strain WY6-5 was co-cultured with eight different fungi to determine antagonistic activity by using a two dish face-to-face cultural method. The volatiles were characterized and identified with gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS). 【Result】 Three strains with P-solubilizing activity were isolated from rhizosphere soils of tea trees, and which were capable of dissolving insoluble organic and inorganic phosphorus medium. The strain WY6-5 demonstrated the highest P-solubilizing activity with the solubilizing halo up to 2.3 cm on insoluble organic medium, and 3.6 cm on insoluble and inorganic phosphorus medium. The ratios of the P-solubilizing halo diameter to the colony diameter on both media were 4.6 and 7.2, respectively. Based on morphological characteristics, physiological, biochemical and phylogenetic analyses, the strain WY6-5 was identified to be Burkholderia pyrrocinia. P-solubilizing activity of WY6-5 was also observed in the liquid medium or in soil after 20 days of incubation. The concentration of soluble phosphate in liquid medium was up to 520.4 mg·L ^-1, which was 176 times higher than that in control treatment. During 3-20 d, the phosphate concentrations in soil under WY6-5 treatments were constantly higher than that under control treatment. In addition, the strain WY6-5 significantly promoted the growth of maize seedling in terms of the number, length, width and area of leaf as well as plant height and fresh weight. Moreover, the volatile compounds produced from the WY6-5 inhibited the growth of all eight different fungi, with the mycelium inhibition rate up to 100%. The antifungal volatile was subsequently identified as dimethyl disulfide through GC-MS/MS. 【Conclusion】 The Burkholderia pyrrocinia strain WY6-5 isolated from rhizosphere soils of a tea tree was found to be able to dissolve insoluble phosphate in both liquid medium and soil, to promote the growth of maize seedlings, and to produce volatile dimethyl disulfide with broad antifungal activity, implying an important biological functions.
Keywords：phosphate solubilizing;volatile antifungal activity;Burkholderia pyrrocinia;dimethyl disulfide;microbial fertilizer;maize


PDF (2543KB)元数据多维度评价相关文章导出EndNote|Ris|Bibtex收藏本文
本文引用格式
宫安东, 朱梓钰, 路亚南, 万海燕, 吴楠楠, CheeloDimuna, 龚双军, 文淑婷, 侯晓. 吡咯伯克霍尔德菌WY6-5的溶磷、抑菌与 促玉米生长作用研究[J]. 中国农业科学, 2019, 52(9): 1574-1586 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.09.009
GONG AnDong, ZHU ZiYu, LU YaNan, WAN HaiYan, WU NanNan, Cheelo Dimuna, GONG ShuangJun, WEN ShuTing, HOU Xiao. Functional Analysis of Burkholderia pyrrocinia WY6-5 on Phosphate Solubilizing, Antifungal and Growth-Promoting Activity of Maize[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2019, 52(9): 1574-1586 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2019.09.009

0 引言

【研究意义】中国为农业生产大国,土壤保肥和粮食增产是农业可持续发展的重要议题。长期以来,由于对作物增产的盲目追求,化学肥料施用量逐年增多,导致土壤生态恶化^[1]、有机质减少、微生物区系改变^[2]、肥力降低^[3]等问题,严重制约了农业的可持续发展。为此,中国农业农村部制订了《到2020年化肥使用量零增长行动方案》,以解决土壤持续恶化问题^[4]。微生物在土壤中分布广泛,种类和功能多样^[5],到目前为止,已报道多种微生物具有固氮、溶磷、解钾和促生长等重要作用,可以改善土壤微环境,提升土壤肥力^[6]。因此,开展微生物菌肥研制,对土壤肥力的提升和农业可持续发展具有重要意义。【前人研究进展】磷肥是植物生长所必需的三大肥料之一。在我国,约74%的土壤中缺磷^[7],且95%以上的磷以难溶性的铝硅酸盐和磷灰石存在,无法被植物吸收利用^[8],加之农业生产中对化学磷肥的过度依赖,施用量逐年增多,进一步加重了土壤的矿质化污染^[9]。据估算,1949—1992 年间,我国累计施入农田的磷肥达3.4×10⁷ t,其中大约有2.6×10⁷ t磷累积在土壤中^[10],造成了土壤酸化、板结、肥力降低和水体富营养化等问题。如何改善土壤磷环境,提升可溶性磷含量,是目前研究的热点。溶磷微生物可产生酸性代谢物,溶解土壤中的难溶性磷化物,转化为可溶性磷肥,补充植物所需磷营养^[11],并能促进植物对N、K、Ca、Mg、Fe、Zn 等其他营养元素的吸收,进一步提高作物的生物量和产量^[12]。曾广勤等^[13]研究表明,施用溶磷菌可以提高小麦的氮、磷含量,改善农产品质量,并提高小麦的抗旱和抗寒能力。郝晶等^[14]证明,溶磷菌能促进植物生长,大幅度提高豌豆产量。溶磷菌广泛使用不仅可以提升土壤磷肥力,促进植物生长,同时还有效缓解了土壤矿质化污染问题,具有较好的应用价值和生态效益。到目前为止,已报道多种微生物具有溶磷能力,如放线菌（Actinomycetes sp.）^[15]、芽孢杆菌（Bacillus sp.）^[16]、假单胞菌属（Pseudomonas sp.）^[17]、沙雷氏菌属（Serratia sp.）^[18]、肠杆菌属（Enterobacter sp.）^[19]、根瘤菌属（Rhizobium sp.）^[20]以及伯克霍尔德菌属（Burkholderia sp.）等。但针对伯克霍尔德菌的溶磷效果研究相对较少,且筛选到的菌株仅在液体摇培条件下具有活性,而在土壤中的溶磷效果,以及对植物生长的作用尚未可知^[7,21]。与此同时,报道的多数溶磷微生物,仅有单一溶磷活性,其抑菌效果尚未揭示,在一定程度上制约了其广泛应用。【本研究切入点】本研究以筛选兼具有溶磷和抑菌的微生物菌株为研究目的,从百年茶龄茶树根际土中,筛选高效溶磷且产气抑菌的吡咯伯克霍尔德菌WY6-5,分析WY6-5在不同环境条件下的溶磷作用,验证对玉米植株生长作用,检测对不同病原真菌的抑菌效果,并鉴定抑菌功能物质,确定其生物学功能。【拟解决的关键问题】筛选高效溶磷抑菌微生物菌株,确定筛选菌株的分类学地位,并验证其在溶磷、抑菌和促生长方面的重要作用,鉴定抑菌代谢物质,为多功能微生物菌株的筛选,提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株与植物材料

供试细菌菌株WY6-5,为本试验分离野生菌株,分离于信阳市车云山茶区,为百年树龄茶树根际土壤微生物。

供试玉米材料为鲲玉品种。供试真菌菌株有禾谷镰刀菌、禾谷炭疽菌、链格孢菌、稻瘟病菌、烟曲霉菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌和灰霉菌。

1.2 供试培养基

无机磷培养基：(NH₄)₂SO₄ 0.5 g,MgSO₄ 0.3 g,NaCl 0.3 g,Ca₃(PO₄)₂ 8.0 g,葡萄糖10.0 g,11% MnSO₄ 1 mL,1% FeSO₄ 1 mL,琼脂20 g,pH 7.2,去离子水定容至1 L。

有机磷培养基：(NH₄)₂SO₄ 0.5 g,NaCl 0.3 g,KCl 0.3 g,CaCO₃ 5 g,11% MnSO₄ 1 mL,1% FeSO₄ 1 mL,卵磷脂 0.8 g,酵母膏 0.8 g,琼脂 20 g,pH 7.0,去离子水定容至1 L。

