,, 刘永峰,, 魏燕超, 申倩, 王一凡陕西师范大学食品工程与营养科学学院,西安 710062Qualitative and Quantitative Detection Methods of Pork in Beef and Its Chinese Processing Products
ZHU Yang,, LIU YongFeng,, WEI YanChao, SHEN Qian, WANG YiFanCollege of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062通讯作者:
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收稿日期:2018-05-10接受日期:2018-07-25网络出版日期:2018-11-16
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Received:2018-05-10Accepted:2018-07-25Online:2018-11-16
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朱扬, 刘永峰, 魏燕超, 申倩, 王一凡. 牛肉及其中式加工品中猪肉成分的定性、定量检测方法研究[J]. 中国农业科学, 2018, 51(22): 4352-4363 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.22.013
ZHU Yang, LIU YongFeng, WEI YanChao, SHEN Qian, WANG YiFan.
0 引言
【研究意义】近年来,食品行业的欺诈行为引起了人们对健康问题的关注。食品欺诈是指对食品配料或食品包装,标签,生产信息或产品进行故意的替代、添加、篡改或虚假陈述,以获得可能影响消费者健康的经济利益[1]。而肉类掺假主要是由低价值的肉类替代了高营养、高价值的肉类,添加未申报的物种或用植物蛋白质代替肌肉蛋白质[2]。除了经济问题外,人们对于肉类掺假所造成的健康问题的关注度也逐步增长[3,4]。由于制假产品人们在宏观方面不易辨别,因此,需要一种科学准确的方法对市面上的样品进行鉴定,为执法机关在打击制假的时候,提供确凿的证据[5]。【前人研究进展】目前已经提出了几种分析技术来鉴定混合样品中的肉类物种,其中包括基于蛋白质的方法,如高效液相色谱法,电泳技术和酶联免疫吸附测定[6]。这些方法在应用于加工肉类时是不精确的,因为蛋白质在加热,加压和脱水过程中会发生变性,且基于蛋白质的测定法,在交叉反应影响下,区分密切相关的物种时不够敏感[7,8,9]。基于DNA的PCR扩增序列分析可以使用线粒体或核基因DNA,与蛋白质相比,DNA更加稳定和特异,而且相对容易获得,这意味着它是分子检测方法的一个很好的选择。聚合酶链式反应（PCR）基于其速度,灵敏度,简便性和可靠性,已经发展成为一种成熟的食品掺假检测技术[10,11]。因此,PCR是理想的加工肉类和肉类产品的物种鉴定方法。而SYBR Green I实时PCR检测法不需要单独的设计探针,是最简单,最便宜和最直接的荧光系统[12]。2015年,HOU等[13]使用多重PCR技术建立了检测鸡鸭鹅DNA的方法;IWOBI等[14]建立了一种用于定量肉中牛肉和猪肉分量的多重实时PCR方法。林彦星等[15]和刘岑杰等[16]建立了肉制品中鸭源性成分的实时荧光PCR检测方法;张国华[17]建立了基于实时荧光PCR定量检测肉制品猪源性成分的研究方法。【本研究切入点】大多数研究都是基于不同物种鲜肉样品的掺假研究,关于深加工肉品的定量掺假检验的灵敏度和检测限研究较少,针对热加工肉样的定量掺假研究更是鲜有报道。【拟解决的关键问题】本研究采用干、蒸、煮、炖、煎、炸和烤等方法处理牛肉和猪肉,提取生猪肉及不同加工猪肉制品中的猪基因组DNA,通过DNA质量检测、PCR扩增、灵敏度试验,分析加工方式对猪DNA质量、灵敏度和检测限的影响;制备生牛肉和经干、蒸、煮、炖、煎、炸、烤制处理的牛肉制品中掺入不同比例（10%、5%、1%、0.1%）猪肉的二元混合肉,进行普通PCR和荧光定量PCR定性定量检测,探索DNA在掺假鉴别中的应用。从而,开发一种加工牛肉制品中猪肉成分的定性、定量检测方法,为肉类行业质量控制和检验计划以及验证标签声明提供可靠的依据,以保证某一畜禽肉制品的纯正性。1 材料与方法
研究于2017年3月至2018年1月在陕西师范大学食品工程与营养科学学院进行。1.1 试验材料及处理
本研究样品为猪肉和牛肉,采自西安华润万家超市,在-20℃冷冻储藏。试验时取适量猪肉于4℃冰箱中解冻24 h,分割为1 cm×1 cm×3 cm的块状。分别对猪肉、牛肉采用张兰[18]的干制、蒸制、煮制、炖制、煎制、炸制和烤制等传统中式加工方式处理,得到7种猪肉样品和牛肉样品。对于单独的猪肉样品设置1个生肉对照组和7个加工处理组;制备干、蒸、煮、炖、煎、炸、烤制的牛肉样品和猪肉样品的混合肉样,以混合的生猪肉和生牛肉作为对照组,其中每个试验组中猪肉分别占10%、5%、1%和0.1%（w/w）的比例,最终各试验组样品重量为40 g。考虑到熟肉制品的掺假检测时间不确定,我们选择了肉制品货架期的中间时间（6个月）,对所有熟肉样进行6个月的4℃冷藏放置,为保证时间统一,生猪肉和生牛肉在冰箱冷冻储藏6个月。
1.2 主要试剂与仪器
试剂：Tris Cl、NaCl、EDTA、苯酚、异戊醇、氯仿、无水乙醇、SDS,西安晶博生物科技有限公司;蛋白酶K、RNA酶、引物、TaqMan Universal PCR Master Mixture、2×Ultal SYBR Mixture、Marker DL 2000,西安励合生物科技有限公司。仪器：Nanodrop ND-1000分光光度计、梯度PCR仪和荧光定量PCR仪,美国热电公司;凝胶成像仪,美国西盟公司。
1.3 肉中DNA提取
将所有肉样用研钵研磨成粉末用于DNA的提取,将约300 mg的组织与560 μL DNA缓冲液（pH 8.0,100 mmol·L-1 Tris Cl、100 mmol·L-1 NaCl和5 mmol·L-1 EDTA）,150 μL 5% SDS、18 μL的蛋白酶K（20 mg·mL-1）涡旋使溶液充分混匀,置于56℃水浴锅中加热消化4 h。然后将等体积的苯酚加入到消化的细胞浓缩物中,手摇10 min,然后以12 000 r/min离心10 min,得到上清液。将上清液用等体积的苯酚:氯仿:异戊醇（体积比为25:24:1）萃取1次,用等体积的氯仿:异戊醇（体积比为24:1）萃取1次。并在37℃下用10 mg·mL-1 RNA酶将RNA降解30 min,用等体积的氯仿:异戊醇（体积比为24:1）再萃取1次,在1.5 mL离心管中以12 000 r/min离心10 min,得到上清液。最后,用冰的无水乙醇沉淀DNA,用乙醇:水（体积比为7:3）洗涤1次。加入100 μL TE（pH = 8.0,1 mmol·L-1 Tris Cl和0.5 mmol·L-1 EDTA）以溶解DNA。1.4 猪肉及其肉制品中DNA含量、纯度、完整性和PCR扩增效果检测
使用分光光度计,测定样品中DNA含量,以260 nm和280 nm处的吸光度作为纯度指数。将猪DNA在100 V下用1%琼脂糖凝胶电泳40 min。电泳后,在紫外光成像分析仪下观察凝胶检测DNA完整性。通过PCR扩增,引物序列见表1,以验证所有分离物中可扩增线粒体DNA的存在,为消除样品之间DNA提取效率的差异,需要对PCR模板进行标准化处理（即每个PCR反应的DNA模板标准化为50 ng·μL-1）。Table 1
表1
表1引物序列及扩增片段长度
Table 1
| 引物名称 Primer name | 引物序列（5′–3′） Primer sequence (5′-3′) | 片段大小 Fragment size (bp) | 资料来源 Source |
|---|---|---|---|
