1. 西南大学 园艺园林学院，重庆 400715;
2. 重庆市农业科学研究院，重庆 401329
收稿日期：2020-10-02；接收日期：2021-01-21；网络出版时间：2021-02-01
基金项目：重庆市自然科学基金(Nos. cstc2019jcyj-zdxmX0022，cstc2019jcyj-msxmX0335)，重庆市技术创新与应用发展专项(No.cstc2019jscx-gksbX0114，cstc2018jscx-mszdX0010) 资助
摘要：开花是植物生长发育的关键转折，与种子生产和作物产量密切相关。开花转变受到复杂的基因网络调控，许多开花相关基因通过可变剪接产生多种转录本，调控开花时间。文中从多个角度系统地综述了可变剪接调控植物开花的分子机制，并对将来的研究进行了展望。
关键词：可变剪开花剪接因子表观调控
Mechanisms of alternative splicing in regulating plant flowering: a review
Huanhuan Lu1, Qinlin Deng1, Mengdan Wu1, Zhimin Wang1, Dayong Wei1, Hebing Wang2, Huafeng Xiang2, Hongcheng Zhang2, Qinglin Tang1
1. College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 400715, China;
2. Chongqing Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 401329, China
Received: October 2, 2020; Accepted: January 21, 2021; Published: February 1, 2021
Supported by: Natural Science Foundation of Chongqing, China (Nos. cstc2019jcyj-zdxmX0022, cstc2019jcyj-msxmX0335), Technology Innovation and Application Development Project of CQ CSTC, China (No. cstc2019jscx-gksbX0114, cstc2018jscx-mszdX0010)
Corresponding author: Qinglin Tang. Tel: +86-23-68251274; E-mail: swutql@163.com.
Abstract: Flowering is a critical transitional stage during plant growth and development, and is closely related to seed production and crop yield. The flowering transition is regulated by complex genetic networks, whereas many flowering-related genes generate multiple transcripts through alternative splicing to regulate flowering time. This paper summarizes the molecular mechanisms of alternative splicing in regulating plant flowering from several perspectives, future research directions are also envisioned.
Keywords: alternative splicingfloweringsplicing factorepigenetic regulation
植物开花是营养生长向生殖生长的转变，这一发育进程受到多种因素调控，例如温度、光照等外在环境条件以及衰老信号、昼夜节律等内在遗传因素[1-2]。开花相关因子能在转录水平和转录后水平调控开花[3]，例如可变剪接[4]以及甲基化、乙酰化等表观修饰[5]。近年研究表明，可变剪接在开花调控中具有重要作用[6]。可变剪接在许多生物中很常见，例如模式植物拟南芥中至少61%的内含子基因都存在可变剪接，产生多种成熟转录本及其功能不同的变异体，这极大地增加了潜在功能蛋白的数量[7]。