1.3 溶磷菌株的筛选

取新鲜土壤样品1 g于2 mL 离心管内,加入1 mL无菌水混匀,梯度稀释至10^-5。取稀释液100 μL,涂布棒涂布于无机磷平板表层,37℃恒温培养72 h,挑取溶磷圈大、澄清且边缘整齐的单菌落,于NA（牛肉膏3 g,蛋白胨 10 g,氯化钠 5 g,蒸馏水定容至1 L,琼脂15 g,pH=7.2）平板划线纯化,获取单菌落。

采用无机磷（有机磷）培养基筛选法,检测菌株的溶磷效果,在培养基表面距中心位置1.5 cm处,放置5 mm直径的无菌滤纸,中心位置另一端对称处打孔器打孔（5 mm直径）,向滤纸片上和孔洞中分别加入10 μL细菌菌悬液（OD₆₀₀=1.8）,以接种等量无菌水的处理做对照。37℃恒温培养5 d,当两种接种方法中同时出现溶磷圈时,认定为溶磷菌。测定打孔培养法中,溶磷圈直径与菌落直径,计算溶磷率（溶磷圈直径与菌落直径比,D/d）,筛选高活性菌株。

1.4 菌株 WY6-5 的鉴定

1.4.1 形态学鉴定 将菌株WY6-5划线培养于NA培养基表面,37℃培养24 h,观察菌落形态,挑取单菌落进行形态学分析。

1.4.2 分子生物学鉴定^[22] 采用Tris-HCl（Amresco公司）和EDTA（Amresco公司）法提取基因组DNA,16S rRNA通用引物27 F（AGAGTTTGATCCTGGC TCAG）和1492 R（AAGGAGGTG ATCCAGCCGCA）扩增保守序列。琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带,回收纯化PCR产物,送武汉天一辉远生物科技公司测序。测序结果于NCBI数据库进行同源性分析,归类为伯克霍尔德菌属,筛选同属中同源性高,且已鉴定的模式菌株为参比,进行系统发育树构建。CLUSTAL X1.83 进行多重序列比对,MEGA 7软件Neighbor joining法构建系统发育树。

1.4.3 生理生化鉴定 将菌株WY6-5在NA培养基上进行划线活化,12 h后挑取单菌落接种至IF-A GEN III inoculating fluid培养液混合均匀,并转接至Biolog Gen III 培养板中,37℃下培养10—20 h,BIOLOG MicroStation? System微生物鉴定系统进行生理生化特性分析,与数据库中已鉴定模式菌株进行比对分析,选取生理生化反应相似度最高的种,确定同源菌种。

1.5 液体培养条件菌株 WY6-5 的溶磷效果

将菌株 WY6-5 培养于NB培养液（牛肉膏3 g,蛋白胨 10 g,氯化钠 5 g,蒸馏水定容至1 L,pH=7.2）中,200 r/min,37℃摇培24 h,离心收集菌体,无菌水清洗 2 次,按 6%（v/v）比例接种菌液至装有40 mL无机磷液体培养基的三角瓶中,以接种等量无菌水的处理为对照,每个处理重复3次,所有处理培养于37℃ 200 r/min。分别于第0、3、6、12、20天取样,测定可溶性磷含量,分析菌株溶磷能力。

应用AMS France连续流动分析仪进行菌株溶磷能力的测定。取优级纯磷酸二氢钾粉末4.3871 g,溶解到400 mL dd H₂O水中,定容到1 000 mL,配成1 g·L^-1标准储备液。依次稀释至3.0、6.0、9.0、12.0、15.0 mg·L^-1的标准液,检测不同浓度下,可溶性磷峰面积,与对应浓度构建标准曲线回归方程,计算样品中可溶性磷含量。

1.6 菌株WY6-5 在土壤中的溶磷效果

供试土壤取自信阳市浉河区车云山茶厂,地表下5—10 cm深茶树根迹土壤,土质为黄褐土,有机质含量偏低,呈弱酸性^[23]。烘干过10目筛,将其分装成每袋 1.4 kg,121℃下灭菌 30 min,灭菌3次。按 20%（v/w）接种量添加无机磷培养液,按1%（v/w）接种量接种WY6-5菌悬液（OD₆₀₀=1.8）,混合均匀;以接种等量无菌水的处理作为对照,每个处理组重复3次,于室温下静置培养。两组分别培养至第0、3、12、20天时取样,采用Olsen法对所取土样前处理^[24],使用连续流动分析仪测定可溶性磷含量。

1.7 菌株WY6-5 对玉米生长的作用

土壤灭菌处理后,自然晾干,分别取1.4 kg,添加于每个花盆（开口直径19.2 cm,高14.2 cm）中,按照 20%（v/w）接种量添加无机磷培养液,按1%（v/w）接种量添加WY6-5的菌悬液,以接种等量无菌水的处理为对照,混合均匀后播种萌发的玉米籽粒,每盆播种4粒,每个处理重复3次。自然环境条件下培养27 d后,测定玉米植株叶长、叶宽、单叶叶面积、叶片数、株高、茎粗、鲜重和地上、地下干重等指标。

1.8 菌株WY6-5的广谱抑菌作用分析

采用双皿（直径9 cm）对扣培养法^[25],检测菌株WY6-5对不同病原真菌的抑菌活性。挑选活化的真菌菌丝块接种于含PDA培养基的培养皿中央。100 μL菌株WY6-5（OD₆₀₀=1.8）涂布于另一个含NA培养基的培养皿表面。将接种真菌菌丝块的培养皿对扣于涂布WY6-5的培养皿之上,透明胶带密闭封口。以仅接种真菌菌丝块的处理作为对照,每个处理重复3次,所有培养皿于28℃黑暗条件下培养5 d,统计真菌菌丝直径,计算抑菌率。

抑菌率（%）=（对照菌丝直径-处理菌丝直径）/对照菌丝直径×100。

1.9 菌株WY6-5挥发性代谢物质鉴定

将菌株WY6-5接种于100 mL三角瓶中的NA培养基表面,用涂棒涂布均匀,以接种等量无菌水的NA培养基为对照,所有接种的三角瓶用双层塑料薄膜密封,并置于28℃黑暗条件下培养48 h^[26]。培养后的三角瓶转移到40℃的水浴锅中平衡30 min。采用固相微萃取柱（Solid phase micro-extraction,SPME,DVB/ CAR/PDMS,30/50 μm）进行挥发性物质的富集,将SPME的金属针插入塑料薄膜下,推出内部的富集针,使富集针处于样品瓶中部正上空位置,吸附微生物产生的挥发性物质,30 min后,将富集针收回金属针内,并转入气相色谱质谱联用仪（GC-MS/MS）进样口,手动进样进行检测。

GC-MS/MS检测过程中,进样口温度250℃;离子源为EI源,温度为230℃,轰击能量为70 eV,四极杆温度150℃,采用不分流进样,全扫描的模式进行检测。载气为氦气,柱流速1 mL·min^-1。气相色谱采用程序升温：起始温度60℃,保持2 min;以5℃·min^-1的速度升温至150℃,保持2 min;以10℃·min^-1速率升至280℃,保持2 min。检出所有物质进行谱库检索National Institute of Standards and Technology（NIST 17）。每个处理检测两次,两次重复中微生物组均出现,且对照组中未检出的物质,确定为WY6-5产挥发性物质。

