第二十二章基因诊断与基因治疗
随着现代分子生物学研究的不断深入，人们逐渐认识到人类的绝大多数疾病都与基
因密切相关。基因变异致病可分为两种主要类型：①内源基因的变异。由于先天遗传背
景的差异和后天内、外环境因素的影响，人类的基因结构及其表达的各个环节都可能发
生异常，从而导致疾病。内源基因的变异又可分为基因结构突变和表达异常。结构突变
包括点突变、缺失或插入突变、染色体易位。基因重排、基因扩增等。突变若发生在生
殖细胞，可能引起各种遗传性疾病；若发生在体细胞，则可导致肿瘤、心血管疾病等c
有些内源基因（如原癌基因）的表达异常则可能导致细胞增殖失衡而发生肿瘤或其他类型
紊乱。②外源基因的入侵。如各种病原体感染人体后，其特异的基因被带入人体并在体
内增殖而引起各种疾病。因而，从基因水平探测、分析病因和疾病的发病机制，并采用
针对性的手段矫正疾病紊乱状态，是近年来基础和临床医学新的研究方向。由此而发展
起来的基因诊断（gene diognosis）和基因治疗（gene therapy）已成为现代医学的重要内容。
第一节基因诊断
一、基因诊断的概念和特点
传统的诊断方法多以疾病的表型改变为依据。随着对疾病病因和发病机制研究的不
断深入，人们认识到生物个体的表型性状是特定基因型在一定条件下的体现。基因的改
变可导致各种表型的改变，从而发生疾病。近年来随着分子生物学技术的飞速发展，使
得探查基因的状况已成为可能。人们对疾病的认识也从传统的表型诊断进入到基因诊
断。所谓基因诊断就是利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结
构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。
基因诊断是以基因作为探查对象，因而具有一些其他诊断学所没有的特点：①以基
因作为检查材料和探查目标，属于“病因诊断”，针对性强。②分子杂交技术选用特定
基因序列作为探针，故具有很高的特异性。③由于分子杂交和聚合酶链反应（PCR）技术
都具有放大效应，故诊断灵敏度很高。④适用性强，诊断范围广。检测目标可为内源基
因也可为外源基因。
二、基因诊断的常用技术方法
基因诊断的基本方法主要建立在核酸分子杂交、peR和DNA序列分析技术或几种
技术联合的基础之上（详见第二十三章）。以下简要阐述几种常用的诊断技术。
(一)核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术可用以检测样本中是否存在与探针序列互补的同源核酸序列。建立在此技术基础上的常用基因诊断的方法有以下几种：
1．限制性内切酶酶谱分析法 此方法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异。当待测DNA序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异的限制性酶切片段的状态(片段的大小或多少)在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析诊断。如镰状细胞贫血是β珠蛋白基因第六个密码子发生单个碱基突变(A T)，谷氨酸被缬氨酸取代所致。由于这一突变而使该基因内部一个MstⅡ限制酶位点丢失。因此，将正常人和带有突变基因个体的基因组DNA用MstⅡ消化后，与β珠蛋白基因探针杂交，即可将正常人、突变携带者及镰状细胞贫血患者区别开来(图22-1)。
2．DNA限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析在人类基因组中，平均约200对碱基可发生一对变异(称为中性突变)，中性突变导致个体间核苷酸序列的差异，称为DNA多态性。不少DNA多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶解该DNA片段就会产生长度不同的片段，称为限制性片段长度多态性。RFLP按孟德尔方式遗传，在某一特定家族中，如果某一致病基因与特异的多态性片段紧密连锁，就可用这一多态性片段作为一种“遗传标志”，来判断家庭成员或胎儿是否为致病基因的携带者。甲型血友病、囊性纤维病变和苯丙酮尿症等均可借助这一方法得到诊断。
3．等位基因特异寡核苷酸探针(allele specific oligonucleotide，ASO)杂交法 遗传病的遗传基础是基因顺序中发生一种或多种突变。根据已知基因突变位点的核苷酸序列，人工合成两种寡核苷酸探针，一种是相应于突变基因碱基序列的寡核苷酸(M)，一种是相应于正常基因碱基序列的寡核苷酸(N)，用它们分别与受检者DNA进行分子杂交。若受检者DNA能与M杂交，而不能与N杂交，说明受检者是这种突变的纯合子；若受检者DNA既能与M结合，又能与N结合，说明受检者是这种突变基因的杂合子；若受检者DNA不能与M结合，但能与N结合，表明受检者不存在这种突变基因；如果患者DNA和M、N均不结合，提示其缺陷基因可能是一种新的突变类型。所以寡核苷酸探针杂交法不仅可以确定已知突变，还为发现新的突变基因提供了有效途径。
(二)聚合酶链反应(PCR)
基因诊断时，需在成千上万的基因中仅仅分析一种目的基因，而且其通常是单拷贝的，这的确是较困难的。PCB技术的建立使基因诊断进入了一个崭新的阶段。PCR技术采用特异性的引物，能特异性地扩增出目的DNA片段。由于在基因顺序中突变区两侧的碱基序列和正常基因仍然相同。因此，根据待测基因两端的DNA顺序设计出一对引物，经PCR反应将目的基因片段扩增出来，即可进一步分析判断致病基因的存在与否，并了解其变异的形式。它不仅解决了上述几种方法样品需求量大的难题，而且极大地提高了灵敏度。例如：利用DNA缺失突变区域两侧5，和3，端引物进行PCR扩增，再通过凝胶电泳观察扩增DNA片段的大小，可诊断中等程度的DNA片段(0.5-1．5 kb)的突变；用多对PCR引物同日寸进行PCR的多重PCR技术，可同时对某一特定基因的不同DNA区域进行缺失诊断，这在杜氏肌营养不良症(duchenne muscular dystrophy，DMD)诊断中的应用就是一个典型的例证。