| Cytb | F: ATGAAACATTGGAGTAGTCCTACTATTTACC R: CTACGAGGTCTGTTCCGATATAAGG | 149 | DOOLEY[19] |
| 18S rRNA | F: TCTGCCCTATCAACTTTCGATGG R: TAATTTGCGCGCCTGCTG | 140 | FAJARDO[20] |
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PCR扩增条件：在94℃预变性5 min,然后在94℃变性30 s,63℃退火30 s,35个循环,72℃延伸30 s,最后在72℃总延伸10 min。PCR扩增体系：3.4 μL Mixture,引物各0.3 μL（0.3 μmol·L-1）,2 μL DNA模板,加入ddH2O至10 μL,PCR产物在 100 V下用1%琼脂糖凝胶电泳40 min,并在UV光下拍照。
1.5 猪肉及其肉制品中DNA的普通PCR灵敏度检测
将猪肉及其肉制品中猪DNA按10倍系列稀释,以检测热加工对猪DNA模板灵敏度的影响（范围为1:1—1:10 000,相当于DNA浓度为50 ng·μL-1— 5 pg·μL-1）,使用上述PCR条件,在100 V下用1%琼脂糖凝胶电泳40 min,并在UV光下拍照。1.6 猪肉及其肉制品中DNA的定量PCR灵敏度检测
将猪肉及其肉制品中猪DNA按照普通PCR灵敏度试验的稀释方法进行处理,用SYBR Green I染料进行实时PCR,测定Cytb的扩增效率和检测限（LOD）。通过绘制实时PCR分析的Ct值与DNA浓度的对数,进行每个稀释度的3次重复以构建标准曲线。使用以下等式从标准曲线的斜率计算扩增效率：扩增效率（%）= [10(-1/斜率) - 1]×100
实时PCR在两步法热循环条件下进行。95℃ 10 min,95℃循环45次、30 s和65℃ 1 min,每个循环结束时收集荧光信号。制备包含5 μL 2×Ultal SYBR Mixture,上下游引物各0.3 μL（0.3 μmol·L-1）,DNA模板1 μL（50 ng·μL-1）,加入ddH2O至10 μL。对于熔解曲线数据,温度从65℃升高到94℃。
1.7 普通PCR定性检测牛肉中掺假猪肉成分
按照上述猪肉中DNA的提取方法,对牛肉中含有10%、5%、1%和0.1%（w/w）猪肉的二元混合肉进行DNA提取,以线粒体基因Cytb为目标基因,使用上述PCR条件进行扩增,在100V下用1%琼脂糖凝胶电泳40 min,并在UV光下拍照。根据PCR扩增结果,对不同掺假比例的混合肉最低检测限进行分析。1.8 定量PCR检测牛肉中掺假猪肉成分
分别以Cytb和18S rRNA为目标基因和内参基因,以混合肉的DNA为模板进行定量PCR扩增,引物序列见表1。每个二元混合肉样品设置3个重复,使用上述定量PCR条件。为消除样品之间DNA提取效率的差异,同样也对模板进行标准化处理（即每个PCR反应的DNA模板为50 ng·μL-1）。比较目的基因和内参基因的Ct值来计算ΔCt,定量二元模型混合物中10%、5%、1%、0.1%（w/w）的猪肉。采用下述表达式构建标准曲线：ΔCt=Ct（猪肉）-Ct（内参基因）
式中,Ct（猪线粒体基因）和Ct（猪内参基因）分别对应于猪Cytb和18S rRNA基因的周期阈值。
2 结果
2.1 猪肉及其肉制品中DNA含量、纯度和完整性的检测结果
2.1.1 DNA含量与纯度的检测 加工方式对猪肉样品DNA含量和纯度的影响结果见表2。基于分光光度计的测定,DNA含量范围为110—277 μg·g-1。单因素分析显示加工方法显著影响DNA含量（P<0.05）,且经热加工处理的肉制品的DNA含量显著高于生肉试验组（P<0.05）。加工方法也显著影响了DNA纯度（P<0.05）,理论上DNA纯度（A260 nm/A280nm）高于1.8。试验组中DNA纯度范围为1.810—1.977,符合理论值。Table 2
表2
表2猪肉及其肉制品中DNA的含量和纯度
Table 2
| 烹调方式 Cooking method | 浓度 Concentration (μg·g-1) | A260nm/A280nm |
|---|---|---|
| 生肉（对照组） Raw meat (control group) | 110.6±18.8e | 1.973±0.025a |
| 干制 Dried | 182.3±1.48d | 1.893±0.289b |
| 蒸制 Steaming | 215.1±2.67c | 1.873±0.006bc |
| 煮制 Cooking | 276.5±8.8b | 1.810±0.010d |
| 炖制 Stew | 145.7±1.33a | 1.853±0.006c |
| 煎制 pan-Frying | 222.3±6.04d | 1.810±0.010d |
| 炸制 Frying | 275.9±7.71b | 1.977±0.006a |
| 烤制 Baked | 153.1±19.7a | 1.947±0.011b |
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2.1.2 DNA琼脂糖凝胶电泳检测 凝胶电泳结果如图1所示,放置6个月后生猪肉和7种肉制品的猪DNA虽然严重降解,但生猪肉依然能获得一些不清晰的长片段DNA,而7种肉制品经长时间放置后DNA全部降解为小片段DNA,说明放置时间和热处理会显著影响肉制品中DNA的完整性;PCR扩增线粒体基因的结果如图2所示,生肉组和7种不同加工处理组均可获得清晰且单一的扩增产物条带,表明猪肉及其制品中DNA虽然降解严重,但依然可以进行PCR扩增。可见从加工肉制品中提取的DNA可以开展后续的灵敏度试验和掺假检测试验。
图1
新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT图1猪肉及其肉制品中DNA琼脂糖凝胶电泳图
泳道1：生肉、2：干制、3：蒸制、4：煮制、5：炖制、6：煎制、7：炸制、8：烤制; M：DL2000 Marker
Fig. 1DNA agarose gel electrophoresis map of pork and its meat products
Lane 1: Raw meat, 2: Dry, 3: Steamed, 4: Cooked, 5: Stewed, 6: Pan-fried, 7: Fried, 8: Baked; M: DL2000 Marker
图2
新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT图2猪肉及其肉制品中DNA的PCR产物凝胶电泳图
泳道1：生肉、2：干制、3：蒸制、4：煮制、5：炖制、6：煎制、7：炸制、8：烤制;M：DL2000 Marker
Fig. 2Gel electrophoresis of PCR products of DNA in pork and its meat products
Lane 1: Raw meat, 2: Dry, 3: Steamed, 4: Cooked, 5: Stewed, 6: Pan-fried, 7: Fried, 8: Baked; M: DL2000 Marker
2.2 猪肉及其肉制品中DNA的PCR灵敏度分析结果
2.2.1 猪肉及其肉制品中DNA的普通PCR灵敏度检测 将猪DNA提取物10倍梯度稀释,测定DNA浓度后,进行普通PCR扩增,评估普通PCR对猪DNA的检测灵敏度,结果如图3所示,从泳道1到用泳道5,目的条带亮度逐渐减小,说明PCR能够检测到的信号随DNA模板量的减少而减少。8个试验组的猪DNA模板的检测限均可达到0.005 ng,结果表明基于猪DNA的PCR测定是高度敏感的。图3
新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT图3猪肉及其肉制品中DNA的普通PCR灵敏度试验结果