1.10 统计学处理

采用SPSS17.0软件对试验数据进行统计分析,统计结果为3次重复数据取平均值,采用独立性T检验进行方差分析,计算标准误,计算显著性差异（P<0.05）。

2 结果

2.1 高效溶磷微生物的筛选

采用稀释涂平板法,将稀释液涂布于无机磷培养平板表面,培养3 d后,筛选可形成溶磷圈的微生物菌株。本研究中,共计获得11个溶磷细菌,其中3株细菌兼具有降解难溶性无机磷和有机磷的生物学功能。溶磷活性分析表明,菌株WY6-5溶磷效果最好,明显优于其他菌株,对难溶性无机磷的溶解直径为2.3 cm,溶磷率D/d值高达4.6;对难溶性有机磷溶解直径3.6 cm,溶磷率D/d值为7.2（图1）。因此本试验中以WY6-5为优势生物菌株,进行后续溶磷作用分析。

图1

新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT
图1菌株WY6-5对难溶性无机磷和有机磷的溶解效果

Fig. 1P-solubilizing activity of strain WY6-5 in the medium containing insoluble organic/inorganic phosphorus

2.2 菌株 WY6-5的鉴定

细菌WY6-5于NA培养基培养24 h后,菌落呈乳白色,不透明,边缘规则,表面光滑湿润。16S rRNA序列比对发现,菌株WY6-5为伯克霍尔德菌属,且与模式菌株^[27]Burkholderia pyrrocinia CIP 105874和Burkholderia stabilis CIP 106845的亲缘性最高,遗传距离相对最近,三者聚为一个分支,将菌株WY6-5初步鉴定为Burkholderia pyrrocinia/ stabilis（图2）。

图2

新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT
图2菌株WY6-5及其近缘种的系统进化树分析

Fig. 2Phylogenetic tree analysis of strain WY6-5 and other homologous strains based on 16S rRNA sequences



对菌株WY6-5进行生理生化分析表明,菌株WY6-5与BIOLOG MicroStation? System数据库中的洋葱/吡咯伯克霍尔德氏菌种（Burkholderia cepacia/ pyrrocinia）具有相似生理生化特性。可利用α-D-葡糖、D-山梨醇、D-果糖、D-天冬氨酸等24种碳、氮源,对1%的氯化钠具有耐受性,4%的氯化钠不具有耐受性,耐pH 5酸性条件,对万古霉素、林肯霉素等多种抗生素和化学物质具有抗性（表1）。

Table 1
表1
表1菌株WY6-5的生化活性鉴定
Table 1Biochemical analysis of strain WY6-5

试验内容 Experiments	WY6-5	B. cepacia / pyrrocinia*		试验内容 Experiments	WY6-5	B. cepacia/ pyrrocinia*
碳/氮源利用 Carbon /Nitrogen utilization				盐耐受性 Salt tolerance
α-D-葡糖Alpha-D-glucose	++	+		1% NaCl	++	++
D-山梨醇 D-sorbitol	+	+		4% NaCl	-	-
D-半乳糖醛酸 D-Galacturonic Acid	++	++		8% NaCl	-	-
吐温40 Tween 40	+	+		pH耐受性 pH tolerance
糊精 Dextrin	+	-		pH 5	+	++
D-果糖 D-Fructose	++	++		pH 6	++	++
L-丙氨酸L-Alanine	+	++		抗生素敏感性 Antibiotics sensitivity
乙酸 Acetic Acid	+	++		万古霉素 Vancomycin	++	++
奎宁酸Quinic Acid	++	++		林肯霉素 Lincomycin	++	++
D-天冬氨酸 D-Aspartic Acid	++	++		利福霉素SV Rifamycin SV	++	++
L-丝氨酸 L-Serine	+	+		二甲胺四环素 Minocycline	+	++
D-甘露醇 D-Mannitol	++	+		化学敏感性测试Chemical sensitivity
L-苹果酸 L-Malic Acid	++	++		盐酸胍 Guanidine HCl	+	+
L-焦谷氨酸 L-Pyroglutamic Acid	+	++		四唑蓝 Tetrazolium blue	++	++
D-葡糖酸 D-Gluconic Acid	++	++		四唑紫 Tetrazolium purple	++	++
D-阿拉伯醇 D-Arabitol	+	+		硫酸四癸钠 Niaproof 4	+	++
L-丝氨酸 L-Serine	+	+		1%乳酸钠 1% Sodium Lactate	++	++

* Homologue strain of WY6-5 aligned in BIOLOG MicroStation^TM System. “++” is strong positive reaction; “+” is weak positive reaction; “-” is negative reaction
* BIOLOG MicroStation^TM System中比对出的生化反应近缘菌;“++”强阳性反应;“+”弱阳性反应;“-”阴性反应

新窗口打开|下载CSV

综上所述,结合表型观察、生理生化试验、系统发育树分析,菌株WY6-5与吡咯伯克霍尔德菌在分子水平和生理生化水平均具有高度同源性,故将其鉴定为吡咯伯克霍尔德菌。

2.3 菌株 WY6-5 的溶磷效果分析

吡咯伯克霍尔德菌WY6-5在培养基中具有高效的溶磷活性,为进一步分析其在不同环境下的溶磷效果,进行液体摇培和土壤溶磷试验。摇培试验表明,菌株WY6-5在液体环境下具有较好的溶磷活性,能显著提高可溶性磷含量。整个培养周期内,对照组中磷含量未发生明显变化,WY6-5添加组,随着时间的延长,可溶性磷含量呈线性梯度增多,培养至第6天时,磷含量达到 181.0 mg·L^-1,第20天达到520.4 mg·L^-1,为对照组的176倍（图3-A）。

图3

新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT
图3菌株 WY 6-5 对培养液和土壤中的溶磷效果分析

A：液体摇培条件下的溶磷作用分析B：土壤接种环境中的溶磷作用分析。*表示与对照组相比,在 P<0.05 水平上具有差异显著
Fig. 3P-solubilizing activity of the strain WY 6-5 in water and soil

A: P-solubilizing activity of WY6-5 under liquid condition;B: P-solubilizing activity of WY6-5 in soil. *Means significant difference at P<0.05 level compared to control treatment, respectively


菌株WY6-5在土壤中同样具有溶磷活性（图3-B）,与对照组相比,培养20 d内,WY6-5添加组的磷含量均高于对照组,尤其在培养3—12 d内,有效磷含量明显高于对照组。但由于土壤组成复杂,随时间的延长,土壤有效磷含量逐渐降低。

2.4 菌株WY6-5 对盆栽玉米的促生长作用

盆栽试验表明,吡咯伯克霍尔德菌WY6-5在土壤中具有较好的促生长活性,可以明显促进苗期玉米的生长。培养27 d后观察,菌株WY6-5添加组玉米长势明显优于对照组（图4）,在叶长、叶宽、单叶叶面积、叶片数、茎粗、株高、鲜重和地上部干重等相应指标显著高于对照组,且与对照组相比,增长量分别达21.7%、21.1%、47.8%、8.0%、24.6%、13.0%、23.5%和49.5%（表2）,表明菌株WY6-5施用于土壤后,能改善土壤营养状况,促进作物生长。

图4

新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT
图4菌株WY6-5对玉米幼苗生长的影响

Fig. 4Effect of strain WY6-5 on the growth of maize seedlings



Table 2
表2
表2菌株WY6-5对苗期玉米生长的影响
Table 2Effect of strain WY6-5 on the growth of maize seedling