可变剪接可选择不同剪接位点，从而产生多个mRNA转录异构体。可变剪接方式主要包括：外显子跳跃(Exon skipping)、内含子保留(Intron retaining)、互斥外显子剪接(Mutually exclusive exons)、可变5′端剪接位点(Alternative 5′splice site)和可变3′端剪接位点(Alternative 3′ splice site)[8]。其中，内含子保留为常见的可变剪接方式[9]。可变剪接可能会导致蛋白质结构和功能发生变化，例如蛋白功能域的改变或完全去除。此外，由于内含子保留和3′或5′端可变剪接位点的偏移，会引入过早终止密码子(Premature termination codon，PTC)，可形成蛋白截短体或无义衰变(Nonsense-mediated mRNA decay，NMD)。另外，由于缺少所必需的结构域，外显子跳跃还可形成非功能性蛋白[10]。因此，本文综述了可变剪接在开花调控中的作用机制，为其全面深入研究提供借鉴。
1 发育年龄诱发FT可变剪接调控开花植物通常在发育到特定时期或生育年龄时才触发开花[11]。Flowering Locus T (FT) 作为成花素调控着年龄发育的成花信号。FT蛋白是磷脂酰乙醇胺结合蛋白(Phosphatidylethanolamine-binding protein，PEBP) 家族的一个分支，它在植物中高度保守。FT蛋白在叶片中合成后，通过脉管系统进入茎尖分生组织(Shoot apical meristem，SAM)，与14-3-3蛋白质和碱性亮氨酸拉链(Basic leucine zipper，bZIP) 转录因子flowering locus D(FD)相互作用，诱导开花[12]。FT-FD复合体能启动许多MADS盒基因(例如APETALA1、FRUITFULL和SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1) 的表达，从而促进开花和花器官发育[13]。
在单子叶植物二穗短柄草Brachypodium distachyon中有FT的两个同源基因FT1和FT2，其中FT2具有年龄依赖的不同可变剪接体FT2α和FT2β，它们能够协同调节开花时间。蛋白结构域分析显示，FT2β蛋白剪接体缺失了PEBP结构域(FT2的N端区域)，从而丧失了该结构域的相关功能。FT2β不能与14-3-3蛋白、FD蛋白相互作用，但仍可与FT2α、FT1蛋白互作。二穗短柄草中异位表达FT2α导致营养生长停滞、开花提前；然而，在超表达FT2β的转基因株系中开花和抽穗期均延迟[14]。有趣的是，FT2β不但不能与FD或14-3-3蛋白互作，反而与FT2α形成复合物，作为一种抑制因子竞争性减弱了FT2α与FD和14-3-3蛋白的结合，从而减少了功能性复合物的表达量，延缓开花。当FT2β被特异性敲除后，开花抑制因子VERNALIZATION1 (VRN1) 的表达也会显著升高[14]。由此说明，FT2β剪接体确实能调节开花基因表达及开花时间。
利用实时定量聚合酶链反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR) 分析发现，在短柄草整个发育过程中FT2α和FT2β的转录水平都会逐渐升高，但随着发育年龄的增长FT2α比FT2β增加更快，FT2β/FT2α丰度比值呈下降趋势。说明FT2β转录本在植株的幼苗期和营养生长期中更丰富，而FT2α转录本在成株期和生殖生长期中更丰富[14]。由此表明FT2通过年龄发育途径来调整剪接体FT2α与FT2β的比值，FT能够将内源性年龄发育信号整合到开花调控途径。
Xia等最近分析比较了高型和矮型两种椰子的幼苗和成熟期的转录组信息，发现椰树的开花受光周期途径调节，FT是参与此信号转导途径的关键基因。8–10年生开花的高型椰子具有丰富的较长FT转录本；而3–5年生开花的矮型椰子只含有缺失了6 bp的较短FT转录本[15]。推测FT的这种可变剪接可能会导致矮型和高型椰子之间开花时间的差异，但需进一步研究验证。
