根据Perulz等利用x线衍射技术分析Hb和氧合Hb结晶的三维结构图谱，提出了解释O2与Hb结合的正协同效应的理论。

未结合O2时，Hb的α/β和α/β呈对角排列，结构较为紧密，称为紧张态（tense state,T态），T态Hb与O2的亲和力小。随着O2的结合，4个亚基羧基末端之间的盐键断裂，其二级、三级和四级结构也发生变化，使α/β和α/β的长轴形成15”的夹角（图2一23），结构显得相对松弛，称为松弛态（relaxed State，R态）。图 2－24显示 Hb氧合与脱氧时T态和R态相互转换的可能方式。T态转变成R态是逐个结合O2而完成的。在脱氧Hb中，Fe2+半径比卟啉环中间的孔大，因此Fe2+高出卟琳环平面0．075nrn，而靠近F8位组氨酸残基。当第1个O2与血红素Fe2+结合后．使Fe2+的半径变小，进入到卟啉环中间的小孔中（图2－25），引起F肽段等一系列微小的移动，同时影响附近肽段的构象，造成两个α亚基间盐键断裂，使亚基间结合松弛，可促进第二个亚基与O2结合，依此方式可影响第三、四个亚基与O2结合，最后使四个亚基全处于R态。此种一个氧分子与 Hb亚基结合后引起亚基构象变化，称为变构效应（allosteric effect）。小分子O2称为变构剂或效应剂，Hb则被称为变构蛋白。变构效应不仅发生在Hb与O2之间，一些酶与变构剂的结合、配体与受体结合也存在着变构效应，所以它具有普遍意义。系列微小的移动，同时影响附近肽段的构象。

          第四节  蛋白质的理化性质及其分离纯化

    蛋白质既然由氨基酸组成，其理化性质必然与氨基酸相同或相关，例如，两性电离及等电点、紫外吸收性质、呈色反应等。但蛋白质又是生物大分子化合物，还具有胶体性质、沉淀、变性和凝固等特点。细胞和体液中蛋白质都是数以百万计相混合，要分析单个蛋白质的结构和功能势必先要分离纯化蛋白质。蛋白质分离通常就利用其特殊理化性能，采取盐析、透析、电泳、层析及超速离心等不损伤蛋白质空间构象的物理方法，以满足研究蛋白质结构与功能的需要。

                        一、蛋白质的理化性质

    （一）蛋白质的两性电离

    蛋白质分子除两端的氨基和氨基可解离外，侧链中某些基团，如谷氨酸、天冬氨酸残基中的γ和β—羧基，赖氨酸残基中的ε—氨基，精氨酸残基的胍基和组氨酸的咪唑基，在一定的溶液水条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。蛋白质溶液的pH大于等电点时，该蛋白质颗粒带负电行，反之则带正电荷。

    体内各种蛋白质的等电点不同，但大多数接近于 pH5 .0所以在人体体液 pH 7．4的环境下，大多数蛋白质解离成阴离子。少数蛋白质含碱性氨基酸较多，其等电点偏于碱性，被称为碱性蛋白质，如鱼精蛋白、组蛋白等。也有少量蛋白质含酸性氨基酸较多，其等电点偏于酸性，被称为酸性蛋白质，如胃蛋白酶和丝蛋白等。

    （二）蛋白质的肢体性质

    蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的颗粒大小可达l－100nm胶粒范围之内。蛋白质颗粒表面大多为亲水基团，可吸引水分子，使颗粒表面形成一层水化膜，从而阻断蛋白质颗粒的相互聚集，防止溶液中蛋白质的沉淀析出。除水化膜是维持蛋白质胶体稳定的重要因素外，蛋白质胶粒表面可带有电荷，也可起胶粒稳定的作用。若去除蛋白质胶粒两个稳定因素，蛋白质极易从溶液中沉淀。

    （三）蛋白质的变性、沉淀和凝固

    蛋白质的三级结构主要依赖于氨基酸残基R之间的相互作用，从而保持蛋白质的天然构象。但在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失，称为蛋白质的变性（denaturation）。一般认为蛋白质的变性主要发生二硫键和非共价键的破坏，不涉及一级结构的改变。蛋白质变性后，其溶解度降低，粘度增加，结晶能力消失，生物活性丧失，易被蛋白酶水解。造成蛋白质变性的因素有多种，常见的有加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。在医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外，防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。

    蛋白质变性后，疏水侧链暴露在外，肽链融汇相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出，这一现象被称为蛋白质沉淀。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。

    若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，有些蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性（renaturation）。图2－17所示，在核糖核酸酶溶液中加入尿素和β一巯基乙醇，可解除其分子中的4对二硫键和氢键，使空间构象遭到破坏，丧失生物活性。变性后如经透析方法去除尿素和β巯基乙醇，并设法使巯基氧化成二硫键，核糖核酸酶又恢复其原有的构象，生物学活性也几乎全部重现。但是许多蛋白质变性后，空间构象严重被破坏，不能复原，称为不可逆性变性。

    蛋白质经强酸、强碱作用发生变性后，仍能溶解于强酸或强碱溶液中，若将pH调至等电点，则变性蛋白质立即结成絮状的不溶解物，此絮状物仍可溶解于强酸和强碱中。如再加热则絮状物可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中，这种现象称为蛋白质的凝固作用（protein coagulation）。实际上凝固是蛋白质变性后进一步发展的不可逆的结果。

    （四）蛋白质的紫外吸收

    由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。在此波长范围内，蛋白质的O．D．280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。