通过病毒感染的检查，可以明确临床标本中是否存在某些特定的病毒，可为临床诊断提供有力的证据，又可指导临床制定正确的治疗方案。同时，病毒感染的检查结果提供了相应疾病的发病状态信息，能够帮助流行病学制定有效的预防措施。病毒感染的实验室检查包括病毒分离与鉴定、病毒核酸与抗原的直接检出以及特异性抗体的检测。临床医师根据流行病学资料、疾病的症状与体征综合判断可能为何种病毒感染，留取适宜的标本送检。

一、标本的采集与送检

1．标本采集时间 在发病初期（急性期）采集标本，较易检出病毒，随着标本采集日期的推后，病毒分离的阳性率随之降低。例如麻疹病毒分离标本必须在出疹前三天或出疹后五天内采集；而脊髓灰质炎病毒分离标本尽量在发病后14天内采集。

2．标本类型 最好在感染部位采取，如呼吸道感染采取鼻咽洗漱液、咽拭子、鼻拭子等；肠道感染采集粪便标本；脑内感染采取脑脊液；皮肤感染采取病灶组织，如疱疹液体；有病毒血症时采取血液；对某些病毒尿液标本的分离率也比较高。

3．标本运输 病毒是细胞内寄生物，脱离活体后在室温下很易丧失感染能力。标本采集后，应放入装有冰块的冷藏包内尽快运送到实验室，标本在处理、接种前切忌反复冻融，病变组织则应保存于50%的甘油缓冲盐水中。

4．标本的处理与储存 采集标本时要注意无菌操作，应尽量避免外界污染。收到标本后，应尽快处理并保存标本，处理前，含有有包膜的病毒的临床标本中可加入高浓度的青霉素、链霉素、万古霉素等；对无包膜的病毒的临床标本，可在标本内加入一定量的氯仿。标本中加入抗生素或氯仿的目的是杀灭标本中可能存在的细菌、支原体、真菌等病原体。处理后的标本要加入一定量的标本保存液（例如，含2%胎牛血清的MEM、DMEM、PBS等），尽量及时接种，如不能当时接种，标本应保存与-70℃低温冰柜或液氮中。

检测特异性抗体需要采取急性期与恢复期双份血清，第一份尽可能在发病后立即采取，第二份在发病后1个月时采集。血清标本应在-20℃保存，试验前血清标本以56℃30分钟处理去除非特异性物质及补体。无菌性脑炎患者也可取脑脊液检测特异性lgM。

二、病毒分离

是目前最常用的分离病毒的方法。在初步了解欲分离的检测病毒后，将选择适当的原代培养细胞或传代细胞系等作病毒分离培养。接种标本后，细胞可出现病变或也可并不出现病变而需用血细胞吸附等方法检测是否有病毒增殖，并进一步还需用特殊的抗体鉴定病毒的种类，例如用特异荧光抗体染色或抗体中和试验等。当无病毒增殖时，可能标本中病毒含量较低，未被检出，则需要盲目传代3次后方可明确标本中是否存在病毒。这一分离与鉴定病毒的全过程有时可长达2～3个月，而且仅在有设备、实验条件及合格工作人员的实验室方可进行。虽然这种方法所需时间长、步骤多，但在确定病原上是“黄金标准”，即其准确性高而无误。如欲提高病毒感染细胞培养的敏感性，可将病毒接种于内有盖玻片的细胞培养瓶，经低温离心后，以增加病毒与细胞接触的几率。再将盖玻片进行培养，并用单克隆抗体染色，藉以通过检测病毒的早期抗原进行诊断。

1．细胞培养类型  按细胞的来源、染色体特征及传代次数又可分为原代细胞、二倍体细胞与传代细胞系等3种基本类型。

（1） 原代细胞培养(primary cell culture)：用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1～2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞。常用的有人胚肾、猴肾、鸡胚等原代细胞。原代细胞对病毒的敏感性高。原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊髓灰质炎疫苗。因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。

（2）二倍体细胞培养(diploid cell cultune)：原代细胞只能传2～3代细胞就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。二倍体细胞生长迅速，并可传50代保持二倍体特征，通常是胚胎组织的成纤维细胞（如WI-38细胞系）。二倍体细胞一经建立，应尽早将细胞悬浮于10%二甲基亚砜中，大量分装安瓿贮存于液氮（-196℃）内，作为“种子”，供以后传代用。目前多用二倍体细胞系制备病毒疫苗，也用于病毒的实验室诊断工作。

（3）传代细胞培养 (continous cell culture) ：由癌细胞或二倍体细胞突变而来，染色体数为非整倍体，细胞生长迅速，可无限传代，在液氮中能长期保存。常用的传代细胞有HeLa（宫颈癌）细胞、KB（口腔癌）细胞、HEp-2（喉癌）细胞、Vero（非洲绿猴肾）细胞等。由于传代细胞系能有规律地持续传代，容易保存（-70℃～-196℃）且对某些病毒易感，因此，在诊断、科研等非疫苗生产的项目中常被采用。目前广泛用于病毒的实验室诊断工作，根据病毒对细胞的亲嗜性，选择敏感的细胞系使用传代细胞系 

（4）淋巴细胞培养（lymphocyte culture）：正常成熟的淋巴细胞不经特殊处理不能在体外传代培养。然而EBV感染的B淋巴细胞却能在体外持续传代，这是病毒转化细胞的例证，也是分离出EBV的标志。T淋巴细胞在加入T细胞生长因子（IL-2）后可在体外培养，为研究人类逆转录病毒（HIV、HTLV）提供了条件，HIV在T淋巴细胞培养物中增殖形成多核巨细胞。

2．细胞培养中病毒的鉴定。

（1）病毒在细胞内增殖的指征：

1）细胞致病作用(cytopathogenic effect, CPE)：病毒在细胞内增殖引起细胞退形性变，表现为细胞皱缩、变圆、出现空泡、死亡和脱落。某些病毒产生特征性CPE，普通光学倒置显微镜下可观察上述细胞病变（图25-2），结合临床表现可作出预测性诊断。