2 环境温度引起开花因子可变剪接2.1 FCA和COOLAIR可变剪接近年来，不少科研人员聚焦于植物温度适应的分子机制研究。众所周知，即使环境温度的微小变化也可能会极大地影响植物生长发育，改变株型，例如茎伸长和花期提早等。环境温度的波动可引起开花基因发生可变剪接。拟南芥Flowering Control Locus A (FCA) 就是一个很好的例子，它能参与miR172的富集[16]。随着温度变化，拟南芥FCA产生多个可变剪接体。在23 ℃下产生的FCA功能性全长蛋白比在16 ℃下更为丰富，更能引起miR172的积累[17]。最近研究发现，拟南芥miR172通过控制靶标基因COOLAIR的表达，间接调控开花抑制基因Flowering Locus C (FLC)。FLC在春化途径中起着核心调节作用，属于MADS盒转录因子；COOLAIR是来自FLC基因座的长的非编码反义RNA[18]。此外，拟南芥COOLAIR的可变剪接也具有温度依赖性，它能产生两类COOLAIR变体，它们分别终止于FLC基因座的近端(有义内含子6，Ⅰ类) 和远端位点(有义启动子，Ⅱ类)[19]。其中，具有近端聚腺苷酸化作用的Ⅰ类COOLAIR转录本与FLC抑制相关；相比之下，Ⅱ类COOLAIR转录本与FLC高表达水平相关[19]。
2.2 FLM可变剪接与FLM-SVP模式FLOWERING LOCUS M (FLM) 又称为MADS AFFECTING FLOWERING 1 (MAF1)，也是一个MADS盒转录因子，它参与温敏开花途径，延迟开花时间[20]。那么，温度信号是如何驱使FLM发挥开花调控功能呢？最近研究发现，拟南芥FLM可通过选择性剪接产生多个不同的转录本：FLM-α、FLM-β、FLM-γ和FLM-δ。其中FLM-α和FLM-γ不具有开花调控功能。FLM选择性剪接后的转录本在较高温度下会被NMD途径快速降解，而在不太高的环境温度下则相对稳定[21]。
FLM可变剪接体除了能被NMD途径降解之外，还存在另外一种分子互作方式调节其开花功能。拟南芥FLM和SHORT VEGETATIVE PHASE (SVP) 参与温敏开花途径，它们能发生蛋白互作从而调控开花。当它们突变之后均对环境温度的变化不敏感[22]。在拟南芥FLM的可变剪接体中，FLM-β和FLM-δ是具有功能的主要形式，分别在该基因的第二和第三外显子上各不相同，其剪接体形式对温度敏感[20]。它们对开花的调节功能相反，其中FLM-β为开花抑制子，而FLM-δ为促进因子[23]。FLM-β、FLM-δ剪接体能与SVP蛋白竞争性结合，其中FLM-δ/SVP复合体缺乏DNA结合活性[22]。当温度较高时，拟南芥SVP蛋白与FT基因启动子的结合能力降低。另外，在flm突变体中，SVP与FT基因的温敏性结合特性也会消失。由此说明FLM促进了SVP与FT基因的结合能力[22]。
在16 ℃相对较低温度下，FLM-β剪接体的表达水平较高，FLM-β/SVP和SVP/SVP复合物占主导地位，负调开花整合子(例如SOC1和FT)的表达，抑制开花。相反，在27 ℃相对较高温度下大量诱导FLM-δ剪接体，并与FLM-β相互竞争，FLM-δ/SVP复合物较为丰富，竞争性削减了FLM-β/ SVP的数量，从而间接促进开花转变(图 1)[21-23]。虽然FLM-δ的超表达促进开花，但它属于温敏型开花途径，与低温春化途径的调控机制并不相同[24]。进一步利用CRISPR/Cas9编辑技术定向删除FLM-β和FLM-δ的特异性外显子，产生仅表达FLM-β或FLM-δ转录本的株系[23]。只表达FLM-β (无FLM-δ表达) 的突变体株系开花延迟；而仅产生FLM-δ (无FLM-β表达) 的株系提早开花[23]。说明FLM-β能够抑制开花，两种剪接体FLM-β/FLM-δ的比例可调节开花时间，并受环境温度影响[25]。
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| 图 1 FLM可变剪接的开花调控机制[21-23] Fig. 1 Regulatory mechanism of FLM alternative splicing in flowering time control[21-23] |
| 图选项 |
此外，通过外显子序列的环化产生的环状RNA (Circular RNA，CircRNA)，也可作为可变剪接的产物。CircRNA在植物生长和发育调控中起重要作用。最近发现：FLM-β circRNA具有与FLM-β mRNA相似的温度依赖性表达模式，该circRNA可在低温下诱导高丰度的FLM-β蛋白[26-27]。