生长指标Growth index	对照组Control group	处理组WY6-5
叶长Leaf length (cm)	26.56±0.70	32.31*±0.95
叶宽Leaf width (cm)	2.41±0.08	2.92*±0.11
单叶叶面积Area of single leaf (cm2)	48.29±2.61	71.37*±4.45
单株叶片数Number of leaves per plant	8.33±0.14	9.00*±0.17
茎粗Stem diameter (cm)	0.58±0.02	0.72*±0.03
株高Plant height (cm)	30.20±0.45	34.12*±1.21
单株鲜重Fresh weigh of single plant (g)	5.73±0.02	7.07*±0.09
地上部干重 Dry weight of overground tissues (g/plant)	1.22±0.03	1.83*±0.08
地下部干重Dry weight of underground root (g/plant)	0.31±0.02	0.36±0.03

Area of single leaf was taken from the third fresh leaf from bottom to top
单叶叶面积取自下而上第三片鲜叶

新窗口打开|下载CSV

2.5 菌株WY6-5的抑菌作用与代谢产物鉴定

采用双皿对扣培养法,检测WY6-5抑菌效果。结果表明,WY6-5通过产生挥发性物质,抑制病原真菌的生长（图5）。培养5 d后观察,对照组真菌菌丝生长迅速,WY6-5处理组,真菌菌丝生长受抑制,抑菌率均高于70%,其中对稻瘟菌和禾谷镰刀菌抑菌率分别达到86.3%和92.6%,对烟曲霉菌、黄曲霉菌、灰霉菌和黑曲霉菌的抑菌效果最显著,抑制率达100%。菌株WY6-5产生的挥发性物质具有较好的抑菌效果,对多种病原真菌具有高效广谱的抑菌作用。

图5

新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT
图5菌株WY6-5对各种病原真菌的抑制作用

供试菌株为禾谷镰刀菌(Fg)、禾谷炭疽菌(Cg)、链格孢菌(Aa)、稻瘟病菌(Mo)、烟曲霉菌(Afu)、黄曲霉菌(AF)、黑曲霉菌(An)和灰霉菌(Bc)
Fig. 5Inhibitory effect of strain WY6-5 against the growth of different fungal pathogens

The fungal strains used in the tests include Fusarium graminearum (Fg), Colletotrichum graminicola (Cg), Alternaria alternata (An), Magnaporthe oryzae (Mo), Aspergillus fumigatus (Afu), Aspergillus flavus (Afl), Aspergillus niger (An) and Botrytis cinerea (Bc)

2.6 挥发性代谢物质鉴定

运用GC-MS/MS检测菌株WY6-5产生的挥发性气体,结果显示,菌株WY6-5产生一种高丰度的挥发性物质,保留时间为2.7 min,与色谱峰总面积相比,相对丰度达99%以上。经NIST谱库检索比对,将该物质鉴定为二甲基二硫（dimethyl disulfide, DMDS）（图6）。

图6

新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT
图6菌株WY6-5产挥发性气体物质的GC-MS/MS检测

外围轮廓图为WY6-5挥发性气体色谱图;内部棒状图为二甲基二硫的质谱图
Fig. 6Identification of volatiles from strain WY6-5 through GC-MS/MS

The outside figure is the chromatogram of volatiles from WY6-5; The inter centroid is the MS spectrum of DMDS by EI-source

3 讨论

在我国,土壤中有效磷含量相对不足,矿质化严重,难以满足农业生产的需求^[28]。溶磷菌在土壤中分布广泛,能通过酸化、螯合以及交换等反应机制,将无效磷转化为植物可利用的有效磷^[29],提升磷肥利用率,是目前解决磷肥短缺问题的重要手段之一。本研究从茶树根际土壤中筛选到一株具有高效溶磷作用的微生物菌株WY6-5,通过菌体表型特征、生理生化检测和16S rRNA序列比对分析,将菌株 WY6-5 鉴定为吡咯伯克霍尔德菌（B. pyrrocinia）。该菌株不仅可以溶解难溶性的磷酸钙,还可溶解有机态的卵磷脂,培养皿培养中,呈现面积大、边缘整齐、透明度高的溶磷圈,具有高效的溶磷活性。

溶磷微生物不仅在固体培养基中具有溶磷作用,在液体培养条件下,也具有较好的溶磷活性,如张云霞等^[30]报道的枯草芽孢杆菌JT-1,液体摇培条件下,解磷量最高达到386.3 mg·L^-1,余贤美等^[31]筛选到一株洋葱伯克霍尔德菌PSB3,液体培养后,上清液中含磷量最高达218.6 μg·mL^-1,戴沈艳等^[32]获得的解磷菌,培养后溶磷量可达240.1 mg·L^-1。与上述溶磷菌株相比,本研究筛选的菌株WY6-5,在液体环境中具有更好的溶磷效果,培养20 d内,磷含量呈直线增长,最高达520.4 mg·L^-1,达对照组的176倍,溶磷活性显著高于现阶段报道的其他菌株。除此之外,菌株WY6-5在土壤中也具有较好的溶磷活性,整个培养周期内,WY6-5添加组可溶性磷含量均高于对照组;但随时间的延长,溶磷菌添加组和对照组中可溶性磷含量均呈降低趋势,该变化趋势与张爱民^[33]和王琰^[34]等报道的研究结果相似,主要原因为土壤组成成分复杂,受金属离子、生物酶、微生物等因素影响,溶解后的可溶性磷再次被固定,导致含量降低;同时,随培养时间延长,土壤中营养物质消耗,有害物质积累,WY6-5活性减弱,是可能导致磷含量降低的另一诱因。土壤中微生物的高效溶磷活性,是多种因素共同作用的结果,揭示各因素间的相互关系,是后期研究的重点。

伯克霍尔德菌是一种重要的微生物资源,在土壤中分布广泛,对小麦、玉米、甘蔗、草莓等多种植物的生长有重要作用^{[35,36,37,38]}。该菌株不仅可以通过固氮、溶磷和分泌植物激素等作用促进植物生长^[39],同时还可产生硝吡咯菌素、吩嗪、cepaciamide A、cepabactin、cepacidine A等多种抑菌产物,抑制土传病害的侵染^[40],部分物质已开发为生物农药,用于防治小麦纹枯病、番茄根结线虫病等多种田间病害^[41,42,43]。但上述物质分子量大,分散速度慢,使用过程中,接触病原菌后方可发挥抑制作用,在一定程度上限制了其广泛应用。与其相比,小分子物质结构简单,易挥发,分散迅速,可远距离发挥作用,且不易产生残留,对不同分布条件下的病原菌均可抑制,不仅可以防治土壤病害,对于储藏期病害同样有效^[26]。本研究首次证明,溶磷吡咯伯克霍尔德菌WY6-5,可产生挥发性抑菌物质二甲基二硫,具有广谱抑菌作用,能高效抑制灰霉属、炭疽菌属、镰刀菌属、曲霉菌属等8种病原真菌的生长,为潜在的高效抑菌生物制剂。且该物质生物安全性较好,在多种生物中均有发现,如芽孢杆菌、假单胞菌、沙雷氏菌等^[44,45,46]微生物,以及白芥和韭葱^[47,48]等植物中。该物质易于分散,具有较好的抑菌活性,可抑制根结线虫、立枯似核菌、大丽轮枝菌、尖孢镰刀菌等多种土传病害^[49]。同时,该物质还具有诱导寄主植物抗性,促进植物生长等重要作用^[44,50],为潜在的高活性多功能生物菌剂。