生肉（A）、干制（B）、蒸制（C）、煮制（D）、炖制（E）、煎制（F）、炸制（G）、烤制（H）;M：DL2000 Marker,N：阴性对照;泳道1-5：50、5、0.5、0.05、0.005 ng
Fig. 3Common PCR sensitivity test results for DNA in pork and its meat products
Raw meat (A), Dried (B), Steamed (C), Cooked (D), Stewed (E), Pan-fried (F), Fried (G), Baked (H); M: DL2000 Marker, N: Negative control; Lanes 1-5: 50, 5, 0.5, 0.05, 0.005 ng
2.2.2 猪肉及其肉制品中DNA的定量PCR灵敏度检测 对猪DNA进行10倍梯度稀释,对5个数量级的DNA模板进行了定量PCR检测,获得的Ct值与初始DNA量的对数建立的8个标准曲线见图4。8个试验组的阈值循环方程分别为y=-3.623x+24.373、y=-3.4897x+22.953、y=-3.66x+24.312、y=-3.6088x+ 24.948、y=-3.5278x+24.217、y=-3.4757x+20.027、y=-3.2403x+20.037、y=-3.5283x+22.607、y=-3.394x+ 23.298,其斜率在-3.1—3.7。标准曲线的决定系数R2分别为0.9907、0.9952,0.9914、0.9974、0.9942、0.9901、0.9928、0.9902、0.9934,R2值均大于0.99,说明方程线性关系良好。经计算PCR扩增效率分别为0.89、0.93、0.88、0.89、0.92、0.94、0.92、0.97,PCR效率范围在89%—100%,说明具有较高的扩增效率。猪肉及其肉制品中DNA检测的最低水平均为0.005 ng,说明荧光定量PCR在此检验范围内结果较为可靠,能够进行下一步分析。
图4
新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT图4猪肉及其肉制品的不同浓度梯度DNA对应的标准曲线
生肉（A）、干制（B）、蒸制（C）、煮制（D）、炖制（E）、煎制（F）、炸制（G）、烤制（H）
Fig. 4Standard curve corresponding to different concentration gradient DNA of pork and its meat products
Raw meat (A), Dried (B), Steamed (C), Cooked (D), Stewed (E), Pan-fried (F), Fried (G), Baked (H)
2.3 普通PCR定性检测牛肉中掺假猪肉成分的结果
普通PCR定性检测牛肉中猪肉成分结果如图5所示,除炸制混合肉（为1%）外,混合生肉及其他6种混合肉制品的最低检测限均为0.1%,且随猪肉成分的减少,可以明显的观察到目的条带的亮度逐渐减小。试验表明普通PCR能够明确的检测到微量的猪肉成分,实现不同加工方式下掺假样品的定性检测。图5
新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT图5普通PCR定性检测牛肉中掺假猪肉成分结果
生肉（A）、干制（B）、蒸制（C）、煮制（D）、炖制（E）、煎制（F）、炸制（G）、制烤（H）;M：DL2000 Maker,N：阴性对照;泳道1-5：100%,10%,5%,1%,0.1%
Fig. 5Qualitative PCR for the determination of adulterated pork in beef
Raw meat (A), Dried (B), Steamed (C), Cooked (D), Stewed (E), Pan-fried (F), Fried (G), Prepared baked (H); M : DL2000 Maker, N: Negative control; Lanes 1-5: 100%, 10%, 5%, 1%, 0.1%
2.4 定量PCR检测牛肉中掺假猪肉成分的结果
为了相对量化猪肉,基于定量PCR标准化扩增效率构建校准曲线是必需的。通过ΔCt与猪肉百分比的对数建立的8个定量校准曲线见图6。8个试验组的标准曲线均呈现出良好的线性关系,决定系数R2分别为0.994、0.998、0.9995、0.9993、0.9991、0.9999、0.9984、0.9974,斜率在3.1—3.6。SYBR Green I定量PCR方法可以检测出牛肉中含量为0.1%—10%的猪肉,其覆盖至少3个数量级的线性动态范围,与BUSTIN等[21]PCR试验结果的范围基本一致。这8个试验组的标准曲线都可以达到相同的动态范围（0.1%—10%）和相对定量限（LOQ）,相对LOQ为0.1%（w/w）。比较生肉组和其他试验组的数据发现,干、蒸、煮、炖、煎5个试验组的标准曲线比生肉组的标准曲线的截距分别高0.6、0.3、0.1、0.1、0.6个循环,而炸、烤试验组的标准曲线比生肉组的标准曲线的截距分别低0.1、0.4个循环,可见生肉的标准曲线与7种肉制品的标准曲线的截距之间存在约0.1—0.6个循环的差异,表明定量PCR 2个基因的扩增效率受热处理的影响有一定差异。图6
新窗口打开|下载原图ZIP|生成PPT图6定量PCR检测牛肉中掺假猪肉成分标准曲线
生肉（A）、干制（B）、蒸制（C）、煮制（D）、炖制（E）、煎制（F）、炸制（G）、烤制（H）
Fig. 6Quantitative PCR to determine the standard curve of adulterated pork in beef
Raw meat (A), Dried (B), Steamed (C), Cooked (D), Stewed (E), Pan-fried (F), Fried (G), Baked (H)
3 讨论
3.1 加工方式对猪肉及其肉制品中DNA质量的影响
商业肉制品一般都经过多道加工程序,肉质的理化性质发生很大变化,加工过程中添入的辅料和香辛料在很大程度上增加了物种检测的难度。在深度加工过程中,高温高压会导致原料DNA变性,遭到破坏。且在DNA提取过程中残留的酚类物质会抑制PCR反应,从而造成假阴性,影响后续试验的进行[22,23]。因此,从加工的肉制品中提取高质量的DNA模板是普通PCR和荧光定量PCR测定成功的关键步骤[24]。本研究显示高温加工样品的DNA含量明显高于生肉样品。加工样品DNA的高含量可能与加工过程中高温处理有关,由于高温造成细胞膜通透性增加,从而使更多的DNA从个别的肌肉细胞释放;且DNA从双链到单链的变性会引起增色效应,该效应使得DNA溶液在UV光（260 nm）下的吸光度值增加,导致熟肉的DNA含量增加[25]。
DNA的完整性也是DNA质量的重要参数,可直接反映DNA片段的长度,而更长的片段可能有助于PCR扩增,因为它包含更多所需的扩增区域。琼脂糖凝胶电泳结果显示热处理明显影响DNA片段的完整性。有研究表明,将肉加热到100℃及其以上,会导致DNA片段大小减少72%以上[26],因此高温会严重影响DNA的完整性。虽然没有获得完整的DNA片段,但这些样品仍然可以用于PCR扩增。通过PCR扩增加工肉制品中所获DNA,也可以获得单一且清晰的PCR产物条带,从而为本研究后续运用PCR技术开展掺假检测研究奠定了基础。
3.2 加工方式对猪肉及其肉制品中PCR灵敏度的影响