A                              B

C                              D

图24-1 病毒致细胞病变效应（CPE）

A. 正常单层细胞（FRhK-4 cell）   B. SARS病毒感染的单层细胞

C. 麻疹病毒感染Vero-SLAM所致的融合病变 D. 呼吸道合胞病毒在细胞内产生的包涵

2）红细胞吸附现象（hemadsorption phenomenon）：流感病毒和某些副粘病毒感染细胞后24～48小时，在细胞膜上出现病毒的血凝素，能吸附豚鼠、鸡等动物及人的红细胞，发生红细胞吸附现象。若加入相应的抗血清，可中和病毒血凝素、抑制红细胞吸附现象的发生，称为红细胞吸附抑制试验。这一现象不仅可作为这类病毒增殖的指征，还可作为初步鉴定。

3）干扰现象 (interference phenomenon)：一种病毒感染细胞后可以干扰另一种病毒在该细胞中的增殖，这种现象叫干扰现象。前者为不产生CPE的病毒（如风疹病毒）但能干扰以后进入的病毒（如ECHO病毒）增殖，使后者进入宿主细胞不再生产CPE。

（2）病毒感染性的定量测定：

1）空斑形成单位 (plaque-forming unit, PFU)：测定这是一种测定病毒感染性比较准确的方法。将适当浓度的病毒悬液接种到生长单层细胞的玻璃平皿或扁瓶中，当病毒吸附于细胞上后，再在其上复盖一层溶化的半固体营养琼脂层，待凝固后，孵育培养。当病毒在细胞内复制增殖后，每一个感染性病毒颗粒在单层细胞中产生一个局限性的感染细胞病灶，病灶逐渐扩大，若用中性红等活性染料着色，在红色的的背景中显出没有着色的“空斑”，清楚可见。由于每个空斑由单个病毒颗粒复制形成，所以病毒悬液的滴度可以用每毫升空斑形成单位（PFU）来表示。

2）50%致死量（LD50）或50%组织细胞感染量（TCID50）的测定：本法可估计所含病毒的感染量。方法是测定病毒感染鸡胚、易感动物或组织培养后，引起50%发生死亡或病变的最小病毒量，即将病毒悬液作10倍连续稀释，接种于上述鸡胚、易感动物或组织培养中，经一定时间后，观察细胞或鸡胚病变，如绒毛尿囊膜上产生痘斑或尿囊液有血凝特性，或易感动物发病而死亡等，经统计学方法计算出50%感染量或50%组织细胞感染量，可获得比较准确的病毒感染性滴度。

3）病毒形态与结构的观察：病毒悬液经高度浓缩和纯化后，借助磷钨酸负染及电子显微镜可直接观察到病毒颗粒，根据大小、形态可初步判断病毒属哪一科。

（3）病毒的病原学鉴定：病毒在细胞中生长、使细胞出现病变后还可用免疫荧光等方法直接检测病毒抗原、分子生物学技术分析病毒核酸组成、序列同源性比较等加以鉴定（见病毒的核酸检测）。

是最原始的病毒分离方法，目前已很少应用。常用小鼠、大鼠、豚鼠、家兔和猴等动物，接种途径根据各病毒对组织的亲嗜性而定，有鼻内、皮内、脑内、腹腔及静脉等。例如嗜神经病毒（脑炎病毒）接种鼠脑内；柯萨奇病毒可接种于乳鼠腹腔内。接种后逐日观察实验动物发病情况，如有死亡，则取病变组织剪碎，研磨均匀，制成悬液，继续传代，并作鉴定。但要注意有些动物对人类病毒不敏感，或感染后症状不明显。此外，也应防止将动物体内的潜在病毒当作真正的病原体。

鸡胚是正在发育中的机体，有些人及动物病毒能在鸡胚中增殖，因此鸡胚培养是分离某些病毒的一种有效方法。如有病毒增殖，则鸡胚发生异常变化或羊水、尿囊液出现红细胞凝集现象。按病毒种类不同，可使用不同胚龄的鸡胚，接种于不同部位(见图24-2)。常用的接种部位有：绒毛尿囊膜：用于培养天花病毒、痘苗病毒及HSV等；尿囊腔：用于流感病毒及腮腺炎病毒的培养；羊膜腔：用于流感病毒的初次分离培养；卵黄囊：用于某些嗜神经病毒的培养。需要注意的是很多病毒在鸡胚中不生长。

图24-2 鸡胚接种示意图

三、 病毒抗原的直接检出

除对细胞培养中病毒可进行鉴定外，对一些血清型别不多或在常规细胞培养系统中还不能成功培养的病毒，应用免疫荧光或酶联免疫吸附实验直接检测病毒抗原是快速而简单的方法。

根据抗原抗体特异性结合的反应特点，将荧光色素与待检病毒的特异性抗体以化学的方法结合起来。而后将荧光标记了的抗体在特定的条件下浸染标本，使抗体与标本中的抗原（病毒）发生结合反应，细胞内的病毒或抗原可被荧光素标记的特异性抗体着色，在荧光显微镜下可见斑点状黄绿色荧光，根据所用抗体的特异性判断为何种病毒感染。免疫荧光（IF）法用于鉴定病毒具有快速、特异的优点。此方法主要包括直接免疫荧光法、间接免疫荧光法以及在间接法的基础上发展而成的补体结合法。

使用病毒特异性抗体检测标本中的病毒抗原。ELISA法用于鉴定病毒具有简便、快速、特异的优点。

四、 病毒抗体的直接检出

应用病毒特异性抗原检测病毒感染患者血清中的抗体也是诊断病毒感染的重要手段，可有IgG和IgM两种。IgM抗体出现于病毒感染早期，可用于快速诊断病毒感染。IgG抗体出现较迟，在血清中存在的时间也较长，因此IgG类抗体用于临床诊断必须具有早期和恢复期双份血清，或有随访的血清，两次标本中抗体的效价需有4倍或以上的升高才有诊断价值。ELISA或免疫印迹法可检测血清中针对某种病毒抗原亚单位的抗体，例如，该法已用于HIV患者抗体的确认实验。其他常用的方法还包括：