伯克霍尔德菌具有较好的生物活性,以其为原料制成的生物农药,在部分国家中已得到应用。但与此同时,该菌被认定为条件性致病菌,可引起人类和植物病害,一定程度上制约了其广泛应用。因此,笔者建议,在针对WY6-5及其同属菌的应用时,应特别谨慎,首先做到（1）生物安全性分析,分析其对不同生物的影响,严格采用对人类无毒菌株进行应用研究;（2）环境安全性评价,分析菌株不同剂量施用后对环境微生物群落、非靶标生物及生态的影响,确定其环境安全作用;（3）作用机制分析,鉴定功能活性物质,在无法确定菌株（1）与（2）中的安全性时,可尝试代谢物质应用研究,以及功能基因的克隆和转化工程菌株,利用的拮抗物质进行植物病害生防是国际上认同的观点。

4 结论

本研究创新性指出,吡咯伯克霍尔德菌WY6-5,可高效降解难溶性无机磷和有机磷,并提升液体和土壤中可溶性磷含量,促进植物生长;与此同时,该菌株可产生挥发性物质二甲基二硫,具有高效广谱的抑菌作用,以及潜在的促进植物生长活性,为抑菌性生物肥料的制备,提供潜在的生物活性材料。

致谢：感谢信阳师范学院“南湖****奖励计划”青年项目,农业部华中作物有害生物综合治理重点实验室/农作物重大病虫草害防控湖北省重点实验室开放基金课题（2018ZTSJJ2）,信阳师范学院分析测试中心对本项目的资助。

参考文献 View Option 原文顺序
文献年度倒序
文中引用次数倒序
被引期刊影响因子

[1] 李东坡, 武志杰 . 化学肥料的土壤生态环境效应
应用生态学报, 2008,19(5):1158-1165.
Magsci [本文引用: 1]
<P><FONT face=Verdana>目前我国的化肥生产和消费量均居世界第一.2006年全年化肥产量达5 304.8×10<SUP>4</SUP> t，比2005年增长14.2％，化肥氮平均施用量超过220 kg·hm<SUP>-2</SUP>，一季作物磷肥施用量超过102 kg·hm<SUP>-2</SUP>（P<SUB>2</SUB>O<SUB>5</SUB>）.一些化肥中含有有毒重金属、无机酸和有机物等副成分，长期施用化肥导致污染物在土壤中累积，严重影响土壤的生态环境，使蔬菜、粮食、水果等农产品中的重金属、硝酸盐等有害物质严重超标，农产品质量受到严重威胁.本文分析了化肥污染土壤的原因、特点和后果及我国土壤环境现状，并提出了减轻化肥污染农业生态环境的技术和措施.</FONT></P>
LI D P, WU Z J . Impact of chemical fertilizers application on soil ecological environment
Chinese Journal of Applied Ecology, 2008,19(5):1158-1165. (in Chinese)
Magsci [本文引用: 1]
<P><FONT face=Verdana>目前我国的化肥生产和消费量均居世界第一.2006年全年化肥产量达5 304.8×10<SUP>4</SUP> t，比2005年增长14.2％，化肥氮平均施用量超过220 kg·hm<SUP>-2</SUP>，一季作物磷肥施用量超过102 kg·hm<SUP>-2</SUP>（P<SUB>2</SUB>O<SUB>5</SUB>）.一些化肥中含有有毒重金属、无机酸和有机物等副成分，长期施用化肥导致污染物在土壤中累积，严重影响土壤的生态环境，使蔬菜、粮食、水果等农产品中的重金属、硝酸盐等有害物质严重超标，农产品质量受到严重威胁.本文分析了化肥污染土壤的原因、特点和后果及我国土壤环境现状，并提出了减轻化肥污染农业生态环境的技术和措施.</FONT></P>

[2] 宋以玲, 于建, 陈士更, 肖承泽, 李玉环, 苏秀荣, 丁方军 . 化肥减量配施生物有机肥对油菜生长及土壤微生物和酶活性影响
水土保持学报, 2018,32(1):352-360.
[本文引用: 1]

SONG Y L, YU J, CHEN S G, XIAO C Z, LI Y H, SU X R, DING F J . Effects of reduced chemical fertilizer with application of bio-organic fertilizer on rape growth, microorganism and enzymes activities in soil
Journal of Soil and Water Conservation, 2018,32(1):352-360. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[3] 邢旭明, 王红梅, 安婷婷, 李双异, 裴久渤, 梁文举, 汪景宽 . 长期施肥对棕壤团聚体组成及其主要养分赋存的影响
水土保持学报, 2015,29(2):267-273.
[本文引用: 1]

XING X M, WANG H M, AN T T, LI S Y, PEI J B, LIANG W J, WANG J K . Effects of long-term fertilization on distribution of aggregate size and main nutrient accumulation in brown earth
Journal of Soil and Water Conservation, 2015,29(2):267-273. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[4] 魏后凯 . 化肥农药使用减量行动计划亟须加快推进
中国人大, 2018(9):46.
[本文引用: 1]

WEI H K . Action plans for reducing fertilizer and pesticide use need to be accelerated
.The People’s Congress of China, 2018(9):46. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[5] 宫安东, 韩萌真, 孔宪巍, 魏彦博, 王磊, 程琳 . 茶树内生菌的应用性研究进展
信阳师范学院学报(自然科学版), 2017,30(1):168-172. (in Chinese)
[本文引用: 1]

GONG A D, HAN M Z, KONG X W, WEI Y B, WANG L, CHENG L . Application analysis of endophytic microbes in Camellia sinensis
Journal of Xinyang Normal University (Natural Science Edition), 2017,30(1):168-172. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[6] 张明艳, 张继光, 申国明, 张忠锋, 蔡宪杰, 薛林 . 烟田土壤微生物群落结构及功能微生物的研究现状与展望
中国农业科技导报, 2014,16(5):115-122.
[本文引用: 1]

ZHANG M Y, ZHANG J G, SHEN G M, ZHANG Z F, CAI X J, XUE L . Present research status and prospects of microbial communities structure and functional microorganisms in tobacco-planting soil
Journal of Agricultural Science and Technology, 2014,16(5):115-122. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[7] 史国英, 莫燕梅, 岑贞陆, 曾泉, 余功明, 杨丽涛, 胡春锦 . 一株高效解无机磷细菌BS06的鉴定及其解磷能力分析
微生物学通报, 2015,42(7):1271-1278.
DOI:10.13344/j.microbiol.china.140721Magsci [本文引用: 2]
【目的】对一株来源于广西甘蔗根际土壤的高效解无机磷细菌BS06的分类和解磷能力进行探讨，以期为解磷微生物在广西甘蔗生产上的开发和应用提供理论依据。【方法】通过形态观察、生理生化测定及16S rRNA基因序列同源性分析，进一步结合种特异的recA基因序列分析对解磷菌BS06进行分类鉴定；通过改变无机磷培养基中的碳源、氮源对菌株解磷能力的影响，分析菌株的解磷特性；通过盆栽试验了解菌株对甘蔗品种粤糖00236、桂糖28磷素吸收的影响。【结果】分类鉴定结果表明菌株BS06属于洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)；菌株在以乳糖为碳源条件下具有较强的解磷能力，其发酵液中水溶性磷含量为262.71 mg/L；在以硝酸钠为氮源条件下有较强解磷能力，其发酵液中水溶性磷含量达到305.85 mg/L；接种BS06菌株显著促进甘蔗组培苗的生长并提高甘蔗植株的含磷量。【结论】解磷细菌BS06具有较大的开发利用潜力。
SHI G Y, MO Y M, CEN Z L, ZENG Q, YU G M, YANG L T, HU C J . Identification of an inorganic phosphorus-dissolving bacterial strain BS06 and analysis on its phosphate solubilization ability
Microbiology China, 2015,42(7):1271-1278. (in Chinese)
DOI:10.13344/j.microbiol.china.140721Magsci [本文引用: 2]
【目的】对一株来源于广西甘蔗根际土壤的高效解无机磷细菌BS06的分类和解磷能力进行探讨，以期为解磷微生物在广西甘蔗生产上的开发和应用提供理论依据。【方法】通过形态观察、生理生化测定及16S rRNA基因序列同源性分析，进一步结合种特异的recA基因序列分析对解磷菌BS06进行分类鉴定；通过改变无机磷培养基中的碳源、氮源对菌株解磷能力的影响，分析菌株的解磷特性；通过盆栽试验了解菌株对甘蔗品种粤糖00236、桂糖28磷素吸收的影响。【结果】分类鉴定结果表明菌株BS06属于洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)；菌株在以乳糖为碳源条件下具有较强的解磷能力，其发酵液中水溶性磷含量为262.71 mg/L；在以硝酸钠为氮源条件下有较强解磷能力，其发酵液中水溶性磷含量达到305.85 mg/L；接种BS06菌株显著促进甘蔗组培苗的生长并提高甘蔗植株的含磷量。【结论】解磷细菌BS06具有较大的开发利用潜力。