对于热加工的产品,有研究表明高温导致DNA变性,被降解为小片段,推荐使用短扩增子[26]。与单拷贝或低拷贝核DNA基因相比,短扩增子可以增加DNA扩增的可能性,提高测定灵敏度[12]。因此,本研究中优化了PCR扩增条件,通过扩增肉中DNA,评估了热处理对敏感度的影响。普通PCR结果显示,加工肉产品受热处理的影响较大,随模板含量减少目的条带亮度也明显降低,且不同加工方式下的检测限均可达到0.005 ng,表明灵敏度检测可达到pg级。KESMEN等[27]试验结果显示,高压蒸后猪肉检测的灵敏度下降,而在烤熟肉制品中,灵敏度不受影响,与本研究结果基本一致,所以基于猪DNA模板的普通PCR反应是高度敏感的,可用于肉品掺假检测分析。普通PCR凝胶电泳检测的结果不直观,而且容易产生假阳性[28]。与普通PCR比,实时荧光定量PCR具有准确性高、特异性强、灵敏度高等优点,在病原检测、食品卫生和物种测定等领域得到了广泛的应用,能有效避免交叉污染[29,30]。利用10倍连续稀释的猪肉DNA,进行定量PCR,以Ct值为纵坐标,以初始DNA模板含量的lg值为横坐标建立标准曲线,8条标准曲线都具有良好的线性和相关性,PCR效率高。定量PCR检测结果与SóNIA等[12]的研究结果一致,灵敏度最低检测限都达到了0.005 ng,说明该方法可用于肉制品的定量掺假检测。
3.3 牛肉制品中猪肉成分的定性定量检测
肉类掺假中经常出现用便宜的肉类和植物蛋白替代高价值的肉类,为了经济和健康的原因,防止使用较不理想的肉类物质掺入肉制品的研究是非常重要的[9]。我们使用基于DNA的普通PCR和定量PCR扩增来自线粒体基因Cytb的序列,评估热处理对掺假样品检测限的影响。普通PCR定性结果显示,除炸制（1%）外,其他试验组的最低检测限均为0.1%,在加工方式中,炸制具有最高的A260nm /A280nm值。然而,由紫外吸光度确定的这个结果可能由于增色效应而被高估。因此,与其他模板相比,炸制样品中提取的DNA产生的条带较弱,经验证,温度最高的炸制处理降低了由于DNA降解引起的敏感性,导致其扩增困难。除炸制外,其他几种热处理对普通PCR结果无明显影响,方法可以应用于肉制品的定性检测。与普通PCR相比,定量PCR方法的主要优点是可以进行数据定量。为了开发一种较优的定量方法,物种特异性和内源性对照引物应联合使用。内源性对照的使用对于定量目的至关重要,特别是当考虑具有复杂组成的加工产品时。在本研究中,采用SYBR Green I染料的定量PCR方法,针对猪线粒体Cytb基因的内源片段（149 bp）与基于18S rRNA内参基因（140 bp）的内源对照组合扩增,有近似相同的效率。以ΔCt值为纵坐标,以猪肉百分比的对数为横坐标建立校准曲线,8条校准曲线均具有良好的线性关系,可以检测和定量分析0.1%—10%线性动态范围内的猪肉掺假,冯震等[31]和SóNIA等[12]的最低检测限也为0.1%,与本研究结果一致。生肉与熟肉制品的标准曲线的截距之间存在约0.1—0.6个循环的差异,因此,相比于以生肉为例去鉴定种源成分,对于复杂工艺的肉制品,更建议使用热处理制成的标准曲线去定量。
4 结论
不同加工处理能够显著影响肉中DNA的含量、纯度和完整性,但不影响肉制品中DNA的检测限和灵敏度。定性PCR除炸制混合肉（为1%）外,混合生肉及其他6种混合肉制品的最低检测限均为0.1%,定量PCR的灵敏度均可达到0.1%,8种工艺的牛肉制品中均可检测到猪源性成分。本研究建立了牛肉及肉制品中猪源性成分的定性定量检测方法,两种方法都表现出高灵敏度和准确性,可应用于保障肉制品的纯正性。（责任编辑 杨鑫浩）
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DOI:10.1016/j.foodcont.2016.11.032URL [本文引用: 1]
Food frauds have become a very important issue in the field of food quality and safety. The risk of food adulteration is higher in highly processed food and mainly affects high added value foodstuff. The methods currently available to face this issue, PCR and ELISA, are very sensitive and specific, but they have some limitations. In the present work, tandem mass spectrometry is presented as an emerging approach to detect beef and pork meat in very complex and highly processed food matrices, such as Bolognese sauce, both in qualitative than in quantitative way. The detection is achieved using two different marker peptides, specific for beef and pork meat, both deriving from 伪2-collagen chain. Then, a calibration curve is set up using real sauces made by different percentages of pork and beef meat in a working range from 0 to 100%. The method here developed allows to quantify beef and pork meat in a complex product such as Bolognese sauce.
URL [本文引用: 1]
目的建立可同时检测羊肉中掺入的猪、马、牛、鸭成分中的任意2种,及牛肉中掺入的猪、马、鸭成分中任意2种的双重PCR检测体系。方法配制掺入猪、马、牛、鸭源性成分的模拟掺假羊肉样品及掺入猪、马、鸭源性成分的模拟掺假牛肉样品,每个成分的掺假比例为10%。筛选特异性强、敏感度高的猪、马、牛、鸭物种特异性基因,优化反应体系,建立了针对猪、牛、马、鸭两两配对的双重PCR检测体系。结果无论是模拟牛肉掺假样品,还是模拟羊肉掺假样品,所有掺入的低价肉品成分都被准确检出,且无非特异扩增条带。结论本研究建立的双重PCR检测体系,可以敏感、特异、准确的检出牛羊肉制品中的猪、牛、马、鸭成分。
URL [本文引用: 1]
目的建立可同时检测羊肉中掺入的猪、马、牛、鸭成分中的任意2种,及牛肉中掺入的猪、马、鸭成分中任意2种的双重PCR检测体系。方法配制掺入猪、马、牛、鸭源性成分的模拟掺假羊肉样品及掺入猪、马、鸭源性成分的模拟掺假牛肉样品,每个成分的掺假比例为10%。筛选特异性强、敏感度高的猪、马、牛、鸭物种特异性基因,优化反应体系,建立了针对猪、牛、马、鸭两两配对的双重PCR检测体系。结果无论是模拟牛肉掺假样品,还是模拟羊肉掺假样品,所有掺入的低价肉品成分都被准确检出,且无非特异扩增条带。结论本研究建立的双重PCR检测体系,可以敏感、特异、准确的检出牛羊肉制品中的猪、牛、马、鸭成分。
DOI:10.1016/j.foodcont.2016.07.029URL [本文引用: 1]
61Highly sensitive and quantitative detection of pork species.61Assays of qualitative PCR and real-time PCR with EvaGreen dye were developed.61Effect of thermal processing on method performance was assessed.61Normalised quantification of pork meat adulteration in the range of 0.01–10% (w/w).61Method validation and application to processed Halal meat products.
[D].
[本文引用: 1]
[D].
