第三步是把肽链水解成片段，分别进行分析。方法甚多，常用者有胰蛋白酶法、胰凝乳蛋白酶法、溴化氰法等。胰蛋白酶能水解赖氨酸或精氨酸的羧基所形成的肽键。所以如果蛋白质分子中有4个精氨酸及赖氨酸残基，则可得5个片段。

胰凝乳蛋白酶水解芳香族氨基酸（苯丙、酪及色氨酸）羧基侧的肽键，溴化睛水解甲硫氨酸羧基侧的肽键。由水解生成的肽段，可用离子层折或其他层析方法将其分离纯化；如用双向纸电泳，可以得到肽图（图2－29），由此明了肽段的多少。

    然后测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法。肽段先与异硫氰酸苯酯反应，该试剂只与氨基末端氨基酸的游离α一氨基作用。再用冷稀酸处理，氨基末端残基即自肽链脱落下来，成为异硫氰酸苯酯衍生物，用层析可鉴定为何种氨基酸衍生物。残留的肽链可继续与异硫氰酸苯酯作用。如是逐个鉴定出氨基酸的排列顺序（图2-30）。

    如前所述，一条多肽链可被水解成若干片段，图2-29中，已被水解成27个片段。这些肽段经过分离纯化后，即可进行氨基酸顺序测定。但是获得了这些数据之后，还不能得出整条多肽键的氨基酸排列顺序，因为尚不清楚这些片段在多肽链中的前后次序。一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。兹举一个12肽为例以说明之。在实际工作中一个12肽在自动氨基酸顺序仪上就可测出氨基酸序列，不必经过酶解等步骤。经上述3种降解处理，获得8种肽段，根据它们的重复顺序排列，就可以正确地作出12肽的氨基酸排列顺序。

    近年来，由于核酸的研究在理论上及技术上的迅猛发展，人们开始通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列。蛋白质中的氨基酸顺序是从信使RNA（mRNA）中核苷酸序列翻译过来的，因此只要找到相应的mRNA测出它的核苷酸顺序，氨基酸序列也就清楚了。此方法先分离编码蛋白质的基因，测定DNA序列，排列出mRNA序列，按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列。目前多数蛋白质的氨基酸序列都是通过此方法而获知的。

                      四、蛋白质空间结构测定

    蛋白质的空间结构十分复杂，因而其测定的难度也较大。目前已知氨基酸序列的蛋白质多达20万个，而测得其空间结构仅8000个左右。通常采用X射线晶体衍射法（X一ray diffraction），首先将蛋白质制备成晶体。迄今为止，并非所有纯化蛋白质都能制备成满意的能供三维结构分析的晶体。例如糖蛋白，由于蛋白质分子中糖基化位点和某些位点的糖链结构存在不均一性，很难获得糖蛋白的晶体。X射线射至蛋白质晶体上，可产生不同方向的衍射，X线片则接受衍射光束，形成衍射图。这种行射图也即X射线穿过晶体的一系列平行剖面所表示的电子密度图。然后借助计算机绘制出三维空间的电子密度图。如一个肌红蛋白的衍射图有 25 000个斑点，通过对这些斑点的位置、强度进行计算，已得出其空间结构。此外，近年建立的二维磁共振技术，也已用于测定蛋白质三维空间结构。

    由于蛋白质空间结构的基础是一级结构，近年来根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构，受到科学家的关注。预测蛋白质空间结构的方法主要有两类。第一类方法是采用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。第二类方法是通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新的蛋白质空间结构的预测。

小结

    蛋白质是生物大分子，在体内分布广泛，含量丰富，种类繁多。每一种蛋白质都有其特有的生物学功能。

    蛋白质的基本组成单位是α一氨基酸，有20种。氨基酸属于两性电解质，在溶液的pH等于其pI时，氨基酸呈兼性离子。氨基酸可通过肽键相连而成肽。小于10个氨基酸组成的肽称为寡肽，反之则称为多肽。体内存在许多如 GSH、促甲状腺释放激素和神经肽等重要的生物活性肽。

    根据蛋白质的形状，可分成球状蛋白质和纤维状蛋白质。根据组成成分，还可分成单纯蛋白质和结合蛋白质，前者仅含有氨基酸，后者除氨基酸外，还含有非蛋白质的辅基成分。复杂的蛋白质结构可分成一级、二级、三级和四级结构四个层次。蛋白质一级结构是指蛋白质分子中氨基酸自N端至C端的排列顺序，即氨基酸序列，其连接键为肽键，还包括二硫键。形成肽键的6个原子处于同一平面，构成了所谓的肽单元。二级、三级和四级结构研究蛋白质的空间构象，分层次阐述蛋白质的三维立体结构。二级结构是指蛋白质主链局部的空间结构，不涉及氨基酸残基侧链构象。主要为α一螺旋、β折叠、β转角和无规卷曲，以氢键维持其稳定性。在蛋白质中，存在二个或三个具有二级结构的肽段所形成的特殊空间构象，称为模序，发挥着特殊的生物学功能。三级结构是指多肽链主链和侧链的全部原子的空间排布位置。三级结构的形成和稳定主要靠次级键。一些蛋白质的三级结构可形成1个或数个球状或纤维状的区域，各行其功能，称为结构域。四级结构是指蛋白质亚基之间的缔合，也主要靠体级键维系。

    体内存在数以千万种蛋白质，各有其特定的结构和特殊的生物学功能。一级结构是空间构象的基础，也是功能的基础。一级结构相似的蛋白质，其空间构象及功能也相近。若蛋白质的一级结构发生改变则影响其正常功能，由此引起的疾病称为分子病。

    蛋白质空间构象与功能有着密切关系。血红蛋白亚基与O2结合可引起另一亚基构象变化，使之更易与q结合，所以血红蛋白的氧解离曲线呈S型。这种变构效应是蛋白质中普遍存在的功能调节方式之一。蛋白质的空间构象发生改变，可导致其理化性质变化和生物活性的丧失。蛋白质发生变性后，只要其一级结构未遭破坏，仍可在一定条件下复性，恢复原有的空间构象和功能。

    分高纯化蛋白质是研究单个蛋白质结构与功能的先决条件。通常利用蛋白质的理化性质，采取不损伤蛋白质结构和功能的物理方法来纯化蛋白质。