    是病毒在活体内或细胞培养中被特异性中和抗体作用而失去感染性的一种试验，可用来检查患者血清中抗体的消长情况，也可用来鉴定未知病毒或研究病毒的抗原结构。中和抗体特异性高，维持时间长，因此流行病学检查常用此法。

常用病毒内部可溶性抗原检测血清中IgM类抗体，因同种异型间常有交叉反应发生，故本试验特异性较中和试验低。但因体内补体结合抗体产生早、消失快，常用于病毒早期感染的诊断。

许多病毒能凝集鸡、豚鼠、人等的红细胞，称血凝现象。这种现象能被相应的抗血凝素抗体所抑制， 称血凝抑制。检测血凝抑制抗体的试验为血凝抑制试验。本试验简便、快速，且特异性高，常用于流感病毒及乙型脑炎病毒等有血凝素病毒感染的诊断及流行病学调查，也可用于鉴定病毒的型及亚型。

五、检测病毒核酸

由于大多数病毒的基因均已克隆并已知道其核苷酸序列，因此可以利用病毒的基因作为探针(probes)进行杂交以检测标本中有无相应的病毒核酸，或针对病毒的序列设计相应的引物，作多聚酶链反应（Polymerase Chain Reaction Assays, PCR）。近年随着技术的进步，已研制出多种高通量的检测病毒核酸的技术。

核酸杂交是病毒诊断领域中发展较快的一项新技术，主要分为Southern杂交和Northern杂交两大类。其基本原理是双链DNA（或RNA）在加热或碱处理下，变性解开成单链，然后用一条已知的特异性的核苷酸序列的单链DNA，以同位素或非放射性核素标记后制成探针去与固态支持物上的变性单链DNA进行杂交，再用放射自显影技术或用生物素-亲和素系统进行检查，以确定待测核酸中有无与探针DNA同源的DNA存在。由于病毒基因很多已成功地被克隆及进行了核苷酸序列测定，因此可以利用特定的病毒基因作为探针，用核酸杂交的方法检测标本中有无相应的病毒核酸。核酸杂交技术方法包括有斑点核酸杂交、细胞内原位杂交、DNA印迹杂交和RNA印迹杂交等。

(二)PCR技术

近年来发展了一系列以PCR为基础的体外核酸扩增技术，用于检测不易感或不能培养的病毒。PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，主要由高温变性(denaturation)、低温退火(annealling)和适温延伸(extension)三个步骤反复的热循环构成。即在高温(93～95℃)下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温(37～60℃)情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度下(72℃)，以引物3´端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5´～3´方向延伸，合成DNA新链。这样，每一双链DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区段拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2ⁿ的指数迅速扩大。经过25至30个循环后，将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染色，在紫外灯照射下（254nm）可见到DNA的特异扩增区带。此方法特异性强、敏感性高、简便快速，已成功用于HCV、HIV、CMV、HPV等多种病毒性感染的临床检测中。由于PCR方法十分敏感，可检出fg水平的病毒核酸，故操作时应注意PCR产物的气溶胶污染以防出现假阳性。此外，病毒核酸检测阳性并不等于标本中存在有感染性的活病毒。

随着PCR技术的广泛应用，派生出了一系列的新技术和方法，根据不同的检测目的可以选用相适应的技术方法。如利用实时定量PCR法(real time quantitatice PCR)检测病毒载量(viral load)；利用原位(in situ)PCR法定位检测细胞或组织中的病毒感染；利用巢式(nested)PCR可以提高PCR的第三性和特性等等。其中，荧光实时定量PCR技术发展迅速，TaqMan水解探针法、杂交探针法和分子信标法等技术被应用于荧光实时定量PCR检测，并得到了广泛的临床应用。此种技术除了能准确定量病人体液中病毒载量外，还可用于检测病毒的耐药突变，因此主要被用于临床疗效的考核和病毒耐药的监测。

(三)高通量的病毒核酸检测技术

近年随着对突发传染病病原体的快速鉴定的需求，国内外已研制出基于不同技术原理的高通量病毒核酸检测技术，如DNA芯片技术,以便快速准确地筛查出导致传染病爆发流行的病原体。DNA芯片技术随着人类基因组计划应运而生，其原理是将已知的成千上万特异的基因探针，高密度有序排布于小块硅片等载体上，产生二维DNA探针阵列(microarray)，然后与标记的待测样品进行杂交。芯片上的信号通过共聚焦显微镜(confocal microscope)或者激光扫描仪(laser scanner)进行扫描检测，由计算机记录杂交结果，然后对杂交位点及其信号强弱进行分析，并与探针阵列的位点进行比较，就可以得到待测样品的遗传信息，从而判断标本中的特异性病原体的存在。目前基因芯片主要有两种，一种是DNA合成芯片，在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸；另一种是DNA微集芯片，将克隆基因或PCR扩增的基因片段有序地显微打印到芯片上。DNA芯片技术的优点是一次性可以完成大量样品DNA序列的检测和分析，最新研发的高密度病原体基因芯片能检测1700多种人类病毒。DNA芯片技术解决了传统核酸杂交技术的许多不足，在病毒诊断和流行病学调查方面有着广阔的应用前景。

六、病毒感染的快速诊断

对病毒性感染作出明确诊断在指导临床用药、选用治疗手段和判断疾病的预后方面十分重要，对预防和控制某些传染病（如流行性感冒、病毒性脑炎）的流行也有一定意义。病毒分离和血清学试验方法往往需要长时间才能得出结果，而病毒性感染的快速诊断则弥补了上述缺点，更具实用价值。除用光学显微镜和电镜观察包涵体及病毒颗粒，用免疫学方法检测病毒抗原、抗体外，随着分子生物学技术的发展，目前病毒核酸的检测也已得到广泛应用。

(一)形态学检查法

1．光学显微镜检查法(Optical microscopy)  光学显微镜是病毒诊断的辅助方法之一，借助染色技术可以直接观察病毒产生的核内或胞浆内包涵体和病毒感染细胞的具体形态。某些受病毒感染的细胞内，可形成与正常细胞结构和着色不同的斑块，称为包涵体。应用光学显微镜检查包涵体，根据不同病毒包涵体的形态、染色、存在部位的差异，可辅助诊断某些病毒性疾病。例如从病犬大脑海马会发现胞浆中嗜酸性包涵体（内基小体），即可确诊为狂犬病；在麻疹病毒感染细胞的核内及胞浆内可找到一个或多个鲜红色的圆形、椭圆形或不规则形态的包涵体，被称为麻疹病毒包涵体。