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DOI:10.3969/j.issn.2095-3887.2014.z1.014URL [本文引用: 1]
如今"食品安全"已成为人们最关注的问题之一,不法商贩为牟取暴利,利用化学物品和低廉材料对市场上的高价值产品进行伪造和掺假,不仅使群众损失财产,更严重威胁着人们的健康。由于制假产品在外观、气味等宏观方面不易辨别,为此,执法机关在打击制假犯罪的时候,需要一种科学准确的方法对市面上的样品进行鉴定,为打假掺杂提供确凿的证据。因此,对未知的动物组织进行物种鉴定,一直是研究人员们致力解决的问题。
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DOI:10.3969/j.issn.2095-3887.2014.z1.014URL [本文引用: 1]
如今"食品安全"已成为人们最关注的问题之一,不法商贩为牟取暴利,利用化学物品和低廉材料对市场上的高价值产品进行伪造和掺假,不仅使群众损失财产,更严重威胁着人们的健康。由于制假产品在外观、气味等宏观方面不易辨别,为此,执法机关在打击制假犯罪的时候,需要一种科学准确的方法对市面上的样品进行鉴定,为打假掺杂提供确凿的证据。因此,对未知的动物组织进行物种鉴定,一直是研究人员们致力解决的问题。
DOI:10.1016/j.meatsci.2010.03.001URLPMID:20416827 [本文引用: 1]
A species-specific duplex polymerase chain reaction (PCR) assay was developed for the simultaneous detection of pork and poultry meat species using the mitochondrial cyt and 12S rRNA as target genes for pork and poultry, respectively. By the amplification of binary reference meat mixtures, a linear normalised calibration curve was obtained using the fluorescence intensities of PCR products for pork (14902bp) and poultry (18302bp) species. The proposed method allowed the quantification of pork meat addition to poultry meat in the range of 1–75%, with a sensitivity of 0.1%. The in-house validation using samples with known amounts of pork meat (1.0%, 2.5%, 7.5%, 20.0% and 40%) evidenced a high reproducibility of the methodology (coefficient of variation from 4.1% to 7.6%). The successful application of the duplex PCR was also demonstrated by the high correlation (02=020.99) obtained from regression analysis between the predicted and the actual values of pork meat addition in blind meat mixtures. The suggested methodology presents a low cost, fast, easy and reliable alternative to estimate the level of poultry meat adulteration by the addition of pork meat.
DOI:10.1016/j.foodchem.2017.05.038URLPMID:28551263 [本文引用: 1]
react-text: 473 This study described a novel multiplex qualitative detection method using pyrosequencing. Based on the principle of the universal primer-multiplex-PCR, only one sequencing primer was employed to realize the detection of the multiple targets. Samples containing three genetically modified (GM) crops in different proportions were used to validate the method. The dNTP dispensing order was designed... /react-text react-text: 474 /react-text [Show full abstract]
DOI:10.1016/j.foodchem.2014.07.139URLPMID:25236231 [本文引用: 1]
One popular staple food in many lands is minced meat, traditionally prepared from beef and/or pork fractions. While beef is the more expensive of the two meat fractions, the possibility exists for manufacturers to fraudulently declare higher proportions of it. Additionally, the need exists to protect consumers who, out of medical or ethical reasons, reject specific meat fractions. In this work, we report on a quantitative triplex real-time PCR approach for the quantification of meat in minced meat products. With the method, beef and pork fractions are quantified employing primer and probe sequences that specifically recognise cow and pig components, against the backdrop of myostatin, a universal sequence commonly found in mammals and poultry species. The limit of detection of the qPCR method was 20 genome equivalents, while the measurement of uncertainty was determined at 1.83%. The method was validated on several commercially available minced meat products and performed well in terms of handling, reproducibility and robustness.
DOI:10.1016/j.foodchem.2015.06.094URLPMID:26304356 [本文引用: 2]
Total RNA samples were used to establish qualitative and quantitative PCR-based methods for assessing meat adulteration. The primers were designed based on the mRNA sequences of troponin I (TnI), mitochondrial ribosomal protein (MRP) and tropomodulin genes to distinguish chicken, pork, goat, beef and ostrich. There was no cross reaction between the primers, and the detection limit of the cDNA template was 0.01 and 2002ng in simplex PCR and multiplex PCR, respectively. In the low temperature storage test, the detection limits of cDNA template with 10 and 102ng were determined at 402°C and 618002°C. In quantitative assay, the precision of real-time PCR analysis expressed as a coefficient of variation (CV) ranged from 0.25% to 5.24% and the trueness, expressed as an error, ranged from 0.28% to 6.98% for adulteration. Thus, herein, we provided alternative tools for the assessment of meat adulteration using mRNA-based PCR methods.
DOI:10.1016/j.foodchem.2016.04.084URLPMID:27211626 [本文引用: 1]
The TaqMan庐 real-time PCR assay using the mitochondrial D-loop region was developed for the quantitative detection of pork in processed meat products. The newly designed primers and probe specifically amplified pork without any cross-reactivity with non-target animal species. The limit of detection of the real-time PCR assay was 0.1pg of heat-treated pork meat and 0.1% (w/w) pork meat in beef and chicken meat mixtures. The quantitative real-time PCR assay was applied to analyze the pork meat content in 22 commercial processed meat products including jerkies, press hams, sausages, hamburger patties and steaks, grilled short rib patties, and nuggets. The developed real-time PCR method was able to detect pork meat in various types of processed meat products that declared the use of pork meat on their label. All processed meat products that declared no use of pork meat showed a negative result in the assay. The method developed in this study showed sensitivity and specificity in the quantification of pork meat in commercial processed meat products.
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建立了一种鉴定牛羊肉中掺杂猪肉的PCR检测方法。确定了一对可在牛羊肉中特异并灵敏地检测出所掺杂猪肉成分的引物对,以猪细胞色素b基因组为模板,特异性扩增出130bp的目的片段,而无其他扩增片段影响。在牛羊肉中分别掺杂2%、4%、6%的猪肉,均可灵敏地检测出猪肉成分,无显著性差异;分别经120℃、10min,120℃、30min,115℃、30min,70℃、16h处理猪肉,也可灵敏地扩增出特定目的条带,无显著性差异。
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建立了一种鉴定牛羊肉中掺杂猪肉的PCR检测方法。确定了一对可在牛羊肉中特异并灵敏地检测出所掺杂猪肉成分的引物对,以猪细胞色素b基因组为模板,特异性扩增出130bp的目的片段,而无其他扩增片段影响。在牛羊肉中分别掺杂2%、4%、6%的猪肉,均可灵敏地检测出猪肉成分,无显著性差异;分别经120℃、10min,120℃、30min,115℃、30min,70℃、16h处理猪肉,也可灵敏地扩增出特定目的条带,无显著性差异。
DOI:10.1016/j.meatsci.2012.12.012URLPMID:23403303 [本文引用: 4]
Species identification in meat products has grown in interest in recent years since these foodstuffs are susceptible targets for fraudulent labelling. In this work, a real-time PCR approach based on SYBR Green dye was proposed for the quantitative detection of pork meat in processed meat products. For the development of the method, binary meat mixtures containing known amounts of pork meat in poultry meat were used to obtain a normalised calibration model from 0.1 to 25% with high linear correlation and PCR efficiency. The method revealed high specificity by melting curve analysis, being successfully validated through its application to blind meat mixtures, which confirmed its adequacy for pork meat determination. The fully applicability of the method was further demonstrated in commercial meat products, allowing verification of labelling compliance and identification of meat species in processed foods. (c) 2013 Elsevier Ltd. All rights reserved.
DOI:10.1016/j.meatsci.2014.11.007URLPMID:25462385 [本文引用: 1]
61Multiplex PCR was developed for simultaneously detecting chicken, duck and goose tissues from beef, pork, mutton or quail.61The method has good specificity and sensitivity.61The method was successfully used for the detection of 24 commercial raw or processed meat products.