2.3 MAF2可变剪接和MAF2-SVP作用模式MADS AFFECTING FLOWERING 2 (MAF2)是一个与FLM密切相关的MADS盒因子，也受到温度依赖性可变剪接调控。拟南芥MAF2可产生3种剪接体：MAF2var1、MAF2var2和MAF2var5。其中MAF2var1是拟南芥MAF2的主要剪接变体，它在较低温度下诱导表达，MAF2var1与SVP形成蛋白复合物，抑制开花[28]。拟南芥MAF2var2剪接变体在较高温度下诱导表达，它的内含子被保留其中，含有提前的终止密码子PTC。由MAF2var2产生的截短蛋白缺少一部分K域以及整个C域，而K域、C域对该蛋白同源或异源二聚体的形成很重要[29-30]。因此，MAF2var2截短蛋白不能与SVP结合形成抑制性复合物。MAF2的另一个重要剪接变体是MAF2var5，它能跳过第6个外显子引起PTC[31]。尽管拟南芥MAF2var5的表达水平较低且其表达对环境温度变化有些不敏感，但MAF2var5蛋白能够与SVP相互作用[31]。此外，拟南芥MAF2var5超表达导致开花提早，暗示MAF2var5与FLM彼此竞争性与SVP互作，这可能与FLM-δ蛋白的功能相似[31]。
综上可知，在FLC分支上的几个成员(例如FLM、MAF2)都与温敏途径有关，它们也能产生不同剪接体，与SVP蛋白直接或间接作用。在不同温度的诱导下，这些可变剪接体的表达量和比例也有明显差异。例如，MAF2-SVP和FLM-SVP两种作用模式均可感知环境温度，它们协同调节开花的时间。
2.4 温度敏感的其他可能作用模式在开花调控中，温度介导的可变剪接的范围并不局限于以上这些例子。近年发现，碳水化合物是植物开花调控的重要诱导信号。例如，拟南芥INDETERMINATED DOMAIN 14 (IDD14) 转录因子受温度依赖的可变剪接影响，调控淀粉积累以应答寒冷胁迫，碳水化合物与温度信号转导之间相互关联，可能引起开花转变[32]。该领域另一个核心问题是，植物温度调节机制如何影响花期调控因子的可变剪接事件呢？目前已有一些研究旨在破译植物中的热传感器[33]。最具特色的是红色/远红色的光敏色素感光体，它在拟南芥中起着热传感器作用。众所周知，在温暖条件下会促进生理活化的光敏色素远红光(Phytochrome far- red light，Pfr) 向非活性光敏色素红光(Phytochrome red light，Pr) 转化，说明植物中很可能存在红光依赖性的选择性剪接[34]。由此可见，在温敏途径中，除了开花基因会通过可变剪接调节开花之外，其他代谢途径的一些因子也可能依赖可变剪接调控开花。
3 光周期途径CONSTANS的可变剪接激发开花转变3.1 CO的调控及其剪接变体相互作用在拟南芥光周期开花途径中，CONSTANS (CO) 作用于开花整合子FT从而调节其表达，促进开花[2]。黄素结合蛋白(FLAVIN-BINDING KELCH REPEAT F-BOX 1，FKF1) 和GIGANTEA (GI) 能在长日照(Long days，LDs)下发生蛋白互作，但该作用不能在短日照(Short days，SDs) 下发生[35]。FKF1-GI复合物对CO的阻遏物CYFLING DOF FACTOR 1 (CDF1) 具有抑制作用，从而诱导CO主要在LDs下转录。CO除了受到转录调控之外，CO的编码蛋白也会受到翻译后修饰[36]。CO蛋白的稳定性由一组E3泛素连接酶调节，高表达渗透反应因子1 (High expression of osmotically responsive gene1，HOS1)能在清晨触发CO的降解[37]。同时光形态建成因子1 (Constitutive photomorphogenesis 1，COP1) 指导夜间CO的降解。另外，FKF1将蓝光信息传递到泛素蛋白酶体系统中，以增强CO蛋白的稳定性，从而调节光周期[38]。
CO也能发生选择性剪接，产生2种剪接体：具有完整功能的全长COα和C末端缺失的截短体COβ[39]。全长COα包含B-box (BBX) 和CCT结构域；而截短体COβ则缺少CCT结构域。DNA测序发现，COβ的转录本包含一个在COα中不存在的内含子，说明CO的选择性剪接由内含子保留介导，并且不会被NMD途径降解[39]。CO剪接变体的亚细胞定位发现，COα和COβ转录物也可位于细胞质。酵母双杂交和双分子荧光互补检测均表明，COα、COβ剪接体彼此可相互作用，形成同源二聚体或异源二聚体[39]。