2．电镜(electron microscopy, EM)和免疫电镜检查  电子显微镜技术可直接观察病毒的大小、形态、结构以及病毒在细胞内增殖的动态过程。制作电镜标本的方法主要有超薄切片（厚度为100nm左右），磷钨酸负染法等。超薄切片法也称正染法，将细胞固定、脱水、包埋、切片、染色，然后观察病毒颗粒，可显示病毒形态及形态发生过程。负染色法敏感性低，通过浓集病毒的办法使样品含有高浓度病毒颗粒（10⁶～10⁷/ml），经磷钨酸负染后直接用于电镜检查，可显示病毒的结构。这种方法可有助于诊断难以在细胞培养中增殖的病毒，例如从病人粪便标本中观察是否有轮状病毒的感染。

3．免疫电镜技术(immune electron microscopy, IEM) 是将抗原抗体反应的特异性与电子显微镜的高分辨力相结合，在亚细胞和超微结构水平上对抗原物质进行定位分析的一种高度精确、灵敏的方法。特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、胶体金等标记后，使之与抗原结合，在电镜下观察到标记物所在位置，即为抗原抗体反应的部位。在难以分辨病毒颗粒与其外周伴随的结构的情况下，若将病毒样品制成悬液，加入特异性抗体，可使样品中的病毒颗粒凝集成团，再用电镜观察可提高病毒的检出率。利用这种方法从痘病毒、疱疹病毒感染的疱疹液中，以及疑为轮状病毒感染的粪便或HBV感染者血清中均可快速检出典型的病毒颗粒，能帮助早期诊断。

（二） 免疫学检查法

1．检查病毒抗原:病毒抗原的检测是诊断病毒感染的依据之一，在不必分离培养病毒的情况下，直接用特异性标记抗体检查标本中是否有相应病毒抗原存在。由于其基本原理是抗原抗体反应，因此要求标本中有一定量的病毒抗原存在。常用的方法有免疫荧光法，酶联免疫吸附法（ELISA）或乳胶凝集法等。这些方法相对于病毒分离培养方法和形态学检测方法，具有快速、敏感、准确、操作简便等优点，因此十分适宜在临床病毒检测中应用。

2．检查病毒特异性IgM:病人体液中病毒抗体的检测也是快速诊断病毒感染的常用方法之一。检测抗体用的病毒抗原可以是基因工程表达的重组抗原，也可以是根据编码基因片段推导的合成肽作为抗原。目前该方法已用于风疹病毒、乙型脑炎病毒、流行性出血热病毒、甲型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等感染的早期诊断。

3．多种病毒抗原抗体检测方法:在新发突发传染病原体的诊断中需要快速的病原体筛查技术以便尽快地确认爆发流行的为何种病毒，传统的抗原抗体检测方法仅能在一次实验中检测一种病原体，不能在短时间内筛查到致病原，因此研制出的高通量的病毒抗原抗体检测技术，可以在一次实验中完成十几甚至几十个病毒的检测。例如蛋白液相芯片技术，把针对不同病毒的抗原或抗体以共价方式结合到特定颜色的微球上，一种颜色对应一种病毒。应用时，先把几十种不同颜色的微球混合，再加入病人体液标本中（被测物为血清中病毒抗原或抗体）孵育，并加上荧光标记，然后微球成单列通过激光扫描，数据经电脑处理后可以直接用来判断结果。此种方法已经初步应用于呼吸道病毒的高通量筛查中，实践证明其检测敏感度和检测速度均优于ELISA方法。

 （三）病毒核酸检测技术

鉴于多聚酶链反应（PCR）具有快速敏感的优点，已在快速诊断病毒感染中发挥了重要作用，如近年对禽和人流感病毒感染的检测等。但它们也存在不少缺点，由于敏感性较高，操作不当易造成污染；病毒核酸阳性不等于标本中存在有感染性的活病毒。此外对未知病毒及可能出现的新病毒则不能采用这些方法。对于未知病毒及可能出现的新病毒，近年采用代表性差异分析、基于保守序列的多聚酶链反应、cDNA文库的筛选等方法已发现多个新病毒，如HCV，HGV，新型汉坦病毒等。

利用上述已有的传统病毒分离培养、形态学检查、免疫学和分子生物学等方法快速诊断或排除病毒感染外，也可成功地鉴定出未知新病毒，SARS冠状病毒(coronavirus)的发现就是一个典型的例子。研究人员把SARS病人的咽拭子标本与Vero 6细胞共孵育，通过病毒培养可在光镜下观察到明显的细胞病变效应，进一步电镜观察发现增殖的病毒具有冠状病毒的外部形态结构特征，同时免疫组化和免疫荧光检测发现这种病毒与冠状病毒组I的抗血清有交叉反应，提示这种病毒与冠状病毒有亲缘关系，可能为冠状病毒家族成员之一。继续利用冠状病毒保守序列引物扩增病毒基因片段，得到一长约405bp的PCR产物，测序后确认为是一种不同于已知冠状病毒的冠状病毒家族新成员，被命名为SARS冠状病毒。

免疫预防(immune prevention)，是通过人工接种生物制剂的方法从而达到预防疾病、控制和消灭人类传染病的目的。“人工免疫”，即免疫预防所采取的方法统称。二十世纪人类通过实施全面进行人工免疫，使得许多传染性疾病得到很好的控制，乃至消灭。用牛痘苗预防天花是免疫预防成功的最早实例，1979年10月26日，世界卫生组织宣布世界上已经完全消灭了天花。与之相对，人类用于控制病毒感染的治疗药物还十分有限，其效果远不如抗生素等对细菌感染的疗效，因此对病毒感染的免疫预防显得尤为重要。

