(五)蛋白质的呈色反应

    1．茚三酮反应（ninhydrin reaction）蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应，详见本章第一节。

    2．双缩脲反应（buret reaction）蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，称为双缩脲反应。氨基酸不出现此反应。当蛋白质溶液中蛋白质的水解不断加强时，氨基酸浓度上升，其双绩豚是色的深度就逐渐下降，因此双缩腺反应可检测蛋白质水解程度。

                      二、蛋白质的分离和纯化

    （－）丙酮沉淀及盐析

    这是两种常用的使蛋白质从溶液中沉淀的方法。蛋白质在溶液中一般含量很低，经沉淀浓缩，以利进一步分离纯化。使用丙酮沉淀时，必须在0－4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离，否则蛋白质会变性。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。

盐析（salt precipitation）是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，破坏蛋白质在水溶液中的稳定性因素而沉淀。各种蛋白质盐折时所需的盐浓度及pH均不同。例如血清中的白蛋白及球蛋白，前者溶于 pH 7．0左右的半饱和的硫酸铵溶液中，而后者在此溶液中沉淀。当硫酸按溶液达到饱和时，白蛋白也随之析出。所以盐析法可将蛋白质初步分离，不过欲得纯品，尚需用其他方法。许多蛋白质经纯化后，在盐溶液中长期放置逐渐析出，成为整齐的结晶。

蛋白质在高于或低于其pI的溶液中是带电的，在电场中能向电场的正极或负极移动，这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术，称为电泳（electrophoresis）。根据支撑物的不同，有薄膜电泳、凝胶电泳等。薄膜电泳是将蛋白质溶液点样于薄膜上，薄膜两端分别加正负电极，此时带正电荷的蛋白质向负极泳动；带负电荷的向正极泳动；带电多，分子量小的蛋白质泳动速率快；带电少，分子量大的则泳动慢，于是蛋白质被分离。凝胶电泳的支撑物为琼脂糖、淀粉或聚丙烯酸胺凝胶。凝胶置于玻璃板上或玻璃管中，两端加上正负电极，蛋白质即在凝胶中泳动。电泳结束后，用蛋白质显色剂显色，即可看到一条条已被分离的蛋白质色带。

    （三）透析

    利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法叫透析（dialysis）。透析袋是用具有超小微孔的膜，如硝酸纤维素膜制成。微孔一般只允许分子量为 10 000以下的化合物通过。蛋白质是高分子化合物故留在袋内。当透析袋内盛有蛋白质溶液，再置于水中，则小分子物质如硫酸铵、氯化钠等即透过薄膜。不断更换袋外的水，可把袋内小分子物质全部去尽。如果袋外放吸水剂如聚乙二醇，则袋内水分伴同小分子物质逐出袋外，袋内蛋白质溶液尚可达到浓缩的目的。

    （四）层析

层析（chromatography）是蛋白质分离纯化的重要手段之一。层析种类很多，有离子交换层析。亲和层析等。其中离子交换层析应用最广。蛋白质和氨基酸一样，是两性电解质，在某一特定pH时，各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离（图2-26）。

图2－26介绍的是阴离子交换层析，将阴离子交换树脂颗粒填充在层析管内，由于阴离子交换树脂颗粒上带正电荷，能吸引溶液中的阴离子（图2-26a）。然后再用含阴离子（如 Cl－）的溶液洗柱。含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来（图 2-26b），增加 Cl浓度。含负电量多的蛋白质也被洗脱下来（图2-26C），于是两种蛋白质被分开。

    （五）分子筛

又称凝胶过滤（gel filtration），是层析的一种，层析柱内填满带有小孔的颗粒，一般由葡聚糖制成。蛋白质溶液加于柱之顶部，任其往下渗漏，小分子蛋白质进人孔内，因而在柱中滞留时间较长，大分子蛋白质不能进入孔内而径直流出，因此不同大小的蛋白质得以分离（图2-27）。

（六）超速高心

超速离心法（ultracentrifuation）既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。蛋白质在高达50万g（g为gravity，即地心引力）的重力作用下，在溶液中逐渐沉降，直至其浮力（buoyant force）与离心所产生的力相等，此时沉降停止。不同蛋白质其密度与形态各不相同，因此用上述方法可将它们分开。蛋白质在离心场中的行为用沉降系数（sedimentation coefficient，S）表示，系数与蛋白质的密度和形状相关（表2－3）。

dx／dt代表颗粒在离心场中的移动速率，。为离心头的角速度，X是距转动中心的距离，t为离心时间。沉降系数（S）使用Svedberg单位（1S＝10-13秒）。

    应用超速离心法测定蛋白质分子量时，一般用一个已知分子量的标准蛋白质作为参照，因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，它的计算式如下：

    这一算式对多数球状蛋白质都适用，但大多数纤维状蛋白质由于其分子形状的高度不对称性，无法使用上述简单算式。

                    三、多肽链中氨基酸序列分析

    自从1953年Sanger首次完成胰岛素的氨基酸顺序测定以来，目前已有很大改进。当年Sanger花费多年才基本搞清胰岛素的一级结构，现今由于方法学改进及自动化分析仪器的产生，已有数万种蛋白质的氨基酸序列问世。当今的分析原则基本借用Sanger提出的方法，但具体方法已有很大改进。首先分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成、蛋白质经盐酸水解后成为个别氨基酸，用离子交换树脂将各种氨基酸分开，测定它们的量，算出各氨基酸在蛋白质中的百分组成或个数（图2－28）。第二步测定多肽键的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基，即肽链头、尾的氨基酸残基。Sanger当年用二硝基氟苯与多肽链的α一氨基作用生成二硝基苯氨基酸，然后将多肽水解，分离出带有二硝基苯基的氨基酸。目前多用丹酰氯使之生成丹酸衍生物，该物质具强烈荧光，更易鉴别。羧基端氨基酸残基可用羧肽酶将羧基端氨基酸残基水解下来。当鉴定了头、尾两端的氨基酸残基以后，此二头可作为整条肽链的标志点（表2-4）。