3.2 光周期调控CO的可变剪接引起开花转变拟南芥的全长COα超表达会提早开花。然而，截短体COβ超表达则延迟开花，这与CO缺陷型突变植株的表型相似[40]。另外，当COβ与COα共表达时，COα对开花诱导的促进作用会受到阻碍，表明COβ是COα的竞争性抑制物[40]。同时，FT是CO转录因子的直接目标，通过光周期诱导的CO来直接激活开花促进因子FT的表达[41-42]。另外，CO还能与一些转录因子聚合，增强其与DNA之间的结合力和特异性[32]。例如，拟南芥COα剪接体可与组蛋白或血红素相关蛋白(Histone-or heme-associated proteins，HAP) HAP5A转录因子形成二聚体，并结合DNA；然而COβ不与靶基因结合，但它可与COα结合，从而抑制COα-HAP5A二聚体的形成[39]。因此，COβ与COα具有相互竞争性，在靶基因DNA上削减了含COα的二聚体，从而降低CO活性。拟南芥COβ与COα共表达不会干扰COα的激活能力，即COβ不会影响COα转录激活活性[42]。
那么，光周期信号如何与CO可变剪接相关联呢？近期研究发现：拟南芥COβ的表达能增强COα与降解酶HOS1和COP1的相互作用，但抑制了其与黄素结合蛋白FKF1的相互作用；而且COβ不与E3酶相互作用[39]。HOS1负责白天的CO降解，而COP1则指导夜间的CO降解。因此，在白天和黑暗条件下，拟南芥COβ超量表达都会导致COα不稳定。此外，COβ减少了COα与FKF1的相互作用，从而使LDs处理导致CO在傍晚时具有稳定性[39]。
CO属于BBX转录因子家族，拟南芥中有32个BBX成员。据报道，在结构上与COα或COβ相似的其他BBX转录因子也参与开花调控[43]，暗示CO选择性剪接与光周期开花调控相关。CO选择性剪接事件并不局限于拟南芥，短柄草CO也会发生选择性剪接，产生两种蛋白剪接体：全长CO剪接体和C末端截短的CO剪接体[39]。由此说明，CO可变剪接现象存在于多种植物中，并依赖光周期途径调节开花。
4 剪接因子调节开花基因FLC和FLMmRNA的前体剪接由剪接体催化，剪接体主要部分是由U1、U2、U4、U5和U6组成的大型且高度动态的核糖核蛋白复合体(Small nuclear ribonucleoprotein particle，snRNP)[44]。在剪接的第一步，U1snRNP和U2snRNP参与剪接位点识别，在此过程中，U1 snRNP和U2 snRNP辅助因子(U2 auxiliary factor，U2AF) 分别与内含子的5′和3′剪接位点结合[45]。人的U2AF由两个亚基组成：较小亚基U2AF35和较大亚基U2AF65[46]。目前已在拟南芥、烟草、玉米和水稻中鉴定出U2AF35和U2AF65的同系物[47-50]。基于最新发现，我们收集并整理了一些剪接因子，它们通过调节前体mRNA的剪接进而调节开花因子FLC、FLM。
4.1 剪接因子调节FLC的可变剪接FLC属于MADS盒转录因子，它在自主开花途径和低温春化途径中起着核心调节作用。FLC蛋白可抑制拟南芥开花整合子(例如FT和SOC1)的表达。因此，FLC的表达调控对于拟南芥在转录和翻译后水平的开花调节至关重要[51]。mRNA前体剪接是调节FLC表达的重要方式[52]。在拟南芥FLC剪接调控中已发现几个剪接因子。例如，在进行拟南芥早花突变体筛选时，Mahrez等鉴定了BRR2a等位基因，它对U5snRNP的剪接激活必不可少[53]。BRR2蛋白在真核生物中高度保守，拟南芥BRR2a基因在植物多个部位广泛表达，主要参与开花基因FLC转录本的加工剪接[53]。
最近研究发现拟南芥AtU2AF65a和AtU2AF65b均与FLC前体mRNA的剪接有关[50, 54]。拟南芥AtU2AF65a和AtU2AF65b蛋白均与酵母或人的U2AF65同源。AtU2AF65a和AtU2AF65b的功能丧失型突变体分别表现晚花和早花，而且在这两个突变体中FLC的非规范性剪接变体增加。但是，在atu2af65a和atu2af65b突变体之间的非规范剪接变体的差异明显[54]。由此表明，AtU2AF65a和AtU2AF65b可以识别FLC的不同内含子。这种差异可能分别导致atu2af65a和atu2af65b突变体的FLC mRNA水平升高或降低。进一步研究表明，在atu2af65b突变体的茎尖中，FLC的内含子1和6的保留增强，从而导致这些内含子的剪接效率降低以及FLC mRNA水平下降[50]。