一、人工主动免疫

应用抗原性物质的人工免疫称为人工主动免疫。预防病毒感染的人工主动免疫生物制品主要有以下几类。

(一)减毒活疫苗(live attenuated vaccines) 

减毒活疫苗是通过选用毒力下降的病毒突变株作疫苗株。由于疫苗为活病毒株，该种病毒具有病毒的性质，可以在原位繁殖。所以减毒活疫苗的优点是可以自然感染方式接种；疫苗株可在体内增殖，通过类似自然感染的方式，从体液免疫和细胞免疫两个层面刺激机体产生所获得的免疫力；能保持长时间的免疫力；接种量与接种次数均较灭活疫苗少。但减毒活疫苗保存与运输均应冷藏，室温下易灭活；减毒活疫苗存在遗传危险性，在人群中有毒力回复突变的可能。因而对有免疫缺陷，尤其是细胞免疫功能低下者或使用免疫抑制剂患者应选用灭活疫苗或提纯的蛋白疫苗。常用的减毒活疫苗有Sabin脊髓灰质炎疫苗、风疹疫苗、麻疹疫苗、水痘疫苗、腮腺炎疫苗、乙型脑炎疫苗、甲型肝炎疫苗等。

(二)灭活疫苗(inactivated vaccines)

灭活疫苗是通过理化方法将有毒力的病毒灭活后制成的疫苗。由于病毒株经过灭活过程，该种疫苗失去感染性但仍保持原病毒的抗原性。因此灭活疫苗的优点是稳定，使用安全，但需要注射较大剂量才能诱发出有效的免疫力，且不能诱导产生粘膜免疫和细胞免疫。在免疫过程常需多次疫苗注射，一定时间内还需加强注射。因此灭活疫苗的使用不如活疫苗经济方便，且免疫力维持时间也较活疫苗短。常用的灭活疫苗有Salk脊髓灰质炎疫苗、狂犬病疫苗、流行性乙型脑炎疫苗和流感疫苗等。

(三)基因工程疫苗(recombinant protein vaccines) 

基因工程疫苗是通过应用重组DNA技术，运用载体将编码病毒特异性保护抗原的基因片段插入酵母或大肠埃希菌的基因组中，从而表达病毒的特异性抗原。通过注射纯化后的病毒抗原，从而引发机体的免疫反应。由于基因工程疫苗表达的是病毒蛋白，根据其结构可以分为亚单位疫苗和多肽疫苗。由于只使用病毒的亚单位或肽段作为疫苗，所以可以避免活病毒感染，在生产疫苗的过程中也不需要活病毒的复制。但是由于酵母及大肠埃希菌的蛋白修饰有异于人类，导致其免疫原性较差。常见的乙肝疫苗即是通过在酵母中真核表达HBsAg所获得。

此外通过基因工程技术，传统疫苗生产开发的技术得到提高。如传统的疫苗减毒过程常常需要通过长期传代筛选获得减毒株，因此开发新疫苗的时间长成本大。通过反向基因技术，可以对病毒毒力基因直接修改，再运用基因重组技术获得重组减毒株。该方法已运用于如流感病毒在内的一些呼吸道病毒的疫苗开发之中。

(四)核酸疫苗 (nucleic acid vaccine)

核酸疫苗是通过在真核细胞中表达的载体（如质粒DNA）编码病原体有效免疫原基因重组而成。广义的核酸疫苗还包括模拟病毒表位的合成肽疫苗、抗独特型疫苗、表达多种病毒表位的联合多价疫苗等。核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗两类，因实验技术问题研究最多的是DNA疫苗。 核酸疫苗接种后，会在所进入细胞内表达重组DNA疫苗核酸所编码的病毒的抗原蛋白，从而刺激机体产生体液免疫和细胞免疫。基因疫苗具有一些明显的优点：基因疫苗具有共同的理化特性，因此可以将含有不同抗原基因的质粒混合进行联合免疫；质粒载体没有免疫原性，因此可以反复使用；基因疫苗在接种后，所编码的蛋白抗原在宿主细胞内表达，加工处理及抗原提呈过程与病原体的自然感染相似，因而可以诱导产生细胞和体液免疫；因外源基因在体内存在较长时间，不断表达外源蛋白，持续给免疫系统以刺激，因此能够使机体产生较强和较持久的免疫应答。但核酸疫苗在小动物中与大动物中诱生免疫应答效果不完全一致。此外若用于人体，注射的核酸量极大，且存在潜在安全问题，如不应引起自身免疫应答，不发应生病毒核酸基因整合等。核酸疫苗现在还处于研究阶段，有些病毒的核酸疫苗，在人体已作为预防性疫苗进行了临床研究；在动物模型中已证实核酸疫苗具有一定的治疗效果。现在投入临床实验的核酸疫苗主要集中在传统疫苗手段无法获得有效疫苗的病毒，如HIV、HCV等。

二、人工被动免疫

人工被动免疫(artificial passive immunization)是指注射含有抗病毒中和抗体的免疫血清、丙种球蛋白和IL-2，以及与细胞免疫有关的转移因子、干扰素等，使机体立即获得特异性免疫力。由于这些免疫物质不是机体自己产生的，而是被动得到的，故称为“被动免疫”。人工被动免疫的生物制剂注入机体后可立即生效，可用于某些急性传染病的应急性预防和治疗，但因这些免疫物质不是病人自己产生，故免疫力维持时间短，约3周左右。如果宿主已受到感染，采用人工主动免疫便为时过晚，此时应该进行人工被动免疫。

(一) 普通免疫球蛋白("Normal" immune globulin)

普通免疫球蛋白主要是来源于健康人静脉血来源和胎盘血的免疫球蛋白的复合物。由于含有健康人群在生长发育过程中曾有过许多隐性感染，故血清具有相应的多样抗体，因而有增强机体抵抗力以预防感染的作用。其血清（或胎盘）中可含有多种病原体的抗体。因为该类制剂不是针对某一特定病原体的特异抗体，所以它们的免疫效果不如专门的特异免疫球蛋白抗体制品也不能预防一些特殊的疾病感染如HIV、SARS等。丙种球蛋白主要用于免疫缺陷病以及传染性肝炎、麻疹、水痘、腮腺炎、带状疱疹等病毒感染。   

