神经生物学实验

编 号：0023开课单位：神经生物学教研室

开课时间：第 一 学期总学时数：80（实验80）

学 分：2.5.带教教师：高殿帅 袁红花 孙 红等

【教学目的】

神经生物学实验是神经生物学的辅助课程，其目的在于通过实习操作，使学生了解神经科学研究的方法，掌握基本的实验技术。

神经系统现代研究方法大致有如下个方面，即形态学方法、电生理学方法、生物化学方法、分子生物学方法及脑成像等。本课程主要集中介绍形态学、电生理学、离体组织细胞培养等神经生物学研究的基本技术。

本课程主要面向和神经生物学关系密切的医学或理学硕士研究生开设，希望为从事神经科学研究或临床工作的同志奠定较坚实的神经科学研究实验技能的基础。

【主要内容及要求】

实验一 灌注固定

一、目的：

1．掌握大鼠脑灌注固定、取材方法；

2. 了解固定的目的；

3. 了解大鼠脑大体解剖

二、内容：

1．麻醉（anesthetized）：正常Sprague-Dawley大鼠，150-250g，雌雄不拘。戊巴比妥钠（sodium pentobarbital），40-50mg/kg，ip。

2．灌注固定（fixed）： 左心室——升主动脉插管灌注固定，灌注压力为85cm高水柱。先快速灌注0.9%NaCl 50-100ml，室温；再灌注固定液250-300ml，4℃，其中前1/3量快速灌注，后2/3量慢灌注，共在30min内灌完。

3．开颅取脑剥离颅骨、剪断脑神经、离断脑于脊髓，取出整脑。

4. 后固定（post-fixed）：取出鼠脑后，置于相同固定液24-48 hours或较长时间，4℃。

三、大鼠脑大体解剖

1．表面形态

2．深层结构

3．正中矢状切面概观

实验二 切 片

一、目的：掌握冰冻切片、贴片的技术；了解浸糖的过程和目的；熟悉常用玻璃器皿的处理和常用试剂的配置

二、内容：

1．组织块浸糖（immersed）：后固定好的组织块移入15%蔗糖0.1M PBS，4℃，过夜；再移入30%蔗糖0.1M PBS，4℃，至组织块沉底。

2．冰冻切片

3．贴片：贴片于“挂”有明胶的玻片（slides）上，充分凉干后以备染色。

三、常用溶液浓度的表示及简便配法

1．百分比浓度

2．克分子浓度(M；mol/L)

3．当量浓度(N)

实验三 神经细胞染色

掌握神经细胞染色——Nissl染色的基本方法

熟悉实验内容过程：冰冻切片→浸片→染色→分色、脱水、透明→中性树胶封片。

了解染料的类型和焦油紫染色的原理

实验四 立体定位、微量注射

掌握大鼠脑立体定位、微量注射技术

熟悉实验过程：动物麻醉→大鼠定位→液体的导入→动物存活

了解液体导入的方法和Paxinos and Watson(1986)的鼠脑图谱的使用

实验五 免疫组织化学技术——ABC方法

掌握免疫组织化学技术——ABC方法

熟悉ABC方法实验过程：冰冻切片→漂洗切片→正常羊血清封闭→入第一抗体→PBS洗切片→入生物素标志的第二抗体→PBS洗切片→加HRP→PBS洗切片→DAB显色→贴片，透明，封片，观察。

了解免疫组织化学技术或称为免疫细胞化学技术的原理和DAB/H₂O₂呈色原理。

实验六 神经细胞培养

掌握神经细胞培养的基本方法

熟悉细胞培养所需物品

熟悉玻璃器皿、胶塞以及塑料器皿的清洗

熟悉物品的消毒方法——消毒物理消毒法、化学消毒法、抗生素消毒

熟悉细胞培养常见的试剂配制——高糖DMEM，10×Hank′s液，0.25%胰蛋白酶7.4%的NaHCO₃

熟悉细胞培养的实验操作过程

了解细胞计数的方法

实验七 电生理学

掌握减压神经传入冲动放电特点及其动脉血压变动的关系

熟悉Mac-Lab数据记录处理系统的使用

熟悉减压神经的分离、股动脉和股静脉的穿刺

了解有关试剂（去甲肾上腺素、乙酰胆碱等）对减压神经放电的不同影响

【考核方式】笔试(闭卷)+实验操作

【教材与参考书】

教材：《神经生物学讲义》，自编讲义