SNW/Ski相互作用蛋白(SNW/Ski-interacting protein，SKIP) 作为一种核剪接因子，可通过拟南芥中的选择性剪接控制生物钟昼夜节律[55]。最近报道，在正常生长条件下，剪接因子SKIP突变会影响前体mRNA的剪接。功能丧失的skip-1突变体在LD和SD条件下均表现出早花。另外，拟南芥skip-1突变会导致多种器官发育异常，包括根系变短、花器官缩小、花器官异常和角果变长等[56]。进一步研究表明，SKIP-1的突变还会抑制FLC、MAF1、MAF4和MAF5的表达，从而促进下游开花整合子(例如SOC1、FT和TWIN SISTER OF FT (TSF)) 的表达，导致开花提前[56]。但是，拟南芥SKIP并不会直接影响FLC前体mRNA的剪接，而是通过某种间接方式调节FLC表达以控制开花[57]。深入研究发现，skip-1突变体会造成SERRATED LEAVES AND EARLY FLOWERING (SEF) 前体mRNA剪接缺陷，由于内含子保留，导致成熟的SEF mRNA水平降低。而且成熟SEF mRNA含量的降低会使FLC、MAF4和MAF5的表达失活，最后加速开花。由此表明，PHOTOPERIOD-INDEPENDENT EARLY FLOWERING 1 (PIE1)、ACTIN-RELATED PROTEIN 6 (ARP6) 和SEF (即SWR1 chromatin remodeling complex SWR1-C组成基因) 突变之后会导致FLC、MAF4和MAF5基因沉默，提早开花(图 2)[58-60]。
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| 图 2 基于SEF可变剪接方式调节FLC的机制[58-60] Fig. 2 Regulatory mechanism of FLC in flowering time control based on SEF alternative splicing[58-60]. |
| 图选项 |
此外，SKIP调节SEF Pre-mRNA的剪接与组蛋白变体有关。SEF蛋白是SWR1-C的一个组成部分，SEF能将组蛋白H2A交换为H2A.Z，从而产生变体核小体。SWR1-C是在3个位置(FLC、MAF4和MAF5) 募集H2A.Z所必需的。目前已开展了大量有关FLC和MAF表观遗传修饰研究，包括DNA甲基化、组蛋白甲基化、乙酰化、单泛素化和染色质重塑[61]。拟南芥H2A.Z正是在FLC、MAF4和MAF5染色质上富集和重塑，促进了它们的转录并延迟开花[62]。拟南芥SKIP不仅起着剪接因子的作用，调节FLC和MAF的表达并控制开花时间，而且还具有转录共激活因子的作用。例如，SKIP能通过选择性剪接和POLYMERASE-ASSOCIATED FACTOR 1 (PAF1)复合体直接调节MAF1的表达[57]。
4.2 剪接因子调节FLM可变剪接拟南芥FLM (MAF1) 及其同系物依赖温度调控开花的作用机制已有不少研究[63]，目前已发现一些特定剪接因子参与FLM和MAF可变剪接，调控开花时间。例如，拟南芥ARABIDOPSIS SF1 HOMOLOG (AtSF1) 通过直接结合到FLM的不同内含子位点从而调节FLM剪接[64]。AtSF1蛋白具有RNA识别基序(RNA recognition motif, RRM)，RRM结构域中的突变可以影响FLM-β可变剪接。在缺失RRM结构域的AtSF1突变体中，FLM-β剪接体水平和SVP表达均显著降低；AtSF1的RRM结构域丢失仅影响特定转录物可变剪接[64]。