[8] 樊磊, 叶小梅, 何加骏, 张建英 . 解磷微生物对土壤磷素作用的研究进展
江苏农业科学, 2008(5):261-263.
[本文引用: 1]

FAN L, YE X M, HE J J, ZHANG J Y . Research progress on the effect of phosphate-releasing microorganisms on soil phosphorus
.Jiangsu Agricultural Sciences, 2008(5):261-263. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[9] 鲁如坤, 时正元, 顾益初 . 土壤积累态磷研究Ⅱ.磷肥的表观积累利用率
土壤, 1995(6):286-289.
[本文引用: 1]

LU R K, SHI Z Y, GU Y C . Study on soil phosphorus accumulationⅡ. Apparent accumulation and utilization rate of phosphate fertilizer
.Soils, 1995(6):286-289. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[10] 杨珏, 阮晓红 . 土壤磷素循环及其对土壤磷流失的影响
土壤与环境, 2001,10(3):256-258.
[本文引用: 1]

YANG Y, RUAN X H . Soil circulation of phosphosrus and its effects on the soil loss of phosphorus
Soil and Environmental Sciences, 2001,10(3):256-258. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[11] 林启美, 赵小蓉, 孙焱鑫, 姚军 . 四种不同生态系统的土壤解磷细菌的数量及种群分布
土壤与环境, 2000,9(1):34-37.
[本文引用: 1]

LIN Q M, ZHAO X R, SUN Y X, YAO J . Community characters of soil phosphobacteria in four ecosystems
Soil and Environmental Sciences, 2000,9(1):34-37. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[12] ZAIDI A, KHAN M S, AMIL M . Interactive effect of rhizotrophic microorganisms on yield and nutrient uptake of chickpea ( Cicer arietinum L.)
European Journal of Agronomy, 2003,19(1):15-21.
[本文引用: 1]

[13] 曾广勤, 刘荣昌, 张爱民, 李风汀 . 磷细菌剂在小麦上应用研究
河北省科学院学报, 1997(3):26-29, 34.
[本文引用: 1]

ZENG G Q, LIU R C, ZHANG A M, LI F T . Application of phosphorous bacteria in wheat
.Journal of the Hebei Academy of Sciences, 1997(3):26-29, 34. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[14] 郝晶, 洪坚平, 刘冰, 张健, 李楠 . 不同解磷菌群对豌豆生长和产量影响的研究
作物杂志, 2006(1):73-76.
[本文引用: 1]

HAO J, HONG J P, LIU B, ZHANG J, LI N . Effect of different phosphate-solubilizing microorganisms on grow and yield of field-grown pea
.Crops, 2006(1):73-76. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[15] 张炳火, 李汉全, 罗娟艳, 杨建远, 石红璆, 孙凤珍 . 放线菌JXJ-0136对白菜和豇豆生长的影响及其解磷作用
中国农业科学, 2016,49(16):3152-3161.
[本文引用: 1]

ZHANG B H, LI H Q, LUO J Y, YANG J Y, SHI H Q, SUN F Z . Influences of actinomycete strain JXJ-0136 on the growth of Brassica chinensis and Vigna unguiculata and its phosphate solubilization
Scientia Agricultura Sinica, 2016,49(16):3152-3161. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[16] DA SILVA CEROZI B, FITZSIMMONS K . Use of Bacillus spp. to enhance phosphorus availability and serve as a plant growth promoter in aquaponics systems
Scientia Horticulturae, 2016,211:277-282.
[本文引用: 1]

[17] GILES C D, HSU P C, RICHARDSON A E, HURST M R H, HILL J E . Plant assimilation of phosphorus from an insoluble organic form is improved by addition of an organic anion producing Pseudomonas sp
Soil Biology & Biochemistry, 2014,68:263-269.
[本文引用: 1]

[18] LUDUENA L M, ANZUAY M S, MAGALLANES-NOGUERA C, TONELLI M L, IBANEZ F J, ANGELINI J G, FABRA A, MCINTOSH M, TAURIAN T . Effects of P limitation and molecules from peanut root exudates on pqqE gene expression and pqq promoter activity in the phosphate-solubilizing strain Serratia sp.S119
Research in Microbiology, 2017,168(8):710-721.
[本文引用: 1]

[19] 陈鑫鑫, 罗奕璇, 唐皓, 李有志, 樊宪伟 . Enterobacter sp.NG-33菌株对玉米根系及植株中氮磷钾含量的影响
基因组学与应用生物学, 2017,36(8):3273-3277.
[本文引用: 1]

CHEN X X, LUO Y X, TANG H, LI Y Z, FAN X W . Effect of Enterobacter sp. NG-33 strain on root and the nitrogen, phosphorus and potassium content in plant of maize
Genomics and Applied Biology, 2017,36(8):3273-3277. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[20] YANG L, LIU Y Q, CAO X Y, ZHOU Z J, WANG S Y, XIAO J, SONG C L, ZHOU Y Y . Community composition specificity and potential role of phosphorus solubilizing bacteria attached on the different bloom-forming cyanobacteria
Microbiological Research. 2017,205:59-65.
[本文引用: 1]

[21] 刘云华, 吴毅歆, 杨绍聪, 何鹏飞, 何月秋 . 洋葱伯克霍尔德溶磷菌的筛选和溶磷培养条件优化
华南农业大学学报, 2015,36(3):78-82.
[本文引用: 1]

LIU Y H, WU Y X, YANG S C, HE P F, HE Y Q . Screening of phosphorus-solubilizing strain Burkholderia cenocepacia and optimizing of phosphate-dissolving culture condition
Journal of South China Agricultural University, 2015,36(3):78-82. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[22] GONG A D, LI H P, YUAN Q S, SONG X S, YAO W, HE W J, ZHANG J B, LIAO Y C . Antagonistic mechanism of Iturin A and Plipastatin A from bacillus amyloliquefaciens S76-3 from wheat spikes against Fusarium graminearum
PLoS ONE, 2014,10(2):e0116871.
[本文引用: 1]

[23] 吴淑平, 吕立哲, 金开美, 赵丰华, 郑杰, 赵海力 . 信阳市茶叶主产区茶园土壤养分状况研究
山东农业科学, 2014,46(10):11-80.
[本文引用: 1]