DOI:10.1016/j.foodchem.2014.07.139URLPMID:25236231 [本文引用: 1]
One popular staple food in many lands is minced meat, traditionally prepared from beef and/or pork fractions. While beef is the more expensive of the two meat fractions, the possibility exists for manufacturers to fraudulently declare higher proportions of it. Additionally, the need exists to protect consumers who, out of medical or ethical reasons, reject specific meat fractions. In this work, we report on a quantitative triplex real-time PCR approach for the quantification of meat in minced meat products. With the method, beef and pork fractions are quantified employing primer and probe sequences that specifically recognise cow and pig components, against the backdrop of myostatin, a universal sequence commonly found in mammals and poultry species. The limit of detection of the qPCR method was 20 genome equivalents, while the measurement of uncertainty was determined at 1.83%. The method was validated on several commercially available minced meat products and performed well in terms of handling, reproducibility and robustness.
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根据鸭mtDNA COX基因上的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR用于检测畜禽肉制品中的鸭源性成分。结果表明,建立的方法特异性强,与鹅、鸡、羊、牛等15种动物DNA无非特异性扩增;灵敏度高,可检测1.0pg/μL鸭源DNA的存在;重复性好,同DNA浓度所测得Ct值的变异系数均小于3%;应用该法对模拟混合样品进行检测,结果与预期相符,且常见肉类DNA的存在并不影响该法对鸭源性成分检测的灵敏度。说明本试验建立的鸭源性成分实时荧光定量PCR法特异、敏感、稳定,可快速准确检测畜禽肉制品中含有的鸭源性成分。
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根据鸭mtDNA COX基因上的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR用于检测畜禽肉制品中的鸭源性成分。结果表明,建立的方法特异性强,与鹅、鸡、羊、牛等15种动物DNA无非特异性扩增;灵敏度高,可检测1.0pg/μL鸭源DNA的存在;重复性好,同DNA浓度所测得Ct值的变异系数均小于3%;应用该法对模拟混合样品进行检测,结果与预期相符,且常见肉类DNA的存在并不影响该法对鸭源性成分检测的灵敏度。说明本试验建立的鸭源性成分实时荧光定量PCR法特异、敏感、稳定,可快速准确检测畜禽肉制品中含有的鸭源性成分。
DOI:10.3969/j.issn.1008-5467.2015.01.016URL [本文引用: 1]
目的:建立基于实时荧光PCR技术的鸭源性成分的快速检测方法。方法:以鸭线粒体DNA序列为目的基因,设计并筛选了鸭源性特异性引物及探针,进行荧光定量PCR扩增,建立鸭源性成分检测方法。通过特异性、灵敏性、及盲样检测试验,对该体系进行验证。结果:该方法能够快速有效的检测鸭源性成分,具有较强的特异性及灵敏性,灵敏度约为0.01%(质量分数);通过市售盲样肉制品的检测,表明该体系可用于定性检测加工肉制品中的鸭源性成分。结论:该方法特异性强,灵敏度高,可用于对肉制品中鸭源性成分的掺假鉴别。
DOI:10.3969/j.issn.1008-5467.2015.01.016URL [本文引用: 1]
目的:建立基于实时荧光PCR技术的鸭源性成分的快速检测方法。方法:以鸭线粒体DNA序列为目的基因,设计并筛选了鸭源性特异性引物及探针,进行荧光定量PCR扩增,建立鸭源性成分检测方法。通过特异性、灵敏性、及盲样检测试验,对该体系进行验证。结果:该方法能够快速有效的检测鸭源性成分,具有较强的特异性及灵敏性,灵敏度约为0.01%(质量分数);通过市售盲样肉制品的检测,表明该体系可用于定性检测加工肉制品中的鸭源性成分。结论:该方法特异性强,灵敏度高,可用于对肉制品中鸭源性成分的掺假鉴别。
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DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.06.013URL [本文引用: 1]
[目的]从蒸、煮、炖、烤、炸、煎、干制及腌制八种传统中式烹饪工艺中筛选获得有害物质较少的牛肉处理工艺,为消费者选择有害物质含量较低的烹饪工艺提供理论参考.[方法]通过调控烤、炸、煎3种高温处理的温度和时间,对比分析多环芳烃(PAHs)、反式油酸(C18:1trans-9)及亚硝酸盐3类有害物质的组分及含量,选出较优的烤、炸、煎烹饪条件;在此基础上,综合分析烤、炸、煎与蒸、煮、炖、干制及腌制8种烹饪工艺对牛肉中有害物质的影响,进而选择较优的中式烹饪工艺.试验分别采用高效液相色谱外标法、气相色谱-质谱外标法及分光光度法测定牛肉中PAHs、C18:1trans-9及亚硝酸盐的含量.[结果]对照组中共检测出芘、苯并[a]蒽、苣和苯并[k]荧蒽4种,烤制以160-180℃处理为较优,有5种PAHs且含量低,炸制以3-4 min处理含量较低,煎制以2-3 min处理含量较低;8种中式烹饪中,炸、煎的肉样中PAHs种类最多,炸、腌制的肉样中苯并[a]蒽含量较高,蒸制及煎制的肉样中苣含量较高,烤,炸,煎的肉样中苯并[b]荧蒽含量较高,炸、煎的肉样中苯并[k]荧葸、苯并[a]芘和二苯并[a,h]蒽含量较高.烤制温度对C18:1 trans-9含量影响不显著(P＞0.05),炸制3 min和煎制2min的肉样中C18:1 trans-9含量均最低(P＜0.05);8种中式烹饪中,炸、煎的肉样中C18:1trans-9含量较高(P＜ 0.05).烤制1 60℃和180℃的肉样中亚硝酸盐含量均较低,炸制3 min和煎制2 min的亚硝酸盐含量最低(P＜0.05);8种烹饪工艺中,炸、煎及腌制的肉样中亚硝酸盐含量较高(P＜0.05).[结论]对烤、炸、煎3种高温处理,肉样在160℃下烤制40 min,在226-228℃下炸制3 min、煎制2 min时3类有害物质含量较低;综合分析8种工艺,蒸制、煮制、炖制及干制的肉样中3类有害物质种类较少且含量较低.
DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2017.06.013URL [本文引用: 1]
[目的]从蒸、煮、炖、烤、炸、煎、干制及腌制八种传统中式烹饪工艺中筛选获得有害物质较少的牛肉处理工艺,为消费者选择有害物质含量较低的烹饪工艺提供理论参考.[方法]通过调控烤、炸、煎3种高温处理的温度和时间,对比分析多环芳烃(PAHs)、反式油酸(C18:1trans-9)及亚硝酸盐3类有害物质的组分及含量,选出较优的烤、炸、煎烹饪条件;在此基础上,综合分析烤、炸、煎与蒸、煮、炖、干制及腌制8种烹饪工艺对牛肉中有害物质的影响,进而选择较优的中式烹饪工艺.试验分别采用高效液相色谱外标法、气相色谱-质谱外标法及分光光度法测定牛肉中PAHs、C18:1trans-9及亚硝酸盐的含量.[结果]对照组中共检测出芘、苯并[a]蒽、苣和苯并[k]荧蒽4种,烤制以160-180℃处理为较优,有5种PAHs且含量低,炸制以3-4 min处理含量较低,煎制以2-3 min处理含量较低;8种中式烹饪中,炸、煎的肉样中PAHs种类最多,炸、腌制的肉样中苯并[a]蒽含量较高,蒸制及煎制的肉样中苣含量较高,烤,炸,煎的肉样中苯并[b]荧蒽含量较高,炸、煎的肉样中苯并[k]荧葸、苯并[a]芘和二苯并[a,h]蒽含量较高.烤制温度对C18:1 trans-9含量影响不显著(P＞0.05),炸制3 min和煎制2min的肉样中C18:1 trans-9含量均最低(P＜0.05);8种中式烹饪中,炸、煎的肉样中C18:1trans-9含量较高(P＜ 0.05).烤制1 60℃和180℃的肉样中亚硝酸盐含量均较低,炸制3 min和煎制2 min的亚硝酸盐含量最低(P＜0.05);8种烹饪工艺中,炸、煎及腌制的肉样中亚硝酸盐含量较高(P＜0.05).[结论]对烤、炸、煎3种高温处理,肉样在160℃下烤制40 min,在226-228℃下炸制3 min、煎制2 min时3类有害物质含量较低;综合分析8种工艺,蒸制、煮制、炖制及干制的肉样中3类有害物质种类较少且含量较低.