(二)抗病毒血清

抗病毒血清是直接将微生物接种实验动物，当动物获得免疫力后，把含有抗体的血清精制后制成的产品。由于抗病毒血清来自于异种动物，可能会引起强烈的全身生理反应如Ⅰ型超敏反应。在乙型肝炎病毒感染中，高效价的含抗乙肝病毒的人特异性免疫球蛋白（HBIg）具有被动保护作用，在预防乙型肝炎的母婴传播中可与疫苗联合使用，有显著效果。常用的抗病毒血清有抗狂犬病的血清和抗乙型脑炎的血清等。   

(三)免疫调节剂

免疫调节剂主要指一大类能够增强、促进和调节免疫功能的生物制品。免疫调节剂对于免疫功能健全的生物体作用并不大，但是对于艾滋病患者和某些处于免疫功能较弱的个体却有较好的治疗效果。不过此类制剂本身具有生理活性，应用时常伴有相对应的头痛发热等不良反应，其反应程度也因人而异。常用的免疫调节剂包括转移因子、白细胞介素、胸腺素、干扰素等(详见抗病毒治疗二 )。

虽然人类通过使用疫苗有效的控制了包括天花、乙型肝炎在内的多种病毒的蔓延，但是诸如丙型肝炎、西尼罗河病毒等尚无有效的疫苗预防，所以仍需要抗病毒药物来抗击病毒的复制。常见抗病毒治疗分为抑制病毒和提高机体免疫两个方面，既一方面选用抑制病毒复制的化学药物或制剂，另一方面提高机体的免疫应答，促进自身消灭病毒感染的细胞效能。

虽然人类在抗生素的研发方面卓有成效，但在抗病毒治疗的研究是一个新的研究领域，迄今理想的抗病毒药物并不多。抗病毒药物研发较抗菌药物的研发主要有如下难点：一是多数病毒如麻疹等都为急性转归，发现疾病是已经被机体清除无需使用药物；二是由于病毒的生命周期依赖与宿主的生理功能，所以干扰病毒复制增殖的化合物常常对机体也有副作用；三是病毒较细菌有更为专一种属特异性，如乙型肝炎、麻疹病毒等都没有理想的动物模型。以上种种限制从而影响了抗病毒药物的研发工作的开展。

一、化学治疗(chemotherapy)

病毒的复制循环是由病毒的粘附侵入及脱衣壳、病毒mRNA合成翻译及修饰、病毒基因组的复制以及病毒的包装释放等步骤。从理论上抑制病毒复制的药物可以针对上述提到的每一个步骤，所以抑制病毒复制的目的化学治疗可以以此分类。

(一)抑制病毒穿入、脱壳及病毒释放

病毒的吸附和包装释放是病毒感染的最初和最终环节，抑制这些环节能阻止病毒在体内的进一步传播。早在20世纪60年代，就发现金刚烷胺能在体内外对甲型流感病毒具有抑制作用。其机制主要是影响病毒的吸附，并影响其与宿主细胞膜的融合及脱衣壳。在临床应用中，数据提示其能对流感起到一定的预防作用。但是由于金刚烷胺副作用较大，未被临床广泛采用。近年来对病毒（尤其是HIV）的新药研发也有不少的药物针对这个步骤。 最近报道有针对起吸附作用的包膜蛋白gp120中结合CD4的保守序列，设计的抑制两者结合的小分子药物能达到阻止病毒感染的作用。在预防禽流感中应用的达菲也是针对流感病毒神经氨酸酶设计的，该药可以有效地抑制神经氨酸酶介导的细胞间扩散。达菲作为预防使用，可达到90%以上的效果。

(二)抑制病毒核酸复制及mRNA合成

1．核苷类类似物(nucleoside Analogs)  核苷类类似物是临床应用最广泛的抗病毒药物之一。该类药物是针对病毒的聚合酶所设计特异性药物干扰病毒的核酸的合成，从而影响病毒的基因组复制。因核苷类类似物是以前药形式存在，所以其发挥作用时需要被磷酸化。各核苷酸类似物因其针对聚合酶的特异性的毒性差别较大，如无环鸟苷几乎没有毒性，而叠氮胸苷毒性非常高。此外，核苷类化合物血浆半衰期很短，只有1～4个小时。

目前常用的有：①阿昔洛韦（无环鸟苷，acyclovir, ACV），因其能选择性地作用于疱疹病毒而较少产生副作用，对抗疱疹病毒有着强大的效用。其作用机制是无环鸟苷作为前药，该药物需要通过三磷酸激酶转化，成为具有抗病毒活性的三磷酸无环鸟苷。在非感染的细胞中会在将无环鸟苷转化为一磷酸无环鸟苷，ACV只能在感染细胞中发挥作用，所以阿昔洛韦治疗更具有特异性。经测定，无环鸟苷抑制单纯疱疹病毒Ⅰ型的复制与抑制宿主细胞生长的浓度相差约3000倍，不仅提高了疗效还降低了副作用。除局部使用外，也可用于注射，因此可减少疱疹病毒脑炎的死亡率并延长病人生命。②叠氮脱氧胸苷（azidothymidine, AZT），最早用于抗肿瘤的治疗，在1987年被批准第一个用于HIV治疗的药物。AZT对病毒逆转录酶的抑制比对细胞DNA聚合酶的抑制强100倍，故HIV感染者使用后，能有效降低艾滋病的发病与病死率。但在治疗6个月后，已发现有耐药毒株的出现。此外该药会导致细胞间三磷酸胸腺嘧啶的耗竭，故而选择性较ACV低，存在严重的副作用；③拉米呋定（lamivudine, 双脱氧硫代胞嘧啶核苷，简称3TC） 该药早期主要用于艾滋病的治疗，而近年来在临床应用于乙型肝炎的治疗。临床发现该药可迅速抑制慢性乙型肝炎患者体内HBV 的复制，使血清HBV DNA 转阴，促进HBeAg 血清转换，血清丙氨酸氨基转移酶（alanine amino-transferase, ALT）正常。但是该药物停止使用后会存在病毒载量的反弹。长期使用药物，会发现病毒耐药株的存在导致治疗失败。④病毒唑（3-氮唑核苷，ribavarin），也是需在细胞酶作用下磷酸化的药物。可使细胞和病毒复制所必须的鸟嘌呤核苷减少，故可抑制多种RNA和DNA病毒复制。主要用于RNA病毒感染的治疗，如呼吸道合胞病毒感染引起的毛细支气管炎，流行性出血热等。但因其对细胞核酸也有抑制作用，故副作用较多。⑤疱疹净（5-碘2-脱氧尿嘧啶核苷，idoxuridine, IDU），常用于眼疱疹病毒感染的治疗；⑥阿糖腺苷（adenine arabinaside, Ara-a），可用于治疗疱疹性角膜炎及疱疹病毒脑炎。