WU S P, LV L Z, JIN K M, ZHAO F H, ZHENG J, ZHAO H L . Study on soil nutrient status of tea plantations in main producing areas in Xinyang City
Shandong Agricultural Sciences, 2014,46(10):11-80. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[24] 谢修鸿, 王晓红, 梁运江, 王吉, 江湃 . 三种土壤有效磷测定方法相关性的研究
吉林农业科学, 2015,40(3):30-32.
[本文引用: 1]

XIE X H, WANG X H, LIANG Y J, WANG J, JIANG P . Research on correlation of three analytic methods of soil available phosphorus
Journal of Jilin Agricultural Sciences, 2015,40(3):30-32. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[25] 宫安东 . 镰刀菌和黄曲霉菌生防菌的分离及拮抗机理的研究
[D]. 武汉: 华中农业大学, 2015.
[本文引用: 1]

GONG A D . Isolation and antagonistic mechanism analyses of biocontrol agents against fusarium and aspergillus species
[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2015. ( in Chinese)
[本文引用: 1]

[26] GONG A D, LI H P, SHEN L, ZHANG J B, WU A B, HE W J, YUAN Q S, HE J D, LIAO Y C . The Shewanella algae strain YM8 produces volatiles with strong inhibition activity against Aspergillus pathogens and aflatoxins
Frontiers in Microbiology, 2015,6:1091.
[本文引用: 2]

[27] TAYEB L A, LEFEVRE M, PASSET V, DIANCOURT L, BRISSE S, GRIMONT P A D . Comparative phylogenies of Burkholderia, Ralstonia, Comamonas, Brevundimonas and related organisms derived from rpoB, gyrB and rrs gene sequences
Research in Microbiology, 2008,159:169-177.
[本文引用: 1]

[28] 鲍朋, 许章峰 . 巨大芽孢杆菌在生物肥料上的研究现状与发展方向
农技服务, 2013,30(6):601-602.
[本文引用: 1]

BAO P, XU Z F . Research status and development trend of giant bacillus on biological fertilizer
Agricultural extension service, 2013,30(6):601-602. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[29] AHUJA A, GHOSH S B, D’SOUZA S F . Isolation of a starch utilizing, phosphate solubilizing fungus on buffered medium and its characterization
Bioresource Technology, 2007,98(17):3408-3411.
DOI:10.1016/j.biortech.2006.10.041URL [本文引用: 1]

[30] 张云霞, 雷鹏, 许宗奇, 冯小海, 徐虹, 许仙菊 . 一株高效解磷菌Bacillus subtilis JT-1的筛选及其对土壤微生态和小麦生长的影响
江苏农业学报, 2016,32(5):1073-1080.
[本文引用: 1]

ZHANG Y X, LEI P, XU Z Q, FENG X H, XU H, XU X J . Screening of a high-efficiency phosphate solubilizing bacterium Bacillus subtilis JT-1 and its effects on soil microecology and wheat growth
Jiangsu Journal of Agricultural Sciences, 2016,32(5):1073-1080. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[31] 余贤美, 王义, 沈奇宾, 李炳龙, 贺春萍, 郑服丛 . 解磷细菌PSB3的筛选及拮抗作用的研究
微生物学通报, 2008,35(9):1398-1403.
Magsci [本文引用: 1]
利用有机磷细菌液体培养基进行生物富集, 无机磷细菌固体培养基通过平板稀释法进行分离筛选, 建立了土壤解磷细菌的筛选体系。扩增菌株PSB3的16S rDNA序列, 序列测定结果显示, 该片段长度为1525 bp, 经Blastn搜索进行序列比对, 该细菌为洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)。对该菌株与供试的12个炭疽菌和镰刀菌菌株进行室内拮抗试验, 结果显示, 该菌株对Fusarium solani等6个菌株有不同程度的拮抗作用。
YU X M, WANG Y, SHEN Q B, LI B L, HE C P, ZHENG F C . The screening of phosphorus solubilizing Bacteria PSB3 and the study of its antagonism
Microbiology, 2008,35(9):1398-1403. (in Chinese)
Magsci [本文引用: 1]
利用有机磷细菌液体培养基进行生物富集, 无机磷细菌固体培养基通过平板稀释法进行分离筛选, 建立了土壤解磷细菌的筛选体系。扩增菌株PSB3的16S rDNA序列, 序列测定结果显示, 该片段长度为1525 bp, 经Blastn搜索进行序列比对, 该细菌为洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)。对该菌株与供试的12个炭疽菌和镰刀菌菌株进行室内拮抗试验, 结果显示, 该菌株对Fusarium solani等6个菌株有不同程度的拮抗作用。

[32] 戴沈艳, 申卫收, 贺云举, 陈雯雯, 钟文辉 . 一株高效解磷细菌的筛选及其在红壤性水稻土中的施用效果
应用与环境生物学报, 2011,17(5):678-683.
[本文引用: 1]

DAI S Y, SHEN W S, HE Y J, CHEN W W, ZHONG W H . Screening of ef?cient phosphate-solubilizing bacterial strain and its application in red paddy soil to rice cultivation
Chinese Journal of Applied & Environmental Biology, 2011,17(5):678-683. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[33] 张爱民 . 解磷解钾特异菌株 CX-7 的筛选及其应用试验研究
[D]. 河北: 河北农业大学, 2014.
[本文引用: 1]

ZHANG A M . Screening of the specific solubilizin phosphate and poassium CX-7 strain and research on its applying experiment
[D]. Hebei: Hebei Agricultural University, 2014. ( in Chinese)
[本文引用: 1]

[34] 王琰 . 解磷芽孢杆菌的筛选鉴定及其对玉米促生机理的研究
[D]. 广州: 华南农业大学, 2016.
[本文引用: 1]

WANG Y . Study on isolation of Phosphate-solubilizing Bacillus and their impact of growth-promoting for maize
[D]. Guangzhou: South China Agricultural University, 2016. ( in Chinese)
[本文引用: 1]

[35] 施俊凤, 孙常青, 张婧婷 . 采前喷施洋葱伯克霍尔德菌Burkholderia contaminans对草莓采后腐烂和品质的影响
植物保护学报, 2018,45(2):382-388.
[本文引用: 1]

SHI J F, SUN C Q, ZHANG J T . Effects of preharvest spraying of Burkholderia contaminans on postharvest decay and quality of strawberry
Journal of Plant Protection, 2018,45(2):382-388. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[36] 叶建仁, 任嘉红, 李浩, 吴小芹 . 洋葱伯克霍尔德氏菌及其在林木病害防治中的应用
南京林业大学学报(自然科学版), 2013,37(4):149-155.
[本文引用: 1]

YE J R, REN J H, LI H, WU X Q . Application and its prospect analysis for Burkholderia cepacia in forest disease control
Journal of Nanjing Forestry University( Natural Sciences Edition) , 2013,37(4):149-155. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[37] ZHAO K, PENTTINEN P, ZHANG X P, AO X L, LIU M K, YU X M, CHEN Q . Maize rhizosphere in Sichuan, China, hosts plant growth promoting Burkholderia cepacia with phosphate solubilizing and antifungal abilities
Microbiological Research, 2013,7:3.
[本文引用: 1]

[38] LEMTUKEI D, TAMURA T, NGUYEN Q T, UENO M . Inhibitory activity of Burkholderia sp. isolated from soil in Gotsu City, Shimane, against Magnaporthe oryzae
Advances in Microbiology, 2017,7:137-148.
[本文引用: 1]