除AtSF1之外，拟南芥AtU2AF65a/b因子也参与FLM和MAF的可变剪接[50]。虽然不清楚AtU2AF65b是否在温敏开花调控中发挥直接作用，但是在较低环境温度下，拟南芥AtU2AF65a的转录产物会减少[65]。说明AtU2AF65a能依赖环境温度在FLM和MAF的可变剪接中起一定作用[54, 65]。拟南芥AtU2AF65a可能充当多聚嘧啶串结合蛋白(Polypyrimidine tract binding protein，PTB)，并参与控制FLM可变剪接体的H3K36me3-MRG15-PTB复合物的形成[63]。有趣的是，拟南芥AtU2AF65a能够响应温度变化而剪接成3个不同的亚型，AtU2AF65a的剪接由细胞周期蛋白依赖性激酶G1 (Cyclin-dependent kinase 1，CDKG1) 控制。CDKG1是一种含RS基序的蛋白。在较高的环境温度下发生雄性减数分裂，与剪接因子RSZ33互作进而形成花粉壁，这些环节都需要CDKG1参与[66-67]。在野生型拟南芥中已鉴定出拟南芥AtU2AF65a的3种亚型，即其mRNA1–3。在12 ℃时，该mRNA1丰度最高，而在27 ℃时，该mRNA2和mRNA3的水平会显著增加。拟南芥CDKG1在AtU2AF65a剪接中起作用。在较高温度下，AtU2AF65a的mRNA2和mRNA3含量较高，说明它们可能不会被NMD途径降解。取而代之的是，它们可能被翻译成一些截短蛋白，调节FLM的可变剪接[66-67]。
CDKG1在参与温度相关的调控中自身也能发生可变剪接。例如，在野生型拟南芥中发现了两种长短不同的CDKG1亚型，分别通过保留和去除内含子1形成CDKG1L和CDKG1S变异体[68]。CDKG1S缺少核定位信号和精氨酸/丝氨酸富集Arg/Ser-rich (RS) 域，可位于细胞核和细胞质中；而CDKG1L只定位于细胞核[68]。低温时CDKG1L占主导地位，而高温时CDKG1S会增加[69]。此外，CDKG1的可变剪接受CDKG2和CYCL1 (CYCLINL1) 调节，以便适应环境温度变化。另外，CDKG2是开花负调节因子[70]。CYCL1是CDKG1和CDKG2的同源细胞周期蛋白。在较高温度(27 ℃) 下，cdkg2 cycl1双突变会显著抑制CDKG1S的量[68]。因此，从CDKG2、CYCL1到FLM和MAF可能会出现级联反应，从而响应环境温度的变化并通过可变剪接来调节开花。
综上可知，首先CDKG2和CYCL1会触发CDKG1的可变剪接，产生长异构体CDKG1L和短异构体CDKG1S。在低温下以CDKG1L为主，当温度升高时CDKG1S会增加。然后CDKG1的两个变构体会导致AtU2AF65a可变剪接产生3个变体。AtU2AF65a变体1 (AtU2AF65a.1) 在低温下占主导地位，而AtU2AF65a.2和AtU2AF65a.3在高温下占主导地位。AtU2AF65a.1在具有功能的FLM-β亚型的剪接中起作用。相比之下，AtU2AF65a.2/3可促进非功能性的FLM剪接(这些剪接体通过NMD途径降解)。FLM-β通过与SVP相互作用来抑制FT和SOC1等开花基因的表达，进而延缓低温下的开花进程。由此说明，剪接因子除了调控基因剪接，自身也可发生剪接，不同剪接体的产生也依赖于植物内源和外源的信号。
5 染色质修饰影响开花因子的选择性剪接近年来表观遗传学研究发现，染色质修饰在植物的环境适应中发挥着重要作用，例如组蛋白甲基化修饰[63, 71]。随着温度升高拟南芥中会发生大量的剪接事件[71]。其中我们比较熟知的是受温度影响的开花调节因子FLM，FLM随着温度升高会产生不同剪接体，促进FT转录上调[25, 72]。瓦赫宁根大学分子生物学实验室曾报道，温度升高所诱发的差异剪接基因的H3K36me3会达到很高水平[63]。在较高温度下H3K36me3的富集导致在全基因组水平上的差异剪接，可能是通过“H3K36me3- (Morf related gene，MRG)-聚嘧啶束结合染色质-衔接子”的机制实现[73]。MRG蛋白作为组蛋白读取器，通过与组蛋白H4特异性乙酰转移酶、MYST家族蛋白(MYST family proteins, MYST) 的组蛋白乙酰转移酶HISTONE ACETYLTRANS FERASE OF THE MYST FAMILY 1 (HAM1) 和HAM2的相互作用识别H3K4me3/H3K36me3，从而调节基因表达[74-75]。通过该过程可调节一些开花基因，包括FLM、MAF2、PSEUDO-RESPONSE REGULATOR 3 (PRR3)和PRR7。它们响应于较高温度而出现差异剪接[63]。FLM与MAF2编码开花抑制子[76]，并且在FLM剪接变体中，含有内含子2的变体具有PTC，并且受到无义介导的mRNA衰变(NMD)。因此，该变体不具有抑制开花的功能，它会使开花时间提前[21]。