2．非核苷类似物  是一类非竞争性抑制剂，较之核苷类似物其特征是不需要经过磷酸化，针对逆转录病毒的逆转录过程。以HIV为例，其机制是通过与HIV-1的逆转录酶的活性中心或附近部位结合，从而抑制逆转录酶的活性。该类药物能够高度专一地抑制HIV-1的逆转录酶，对HIV-2及其他逆转录病毒的逆转录酶抑制作用很低或无作用。非核苷类似物与核苷类似物联用对HIV-1复制的抑制有协同作用。这类药物主要有nevirapine（奈韦拉平）delaviradine（德拉韦拉定）及pyridone（吡啶酮）等。

(三)抑制病毒蛋白的修饰

许多病毒需要通过其自身编码的特异性蛋白酶将翻译后生成的多聚蛋白质切割成具有功能活性的肽段。如HIV的pol基因编码的蛋白酶在产生成熟颗粒的过程所必需的，它通过自身切割从Gag-Pol前体多聚蛋白上脱离，在剩余部分分割成不同肽段，形成独立的六个蛋白（MA、CA、p2、NC、p1和p6）和三个酶（蛋白酶、逆转录酶和整合酶）。因此，有一类药物针对蛋白酶的空间结构，从原子水平研究其构象设计并研制出病毒蛋白酶所对应的特异性抑制剂, 称为病毒蛋白酶抑制物(protease Inhibitors)。应用该类抑制剂可以使病毒前体多聚蛋白不被酶解，使得感染细胞只能产生非感染性病毒颗粒，从而阻止病毒在细胞间传播。现已在HIV中设计出针对蛋白酶活性位点的抑制剂，并应用于临床，可以有效降低病毒载量，增加CD4⁺细胞计数，主要用于HIV晚期感染者。单药疗效不佳，常与核苷类药物联用。华裔美国科学家用核苷类和（或）非核苷类逆转录酶抑制剂加蛋白酶抑制剂组合成二联或三联疗法治疗HIV感染，被称为“鸡尾酒”治疗方案，可较长期抑制病毒复制，推迟HIV病情发展，延长病人寿命。其商品名称分别为saquinavir（萨喹那韦）、indinavir（英迪那韦）、及ritonavir（瑞托那韦）等。

二、免疫治疗

病毒的化学治疗并不直接引起病毒性疾病的痊愈以及病毒的清除。无论何种化学药物都只能抑制病毒，并不能彻底清除病毒，而是依靠机体免疫在化学药物治疗抑制病毒复制后将残余的病毒清除。由此可见，病毒性疾病的免疫治疗同样也是抗病毒治疗的重要手段。目前免疫疗法可分为非特异免疫治疗性及特异性免疫治疗，后者又可分为被动特异性免疫治疗及主动特异性免疫治疗两种。非特异性免疫治疗主要通过增强机体的非特异性细胞和体液免疫，可包括采用胸腺素（thymosin）、IL-12、IL-2、猪苓多糖、聚肌胞、levamisole及自身LAK细胞回输疗法等。被动特异性免疫治疗，主要包括免疫核糖核酸（iRNA）、病原特异性转移因子和特异性T细胞疗法等。主动特异性免疫治疗主要指将病原的抗原成分或相应结构（疫苗）接种机体，以激发、增强和调控机体抗病原的特异性免疫应答，达到治疗的目的。因其接种对象为已发生持续感染的患者，可发挥治疗作用，故称为治疗性疫苗，通过单独或抗病毒药物联合使用，有可能最终达到清除机体内病原微生物感染的目的。以下分别介绍免疫调节或治疗剂、免疫细胞的修饰与回输、免疫基因治疗三种类型。

(一)免疫调节或治疗剂

包括细胞因子、Toll样受体配体、抗体、抗原肽以及其它免疫治疗剂等，其中使用最广的是细胞因子疗法。用于抗病毒的细胞因子主要IFN、TNF、IL-2、IL-8、IL-10、IL-12等。各类细胞因子可以单独使用也可以联合使用。由于细胞因子自身具有生理活性，也会产生相对应的副作用，其程度因个体差异而不同。IFN为连接先天免疫与获得性免疫的重要细胞因子，主要有I型（IFNa/β）及II型（IFNg）干扰素。IFN的抗病毒机制主要是通过激活JAK-STAT信号通路，促使抗病毒基因的转录及信号通路的活化。a干扰素作为广谱抗病毒药已广泛用于HCV及HBV的治疗。对HCV的治疗显示IFN的疗效与病毒的基因型有很大的关系：对基因1型HCV的疗效达42%～46%，对基因2型及3型的应答率达76%～80%。宿主的因素在IFN的疗效中同样非常重要，对同时接受治疗的应答和无应答病人的肝穿刺标本研究显示宿主的某些基因的基础表达水平与IFN疗效高度相关。为了延长IFN的半衰期，新一代的临床使用的IFN进行了聚乙二醇修饰，修饰后的IFN可以延长其作用时间，同时可以提高肝内的局部药物浓度，提高IFN的治疗效果。临床上有研究者联合使用I型和II型干扰素治疗HCV无应答的病人取得了良好的效果。