[39] BACH E, SEGER G D D S, FEMANDES G D C, LISBOA B B, PASSAGLIA L M P . Evaluation of biological control and rhizosphere competence of plant growth promoting bacteria
Applied Soil Ecology, 2016,99:141-149.
DOI:10.1016/j.apsoil.2015.11.002URL [本文引用: 1]

[40] ROJAS-ROJAS F U, SALAZAR-GóMEZ A, VARGAS-DíAZ M E, VáSQUEZ-MURRIETA M S, HIRSCH A M, DE MOT R, GHEQUIRE M G K, IBARRA J A, ESTRADA-DE LOS SANTOS P . Broad-spectrum antimicrobial activity by Burkholderia cenocepacia TAtl-371, a strain isolated from the tomato rhizosphere
Microbiology, 2018,164(9):377.
[本文引用: 1]

[41] 张清霞, 何玲玲, 单海焕, 童蕴慧, 陈夕军, 纪兆林, 刘凤权 . 桃褐腐病生防细菌FD6硝吡咯菌素合成基因簇的克隆及prnA功能分析
园艺学报, 2016,43(8):1473-1481.
DOI:10.16420/j.issn.0513-353x.2016-0047Magsci [本文引用: 1]
<p>荧光假单胞菌（<em>Pseudomonas fluorescens</em>）FD6分离自福建闽侯青口青菜根围土壤，采用凹玻片法和离体果实接种法测定菌株FD6对桃褐腐病菌（<em>Monilinia fructicola</em>）的抑制能力。PCR法克隆硝吡咯菌素合成基因簇结构基因（<em>prn</em>），利用同源重组构建<em>prnA</em>缺失突变体并分析其功能。结果表明，菌株FD6处理桃后可完全抑制桃褐腐病发生；细菌悬浮液对褐腐病菌分生孢子的萌发抑制率达93.18%，细菌培养滤液的抑制率为69.36%；细菌悬浮液对黄瓜根结线虫也具有较强的致死作用。序列分析表明荧光假单胞菌FD6硝吡咯菌素合成基因簇全长为5 868 bp，内含4个开放阅读框<em>prnA</em>、<em>prnB</em>、<em>prnC</em>和<em>prnD</em>，<span>这</span>4个基因组成1个共转录单元。系统发育进化树显示菌株FD6与<em>P. protegens</em> CHA0、Pf-5的<em>prn</em>基因相似性达94%。利用遗传学方法证实<em>prnA</em>基因是硝吡咯菌素合成的必需因子，此外该基因还影响2,4&ndash;二乙酰基间苯三酚和藤黄绿脓菌素的合成。</p>
ZHANG Q X, HE L L, SHAN H H, TONG Y H, CHEN X J, JI Z L, LIU F Q . Cloning of pyrrolnitrin synthetic gene cluster prn and prnA functional analysis from Antagnistic Bacteria FD6 against peach brown rot
Acta Horticulturae Sinica, 2016,43(8):1473-1481. (in Chinese)
DOI:10.16420/j.issn.0513-353x.2016-0047Magsci [本文引用: 1]
<p>荧光假单胞菌（<em>Pseudomonas fluorescens</em>）FD6分离自福建闽侯青口青菜根围土壤，采用凹玻片法和离体果实接种法测定菌株FD6对桃褐腐病菌（<em>Monilinia fructicola</em>）的抑制能力。PCR法克隆硝吡咯菌素合成基因簇结构基因（<em>prn</em>），利用同源重组构建<em>prnA</em>缺失突变体并分析其功能。结果表明，菌株FD6处理桃后可完全抑制桃褐腐病发生；细菌悬浮液对褐腐病菌分生孢子的萌发抑制率达93.18%，细菌培养滤液的抑制率为69.36%；细菌悬浮液对黄瓜根结线虫也具有较强的致死作用。序列分析表明荧光假单胞菌FD6硝吡咯菌素合成基因簇全长为5 868 bp，内含4个开放阅读框<em>prnA</em>、<em>prnB</em>、<em>prnC</em>和<em>prnD</em>，<span>这</span>4个基因组成1个共转录单元。系统发育进化树显示菌株FD6与<em>P. protegens</em> CHA0、Pf-5的<em>prn</em>基因相似性达94%。利用遗传学方法证实<em>prnA</em>基因是硝吡咯菌素合成的必需因子，此外该基因还影响2,4&ndash;二乙酰基间苯三酚和藤黄绿脓菌素的合成。</p>

[42] 周莲, 蒋海霞, 金凯明, 孙爽, 张薇, 张雪洪, 何亚文 . 高产申嗪霉素和吩嗪-1-酰胺的水稻根际铜绿假单胞菌PA1201分离、鉴定与应用潜力
微生物学报, 2015,55(4):401-411.
[本文引用: 1]

ZHOU L, JIANG H X, JIN K M, SUN S, ZHANG W, ZHANG X H, HE Y W . Isolation, identification and characterization of rice rhizobacterium Pseudomonas aeruginosa PA1201 producing high level of biopesticide “Shenqinmycin” and phenazine-1-carboxamide
Acta Microbiologica Sinica, 2015,55(4):401-411. (in Chinese)
[本文引用: 1]

[43] 赵惠 . 杀线虫活性生防细菌筛选鉴定及脂肽的初步分离
[D]. 沈阳: 沈阳农业大学, 2018.
[本文引用: 1]

ZHAO H . Screening and identification of nematicidal bacteria and preliminary separation of lipopeptide
[D]. Shenyang: Shenyang Agricultural University, 2018. ( in Chinese)
[本文引用: 1]

[44] HUANG C J, TSAY J F, CHANG S Y, YANG H P, WU W S, CHEN C Y . Dimethyl disulfide is an induced systemic resistance elicitor produced by Bacillus cereus C1L
Pest Management Science, 2012,68(9):1306-1310.
[本文引用: 2]

[45] BRIARD B, HEDDERGOTT C, LATGE J P . Volatile compounds emitted bypseudomonas aeruginosa stimulate growth of the fungal pathogen Aspergillus fumigatus
mBio, 2016,7(2):e00219-16.
[本文引用: 1]

[46] KAI M, PIECHULLA B . Impact of volatiles of the rhizobacteria Serratia odorifera on the moss Physcomitrella patens
Plant Signaling & Behavior, 2010,231(4):444-446.
[本文引用: 1]

[47] WANG D, ROSEN C, KINKEL L, CAO A, THARAYIL N, GERIK J . Production of methyl sulfide and dimethyl disulfide from soil- incorporated plant materials and implications for controlling soilborne pathogens
Plant and Soil, 2009,324(1/2):185-197.
DOI:10.1007/s11104-009-9943-yURL [本文引用: 1]

[48] SéBASTIEN D, ERIC T, AHMED A G, JACQUES H . How a specialist and a non‐specialist insect cope with dimethyl disulfide produced by Allium porrum
Entomologia Experimentalis et Applicata, 2004,113(3):173-179.
[本文引用: 1]

[49] PAPAZLATANI C, ROUSIDOU C, KATSOULA A, KOLYVAS M, GENITSARIS S, PAPADOPOULOU K K, KARPOUZAS D G . Assessment of the impact of the fumigant dimethyl disulfide on the dynamics of major fungal plant pathogens in greenhouse soils
European Journal of Plant Pathology, 2016,146(2):391-400.
DOI:10.1007/s10658-016-0926-6URL [本文引用: 1]

[50] PIECHULLA B, LEMFACK M C, KAI M . Effects of discrete bioactive microbial volatiles on plants and fungi
Plant, Cell & Environment, 2017,40(10):2042-2067.
[本文引用: 1]