第二节 PCR技术
二、PCR的主要用途
PCR反应理论的提出和技术上的完善对于分子生物学的发展具有不可估量的价值，它以敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等不可替代的优点，迅速成
为分子生物学研究中应用最为广泛的方法，并使得很多以往无法解决的分子生物学研究
难题得以攻克。PCR技术目前主要应用于以下三个方面：
(－）目的基因的克隆
PCR技术为重组DNA的一个重要步骤——获得目的基因提供了简便快速的方法，
具体可以用于：①利用特异性引物以CDNA或基因组DNA为模板获得已知的目的基因
片段；②利用简并引物从CDNA文库或基因组文库中获得具有一定同源性的基因片段 (二）基因的体外突变
在PCR技术建立以前，在体外对基因进行各种突变是一费时费力的工作。现在，
利用PCR技术可以随意设计引物在体外进行基因的嵌合、缺失、点突变等改造。
（三） DNA的微见分析
PCR技术高度敏感，对模板DNA的含量要求很低，是DNA微量分析的最好方法。
理论上讲，只要存在1分子的模板，就可以获得目的片段。实际工作中，一滴血液、一
根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应
用前景（见第二十二章）。PCR技术可以用于：①病原微生物的微量检测；②突变基因的
筛选；③法医学鉴定；④DNA序列分析等。
第三节核酸序列分析
DNA的碱基序列蕴藏着全部遗传信息，测定和分析DNA的碱基序列对于了解遗传
的本质即了解每个基因的编码方式无疑是十分重要的。
最初，人们用部分酶解等方法仅能测定RNA的序列， 1965年， Robert Holley花了7
年时间才完成了酵母丙氨酸一tRNA的76个核苷酸的序列测定。1975年之后，DNA序列；分析的速度很快超过了RNA和蛋白质。如今，DNA测序工作的自动化及高速度已到了
难以置信的地步，一个最小的 DNA序列自动分析仪（如PE310） 24小时内即可完成约
10 000个碱基序列的测定工作。DNA序列的分析有赖于基因工程技术的发展，在进行序
列测定前，一般需要将一段待测DNA分子克隆人质粒或噬菌体（方法见第十五章）。目
前手工测定或自动化测定所基于的技术原理一为 Allan Maxazn和 Walter Gilbert所建立的
化学裂解法，二为 Frederick Sangr建立的 M链末端合成终止法。
一、化学裂解法
化学裂解法也称为Maxam-Gilbert法，基本原理是基于某些化学试剂可以使DNA链
在1个碱基或2个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点
仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的DNA片
段，将这些片段经聚丙烯酷胺凝胶电泳分离。在分析前，用同位素标记DNA的5’末端，
经放射自显影就可以在X线胶片上读出DNA链的序列了。
二、DNA链末端合成终止法
DNA链末端合成终止法也称为 Sanger法，是目前应用的最为广泛的方法。它的基本原理是利用四种2’，3’一双脱氧核苷酸（ddNTP）代替部分脱氧核苷酸（dNTP）作为底物进
行 DNA合成反应。一旦 2’， 3’一双脱氧核苷酸参入到合成的 DNA链中，由于核糖的 3位
碳原子上不含羟基，不能与下一核苷酸反应形成磷酸二酯键，因此合成反应终止。测定
时，首先将模板分为四组，加入引物启动 DNA的合成，用”P或”S标记的 dNTP（仅标记一种即可）作为底物参入到新合成的DNA链中。反应一定时间后，每一管内加人四种
ddNTP中的一种，如果ddNTP：dNTP的比例适当，就可获得在不同部位终止反应的大小
不同的DNA链。经聚丙烯酸胺凝胶电泳分离这些片段，放射自显影就可以读出一段
DNA的序列（图23-2）。
随着DNA序列测定自动化的实现和普及，手工测定将逐步被其取代。自动化测序
的主要原理与手工测序一样，只是用四种荧光代替了同位素进行DNA的标记，因而采
用激光扫描分析可以迅速读出所测序列。
第四节人类基因组计划与后基因组研究
基因组在个体水平代表个体所有遗传性状的总和；在细胞水平，是一个细胞所有染
色体的总和；从分子角度认识，基因组代表了一个物种的所有DNA分子的总和。人类
基因组由23条染色体，约30亿对核苷酸的DNA分子构成，估计可编码的基因数目为
10万左右，另外还有许多非编码序列。如果能够分析出人类基因组的全部序列，对于认
识各种基因的功能，了解基因表达的调控方式，理解生物进化的基础，进而阐明所有生
