第二十三章 分子生物学常用技术与人类基因组计划
第一节 分子杂交与印渍（迹）技术
一、分子杂交和印渍技术的原理
(－）分子杂交
DNA双链分子加热解链后，如缓慢降温，两条链之间可以根据碱基互补的方式再
重新形成双链。在DNA复性过程中，如果把不同的DNA单链分子放在同一溶液中，或
者把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间存在着一定程度的碱
基配对关系，就可以在不同的分子间形成杂化双链（heteroduplex），这种现象称为核酸分
子杂交。这一原理可以用来研究DNA分子中某一种基因的位置，两种核酸分子间的相
似性即同源性，也可以用于检测某些专一序列在待检样品中存在与否等。
（二）印渍技术
Edwen Southern在 1975年首先提出了分子印渍的概念。他将琼脂糖电泳分离的 DNA
片段在胶中进行变性使其成为单链，然后将一张硝酸纤维素（niutrocellulose，NC）膜放在胶上，上面放上吸水纸巾，利用毛细作用使胶中的DNA片段转移到NC膜上，使之成为
固相化分子。载有DNA单链分子的NC膜就可以在杂交液与另一种DNA或RNA分子
（即探针，可用同位素标记）进行杂交，具有互补序列的RNA或DNA结合到存在于NC膜的DNA分子上，经放射自显影或其他检测技术就可以显现出杂交分子的区带。
由于这种技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称为“blotting”，译为印渍
技术。它的定义是将存在于凝胶中的生物大分子转移（印渍）于固定化介质上并加以检
测分析的技术。目前这种技术已广泛用于DNA、RNA、蛋白质的检测。
除了上述靠毛细作用将DNA转移至NC膜外，后来又发展了电转移印渍技术和真空吸引转移印渍,缩短了转移所需的时间,另外NC膜亦有许多换代产品取而代之.
（三）探针技术
将一小段已知序列的多聚核苷酸用同位素、生物素或荧光染料标记它的末端或全链
后就可以作为探针（probe），与固定在NC膜上的DNA或RNA进行结合反应。探针的序列
如果与NC膜上的核酸序列相互补，就可以结合到膜上的相应区带，经放射自显影或其
他检测手段就可以判定膜上是否有同源的核酸分子存在。
二、印渍技术的类别及应用
（－）DNA印渍技术
如前所述， DNA印渍术（DNA blotting）由 Edwen Southern等人首次应用，因而以其姓氏命名，被广泛称为Southern blotting，其操作流程图参见第十五章图15一11。基因组DNA经限制性内切酶消化后进行琼脂糖凝胶电泳，将含有DNA区带的凝胶放入变性溶液变性后，按照图中顺序将NC膜放在胶上，盘中的转移缓冲液将逐渐为胶和股上覆盖的滤
纸吸收，从而将腔中的DNA分子带到NC膜上。转移的速度取决于分子的大小，分子越
小，转移越快。转移完成后，加热使DNA固定于NC膜上，用于杂交反应。
DNA印渍术主要用于基因组DNA的分析，例如在基因组中特异基因的定位及检测
等，此外亦可用于分析重组质粒和噬菌体。
（二）RNA印渍技术
RNA也可以利用与 DNA印渍相类似的技术来进行分析。相对于 Southern blotting，有
人将RNA印渍称为 Northern blotting，其基本原理是一样的。 RNA分子较小，在转移前不
需进行限制性内切酶切割，而且变性RNA转移效率也比较满意。
RNA印渍技术目前主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平
以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。检测时，可以用合成的寡核昔酸片段
作为探针，也可以用克隆或提取的DNA片段作为探针进行标记。尽管RNA印渍技术检
测rnRNA表达水平的敏感性较PCR法低，但是由于其专一性好，假阳性率低，仍然被
认为是一个可靠的mRNA水平分析方法。
（三）蛋白质的印渍分析
印渍技术不仅可用于核酸的分子杂交，人们发现蛋白质在电泳之后也可以固定于膜
上，再与溶液中的其他蛋白分子相互结合，其中最常用的是用抗体来检测，因此也称为
免疫印渍技术（immunoblotting）。相对应于 DNA的 Southern blotting和 RNA的 Northern blottting，亦被称为 Western blotting（蛋白质印渍）。
蛋白质印渍技术的原理与DNA和RNA类似，首先将蛋白质用聚丙烯酸胺凝胶电泳
按分子大小分开，再将蛋白质转移到NC膜或其他膜上，蛋白质的位置可以保持在胶中
的原位上。与DNA和RNA不同的是，蛋白质的转移只有靠电转移方可完成，另外蛋白
质的检测是以抗体做探针的。反应时用碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶标记或同位素标记
第二抗体，反应之后用放射自显影或底物显色来检测蛋白区带的信号，底物亦可与化学
发光剂结合以提高敏感度。
免疫印渍技术用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分
析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
除上述三种印渍技术外，还有一些其他的方法可用于核酸和蛋白质的分析。例如，不经电泳分离直接将样品点在NC膜上用于杂交分析，这种方式被称为斑点印渍(dot blotting)；组织切片或细胞涂片可以直接用于杂交分析，称为原位杂交(in situ hybridization)；可以将多种已知序列的DNA排列在一定大小的尼龙膜或其他支持物上用于检测细胞或组织样品中的核酸种类，类似的技术称为DNA点阵(DNA array)。在此基础上发展起来的DNA芯片(DNA chip)技术更是在计算机控制的点样及强大的扫描分析硬件及软件的支持下，可以在很小的硅片上固定数千甚至上万个探针用于细胞样品中基因表达谱的分析、遗传性疾病的分析、病原微生物的大规模检测等。DNA芯片对核酸的研究工作以及未来的诊断技术都将产生革命性的影响。