拟南芥H3K36me3由组蛋白甲基转移酶SET DOMAIN GROUP 8 (SDG8) 和SDG26所介导。在拟南芥SDG缺失突变后，开花基因在环境温度应答下的可变剪接会受到干扰[63]。利用SDG8和SDG26甲基转移酶的缺失突变实验表明：相对于野生型植株而言，当环境温度升高后，这些突变体中的温敏开花基因的可变剪接发生了明显变化；然而在环境温度较低时，彼此之间可变剪接仅有微小差异[63, 77]。由此说明，在温暖条件下H3K36me3增加与相关基因的可变剪接存在某种必然联系。简而言之，H3K36me3参与调控环境温度所诱导的开花基因的选择性剪接，从而影响开花时间。
染色质修饰影响开花因子可变剪接的外在因素并不局限于温度。最近对短柄草中FT同源基因FTL1和FTL2的研究发现，长日照条件也会影响FTL1的可变剪接。短柄草中ES43复合物在早期发育阶段能与H3K4me3结合，通过染色质重塑来抑制FTL1基因座的转录起始和延长效率[78]。剪接的共转录行为意味着染色质环境和RNA聚合酶Ⅱ (RNAPⅡ) 的合成能力对剪接结果有很大影响。在植物中，光周期变换会调节RNAPⅡ延伸率，进而控制剪接，表明可变剪接、转录和植物生长之间具有协调性[79]。简而言之，FTL1的转录效率越低，在早期生长阶段其可变剪接事件发生越频繁。但随着发育的进行，FTL2表达增加，并通过它们的相互作用影响ES43复合物的功能。该相互作用进一步会导致FTL1转录抑制及其剪接减少[79]。
6 总结与展望成花转换是一个非常复杂的过程，许多开花基因响应环境和内源性信号，发生可变剪接，调节成花转变。不同剪接变体及其剪接调控因子对开花调控具有较大差异。例如，拟南芥FLM可变剪接和短柄草FT2选择性剪接分别受发育年龄信号和环境温度影响[14, 23]。此外，光周期途径中CO的两个剪接体COα和COβ的比例在一天中不同时段会发生动态变化[39]；然而自主开花途径中FCA的选择性剪接转录本的比例没有变化[80]。由此说明，植物开花调控中选择性剪接的作用机制和模式具有多样性和差异性，很可能还有更多开花调控因子的选择性剪接需深入研究和探索。
我们最近发现，芥菜AGL18具有可变剪接，产生2个剪接体蛋白(全长AGL18α和移码截短体AGL18β)，它们差异性调节开花时间，但其精细的作用机制仍不清楚[81]，尚待深入研究。另外，虽然FLM-δ的超表达促进了开花，但它与拟南芥中低温春化响应的开花机制并不相同。那么，FLM-δ是否与其他调控因子有相互作用，以及如何作用来促进开花转变呢？其精细的分子机制仍需深入研究。
FT作为开花整合子，可发生可变剪接，例如短柄草中会形成FT2α和FT2β两个剪接体。有趣的是，miR156和miR172也参与了不同植物开花的年龄依赖途径调控，在开花转换过程中可提供发育年龄转变信号。即miRNA介导的目标转录物降解及其翻译抑制被认为是传递发育信号的主要分子机制[82]。miR156-miR172途径在植物中广泛保守。那么，miRNA所介导的发育信号是否与FT2选择性剪接事件相关联呢？它是否会影响剪接变体FT2α和FT2β的表达丰度、蛋白定位及其翻译后修饰？这也值得深入研究。
可变剪接事件受剪接因子对原始转录本的差异调节导致成花转变，这也是近些年的研究热点。在调节FLC可变剪接的相关剪接因子中，每一个剪接因子都扮演着不同角色，可直接或间接作用于开花基因。有趣的是，有些剪接因子不仅起着剪接作用，还具有转录因子功能。例如，充当剪接因子的SKIP直接与SEF的pre-mRNA结合以抑制其不利性剪接。由于SEF激活了FLC转录，因此在skip缺陷型突变体中其转录水平明显较低，这表明剪接因子在开花转变中起着至关重要的作用[56]。参与FLC基因可变剪接调控的剪接因子除了SKIP、U2AF65、BRR2之外，还有其他一些剪接因子有待深入发掘，并且这些剪接因子是如何被招募以及怎样参与其可变剪接的分子机制也不清楚。
剪接因子对可变剪接的调控机制非常复杂而又精细，它们能整合多个生长发育和环境信号，剪接因子的活性受到外在环境因素和内在遗传因素的调节，例如转录和翻译后修饰以及剪接体复合物的形成[83-84]。已知组蛋白甲基化修饰可影响开花相关基因可变剪接，那么除此之外，乙酰化、磷酸化修饰等是否也参与可变剪接的表观调控？这也值得深入研究。随着研究技术的不断发展，转录组数据的进一步获得，同时结合生物信息分析软件工具辅助研究，再就是基本的机理分析，将来有望开发出更精确的可变剪接调控策略，比如可变剪接的动态调控。
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