DOI:10.1016/j.meatsci.2004.04.010URLPMID:22062411 [本文引用: 1]
Species-specific real-time PCR (TaqMan) assays were developed for detection of beef, pork, lamb, chicken and turkey. Assays were developed around small (amplicons () gene. Speciation was achieved using species-specific primers. For detection purposes, two TaqMan probes were developed; the first was specific to the mammalian species (beef, lamb and pork), the second to the poultry species (chicken and turkey). Normal end-point TaqMan PCR conditions were applied; however, PCR was limited to 30 cycles. Applying the assays to DNA extracts from raw meat admixtures, it was possible to detect each species when spiked in any other species at a 0.5% level. The absolute level of detection, for each species, was not determined; however, experimentally determined limits for beef, lamb and turkey were below 0.1%.
[本文引用: 1]
DOI:10.1373/clinchem.2008.112797URLPMID:19246619 [本文引用: 1]
BACKGROUND: Currently, a lack of consensus exists on how best to perform and interpret quantitative real-time PCR (qPCR) experiments. The problem is exacerbated by a lack of sufficient experimental detail in many publications, which impedes a reader's ability to evaluate critically the quality of the results presented or to repeat the experiments. CONTENT: The Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments (MIQE) guidelines target the reliability of results to help ensure the integrity of the scientific literature, promote consistency between laboratories, and increase experimental transparency. MIQE is a set of guidelines that describe the minimum information necessary for evaluating qPCR experiments. Included is a checklist to accompany the initial submission of a manuscript to the publisher. By providing all relevant experimental conditions and assay characteristics, reviewers can assess the validity of the protocols used. Full disclosure of all reagents, sequences, and analysis methods is necessary to enable other investigators to reproduce results. MIQE details should be published either in abbreviated form or as an online supplement. SUMMARY: Following these guidelines will encourage better experimental practice, allowing more reliable and unequivocal interpretation of qPCR results.
DOI:10.3969/j.issn.1001-4829.2010.05.082URL [本文引用: 1]
本文以抗除草剂(EPSPS)转基因大豆GTS-40-3-2为材料,在Lectin基因的扩增体系中设置了不同浓度的十二烷基硫代硫酸钠(SDS)和酚,探讨了SDS和酚这两种蛋白质变性剂在转基因成分检测中的抑制作用。结果表明,在反应体系中SDS的浓度大于或等于4.8×10-4g/mL时,能完全抑制PCR反应;酚的体积比大于或等于8.0×10-3时,体系中的DNA聚合酶全部变性,PCR反应彻底被抑制。
DOI:10.3969/j.issn.1001-4829.2010.05.082URL [本文引用: 1]
本文以抗除草剂(EPSPS)转基因大豆GTS-40-3-2为材料,在Lectin基因的扩增体系中设置了不同浓度的十二烷基硫代硫酸钠(SDS)和酚,探讨了SDS和酚这两种蛋白质变性剂在转基因成分检测中的抑制作用。结果表明,在反应体系中SDS的浓度大于或等于4.8×10-4g/mL时,能完全抑制PCR反应;酚的体积比大于或等于8.0×10-3时,体系中的DNA聚合酶全部变性,PCR反应彻底被抑制。
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DOI:10.1002/jsfa.6441URLPMID:24122804 [本文引用: 1]
BACKGROUNDThe responses of foods to microwave exposure are usually evaluated only in terms of physicochemical properties, thus undervaluing the importance of DNA in an authentication process by methods based on polymerase chain reaction (PCR). In this study, the time effect of microwave heating on some meat physicochemical properties and DNA quality has been investigated.RESULTSCooking loss, instrumental colour, pH and other physicochemical parameters varied significantly during microwave cooking, reaching the lowest/highest values after 2.5 in of cooking. The exposure of meat to microwaves was found to affect characteristically the quality of extracted DNA (i.e. yield, purity and degradation). PCR products of both mitochondrial and nuclear regions were successfully observed in all samples. However, the band for large fragments became progressively fainter as treatment time increased.CONCLUSIONSMicrowave heating caused physicochemical changes in bovine supraspinatus muscle and influenced characteristically the yield and integrity of the extracted DNA, indicating that an accurate DNA quantification and a rational choice of the genes (i.e. mtDNA versus nDNA, fragment size, etc.) to be amplified are fundamental in an authentication process by PCR-based methods. 2013 Society of Chemical Industry
DOI:10.1007/s00449-011-0554-7URL [本文引用: 2]
The extraction of high quality DNA from processed meat can often represent the crucial step in an authentication process by PCR-based methods. In this study, the effect of three different domestic cooking methods (roasting, boiling, and microwave) on DNA isolated from two beef muscles has been investigated. The quality of extracted DNA was evaluated by amplifying target sequences from mitochondrial and nuclear genes, as well as by monitoring the yield, purity, and degradation of the extracted DNA. Large PCR fragments (length >900 bp) were successfully amplified from both genes in all samples. The cooking methods caused significant differences in terms of quality and quantity of DNA recovered from meat.
DOI:10.1080/10942912.2012.654569URL [本文引用: 1]
In this study, a rapid and highly specific TaqMan-based duplex real-time polymerase chain reaction method, based on the simultaneous amplification of fragments of the mitochondrial ND2 and ND5 genes, was developed and optimized for the identification and quantification of pork and donkey meats in raw and cooked binary donkey/beef and pork/beef mixtures. Accumulation of polymerase chain reaction products was monitored by measuring the fluorescent signals from FAM and HEX labeled probes specific for pork and donkey, respectively. As a consequence, target meat species could be detected at a level of 0.001% in raw and oven-cooked meat mixtures, and at a level of 0.01% in autoclaved meat mixtures. The result in this study indicated that the TaqMan-based duplex polymerase chain reaction assay could be successfully used in the identification and quantification of donkey and pork in adulteration studies with a high degree of specificity and sensitivity.
DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2011.11.021URLMagsci [本文引用: 1]
<P><FONT face=Verdana>【目的】建立基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列，在高度保守区域设计一对引物。以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因，将其连接到PMD19-T载体，转化至大肠杆菌DH5α中，经PCR和酶切鉴定并测序验证后得到阳性重组质粒rPvpA90。以rPvpA90为模板建立SYBR Green I荧光定量的标准曲线和溶点曲线，并进行特异性，灵敏性，重复性及临床样本检测试验，评价该方法的可行性。【结果】所建立的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶点曲线特异,相关系数为0.990。最低检测限为72拷贝/20 μL ,其敏感性比常规PCR至少高100倍；无论是对不同病原DNA单模板还是几种病原DNA混合模板进行扩增，该方法都呈现很好的特异性；重复性试验中，批内和批间变异系数均小于2%，表明该方法重现性好；临床样本的检测结果表明所建立的荧光定量PCR检测方法的检测率明显高于常规PCR方法。【结论】本研究初步建立了基于种特异性基因pvpA的鸡毒支原体荧光定量PCR方法，为养禽场诊断和监测鸡毒支原体病原提供一种新的特异、灵敏的方法。</FONT></P>
DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2011.11.021URLMagsci [本文引用: 1]
<P><FONT face=Verdana>【目的】建立基于鸡毒支原体种特异性粘附蛋白编码基因pvpA的实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank公布的不同国家和地区鸡毒支原体pvpA基因序列，在高度保守区域设计一对引物。以临床分离鸡毒支原体RC1为模板扩增pvpA基因，将其连接到PMD19-T载体，转化至大肠杆菌DH5α中，经PCR和酶切鉴定并测序验证后得到阳性重组质粒rPvpA90。以rPvpA90为模板建立SYBR Green I荧光定量的标准曲线和溶点曲线，并进行特异性，灵敏性，重复性及临床样本检测试验，评价该方法的可行性。【结果】所建立的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶点曲线特异,相关系数为0.990。最低检测限为72拷贝/20 μL ,其敏感性比常规PCR至少高100倍；无论是对不同病原DNA单模板还是几种病原DNA混合模板进行扩增，该方法都呈现很好的特异性；重复性试验中，批内和批间变异系数均小于2%，表明该方法重现性好；临床样本的检测结果表明所建立的荧光定量PCR检测方法的检测率明显高于常规PCR方法。【结论】本研究初步建立了基于种特异性基因pvpA的鸡毒支原体荧光定量PCR方法，为养禽场诊断和监测鸡毒支原体病原提供一种新的特异、灵敏的方法。</FONT></P>
DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.01.06URL [本文引用: 1]
【目的】纹枯病是小麦生产上重要的土传病害之一，早期准确定量检测病原是病害预测预报及实现有效防控的基础。传统组织分离鉴定方法费时、程序复杂，而且无法做到准确定量。为实现小麦纹枯病早期快速准确定量检测，研究旨在建立小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis）的 SYBR Green I 实时荧光定量 PCR（real-time PCR）检测方法。【方法】根据小麦纹枯病菌的β-tubilin 序列，设计1对特异性引物，建立并优化 SYBR Green I real-time PCR 反应体系，利用小麦纹枯病菌、立枯丝核菌（R. solani）、双核丝核菌 AG-A 和 AG-F 菌株、小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis var. tritici）、小麦根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）、小麦茎基腐病菌假禾谷镰孢（Fusarium pseudograminearum）和禾谷镰孢（F. graminearum）等8种小麦根部或土壤病原物的菌丝 DNA 进行普通 PCR 和 real-time PCR 特异性检测，并对灵敏度、可重复性进行评价。利用该体系分别检测接种后5、10、60 d 不同接种浓度的盆栽小麦病株。【结果】研究设计的引物特异性强，普通 PCR 检测结果仅小麦纹枯病菌 DNA 有扩增条带。Real-time 检测结果表明该对引物对小麦纹枯病菌只有唯一的产物吸收峰，对其余供试菌株均未检测到荧光信号。普通 PCR 检测的灵敏度为6.5×10^3 copies/μL, real-time PCR 的灵敏度可达到6.5×10^2 copies/μL。以携带目的基因片段的重组质粒为标准品，构建的 real-time PCR 标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系，熔解曲线的吸收峰单一，相关系数为0.997，扩增效率为0.91。对人工接种的盆栽小麦病株进行 real-time PCR 检测，结果表明与病情指数和接种量分别呈显著正相关。【结论】研究建立的基于 real-time PCR 技术的小麦纹枯病菌快速检测方法速度快、灵敏度高、特异性强、重复性好。可以用于小麦纹枯病菌检测17
DOI:10.3864/j.issn.0578-1752.2015.01.06URL [本文引用: 1]
【目的】纹枯病是小麦生产上重要的土传病害之一，早期准确定量检测病原是病害预测预报及实现有效防控的基础。传统组织分离鉴定方法费时、程序复杂，而且无法做到准确定量。为实现小麦纹枯病早期快速准确定量检测，研究旨在建立小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis）的 SYBR Green I 实时荧光定量 PCR（real-time PCR）检测方法。【方法】根据小麦纹枯病菌的β-tubilin 序列，设计1对特异性引物，建立并优化 SYBR Green I real-time PCR 反应体系，利用小麦纹枯病菌、立枯丝核菌（R. solani）、双核丝核菌 AG-A 和 AG-F 菌株、小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis var. tritici）、小麦根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）、小麦茎基腐病菌假禾谷镰孢（Fusarium pseudograminearum）和禾谷镰孢（F. graminearum）等8种小麦根部或土壤病原物的菌丝 DNA 进行普通 PCR 和 real-time PCR 特异性检测，并对灵敏度、可重复性进行评价。利用该体系分别检测接种后5、10、60 d 不同接种浓度的盆栽小麦病株。【结果】研究设计的引物特异性强，普通 PCR 检测结果仅小麦纹枯病菌 DNA 有扩增条带。Real-time 检测结果表明该对引物对小麦纹枯病菌只有唯一的产物吸收峰，对其余供试菌株均未检测到荧光信号。普通 PCR 检测的灵敏度为6.5×10^3 copies/μL, real-time PCR 的灵敏度可达到6.5×10^2 copies/μL。以携带目的基因片段的重组质粒为标准品，构建的 real-time PCR 标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系，熔解曲线的吸收峰单一，相关系数为0.997，扩增效率为0.91。对人工接种的盆栽小麦病株进行 real-time PCR 检测，结果表明与病情指数和接种量分别呈显著正相关。【结论】研究建立的基于 real-time PCR 技术的小麦纹枯病菌快速检测方法速度快、灵敏度高、特异性强、重复性好。可以用于小麦纹枯病菌检测17
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目的建立生鲜肉中牛源性和羊源性成分荧光PCR定量检测方法。方法以线粒体细胞色素b(Cytb)基因核苷酸序列为检测靶点,设计并优化引物,建立基于SYBR染料的荧光PCR定量检测方法,并对该方法进行特异性和灵敏度验证。结果在退火温度60℃的条件下,荧光PCR检测体系中各条引物特异性良好,目标成分检测信号Ct值均小于20,非特异性检测信号Ct值均大于35,该方法在模板浓度为0.016~10 ng/μL时线性关系良好;以Ct30作为阳性或阴性结果的判定限,目标源性成分荧光PCR定量检测的灵敏度可达1%。结论本方法可为生鲜肉制品种源鉴定和掺假检测提供理论依据。
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目的建立生鲜肉中牛源性和羊源性成分荧光PCR定量检测方法。方法以线粒体细胞色素b(Cytb)基因核苷酸序列为检测靶点,设计并优化引物,建立基于SYBR染料的荧光PCR定量检测方法,并对该方法进行特异性和灵敏度验证。结果在退火温度60℃的条件下,荧光PCR检测体系中各条引物特异性良好,目标成分检测信号Ct值均小于20,非特异性检测信号Ct值均大于35,该方法在模板浓度为0.016~10 ng/μL时线性关系良好;以Ct30作为阳性或阴性结果的判定限,目标源性成分荧光PCR定量检测的灵敏度可达1%。结论本方法可为生鲜肉制品种源鉴定和掺假检测提供理论依据。