Toll样受体是机体识别外源或异己的模式识别受体，通过识别微生物的某些组分如核酸、脂类的特异模式（如LPS, CpG）而启动信号转导，诱导IFN及NF-κB的激活，进一步启动获得性免疫，为宿主抵御病原微生物的第一道防线。利用TLR的配体在体内激活TLR信号通路，可能通过调节机体免疫状态，达到清除病毒的目的。已有报道在HCV持续感染的病人中利用TLR7的配体达到抑制病毒的效果，体内TLR7的激活可能通过诱生I型IFN，促炎因子及共刺激分子的上调，增强获得性免疫，产生增强的抗病毒免疫状态从而达到抑制病毒的效果。

抗病毒血清和丙种球蛋白是传统的免疫调节治疗方法，但是其来源有限效能不高。近年来，利用细胞融合技术、基因工程技术等生产的单克隆抗体为免疫调节治疗提供新的思路。常见的抗体设计思路包括构建双特异性抗体、嵌合抗体、抗独特型抗体和双功能抗体。不同类型构建人工单克隆抗体，或是封闭病毒感染所需的受体，或是激活特异型的细胞，从而发挥其调节免疫杀伤病毒的作用。例如最近发现CD8⁺ T细胞表面的PD-1分子的表达水平决定CD8⁺ T细胞的活性。CD8⁺ T细胞在病毒清除中发挥着决定性的作用，病毒持续性感染如HCV，HIV往往伴随着CD8⁺ T细胞的耗竭。而PD-1的高表达导致病毒的持续感染。在小鼠模型中用PD-1的抗体封闭PD-1能恢复CD8⁺ T细胞的功能，设计针对PD-1的特异型抗体将为持续性病毒感染的治疗提供了新的方向。

（二）治疗性疫苗(therapeutic vaccine)

       治疗性疫苗是指在已感染病原生物或患某些疾病的机体中，通过给机体接种疫苗成分诱生机体产生特异性免疫应答，以达到治疗或防止疾病恶化的一种免疫治疗制品。其历史最早可追溯到巴斯德(Pasteur)于1885年发明的狂犬病疫苗。他用狂犬疫苗接种已被狂犬咬伤但尚未发病的患者，以防止发生致死性的狂犬病。主要机理可能为通过反复多次注射狂犬疫苗而诱生的特异性机体免疫应答可有效地阻止病毒进入中枢神经系统，最终达到治疗效果。对母亲为乙型肝炎病毒携带者所娩出的婴儿注射乙肝疫苗，实际上也可作为广义的治疗性疫苗来认识。治疗性疫苗的研制与应用在病毒方面已开展了对人类免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、乙肝病毒(HBV)感染等的治疗性疫苗研制,包括DNA疫苗,病毒载体疫苗,乙肝表面抗原-抗体复合型治疗疫苗及治疗性(合成肽)等。已有的临床研究结果显示,部分治疗性疫苗具有治疗作用,如法国学者对18名艾滋病患者进行了疫苗临床试验，结果显示，在试验开始后的4个月里，所有患者体内约80%的艾滋病病毒被杀灭，免疫细胞大量增加。1年后有8名患者血液中的艾滋病病毒减少了90%以上，其中4人血液中的每毫升病毒含量不超过1 000个单位，达到了不传染的程度。 尽管如此,研究还发现研制的疫苗上存在反跳等缺点，因为1年后另外10名患者的艾滋病病毒数量又逐渐增多。对治疗性疫苗效果的确认还有待进行更大范围的人体试验，以获得更确切的数据。

(三)免疫细胞的修饰与回输

获得性免疫在机体抵抗病毒感染的过程中起到十分重要的作用。而获得性免疫是依赖于免疫细胞正常功能的发挥所实现的；另一方面过强的细胞免疫反应将损伤机体组织，机体存在负调机制控制免疫反应。参与抗病毒感染及调节的免疫细胞包括特异性杀伤性T细胞、抗原提呈细胞、调节性T细胞等等。在慢性病毒感染过程中常存在免疫细胞功能的异常，如抗原提呈细胞功能下降、调节性T细胞数目增多和功能亢进等。所以对自体免疫细胞进行体外修饰与回输是抗病毒免疫治疗的新的途径。例如调节性T细胞T_reg是一类表面标记为CD4⁺ CD25⁺的T细胞亚群。其中，诱导性T_reg如T_R1(T_H3)，可能通过封闭CD4⁺ T细胞的共刺激分子形成；自然性T_reg与T细胞一样在胸腺中发育成熟。T_reg细胞可能通过抑制CD8⁺ T细胞的活性导致病毒的持续性感染，体外CD25抗体删除T_reg细胞可以恢复CD8⁺ T细胞的活性，可能作为HBV及HCV的持续性感染治疗的一种方式。临床上使用自体淋巴细胞与IL-2共培养后进行回输，可以使HBeAg/HBV-DNA转阴率达到75％。我国学者使用HBsAg冲击树突状细胞治疗慢性HBV病人也取得了一定了疗效。

三、基因治疗

基因治疗(gene therapy)就是以各种基因转移手段将野生型或正常的基因导入人体细胞，通过基因在细胞内表达所产生的转录或翻译产物发挥其治疗作用。它从分子生物学方法入手，根据病毒基因序列和功能，寻求既能干扰病毒复制与表达、又对正常细胞代谢无影响的策略，具有选择性好、用量少、高效无毒等特点。已有的治疗策略包括：反义核酸技术（反义寡聚核苷酸、反义RNA、核酶）、RNA干扰技术、免疫基因技术、负显性抑制剂、细胞自杀基因、诱饵RNA等等。例如以双链RNA介导的靶基因mRNA的降解为主要原理的siRNA技术。siRNA在低等生物中可作为一种先天免疫的机制，在果蝇的抗病毒感染中发挥作用。利用针对病毒基因的siRNA在细胞模型中已非常有效的抑制多种病毒的复制。针对病毒不同基因型间保守序列还能克服基因型不同带来的IFN抗性之类的问题。在小鼠模型中siRNA与脂质混合后能有效的被上皮细胞摄取从而有效的阻止性途径传播的HSV-2的感染，其有效期达9天。基因治疗为有限的病毒治疗技术提供了新的手段，从而给诸如HIV在内的病毒性疾病的治疗提供了新的希望。