朱秀红, 程红梅, 季柳洋, 茹广欣, 赵珠琳, 蔡曜琦, 温道远
河南农业大学 林学院，河南 郑州 450002
收稿日期：2020-07-26；接收日期：2020-10-28；网络出版时间：2020-11-18
基金项目：国家林草局生物安全与遗传资源项目(No. KJZXSA2019042)，河南省林木种质资源建设项目(No. 30601998) 资助

摘要：采用水培培养的试验方法，研究白花泡桐幼苗在锌(Zn)、镉(Cd) 单一及复合胁迫下的生理生化响应及对重金属的富集、转移特征变化。结果表明，单一及复合重金属胁迫下，白花泡桐的生物量、株高及过氧化物酶(Peroxidase，POD) 活性均随处理浓度的增加而降低。在复合污染下，Zn、Cd在植株的株高及生物量上表现出拮抗作用。与对照比，单一胁迫下，随着Zn浓度的增加，白花泡桐叶绿素含量和过氧化氢酶(Catalase，CAT) 活性先增加后减小，超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD) 活性升高，地上部丙二醛(Malondialdehyde，MDA) 含量先减小后增加；随着Cd浓度的增加，叶绿素含量和过氧化氢酶(CAT) 活性升高，超氧化物歧化酶(SOD) 活性及地上部丙二醛(MDA) 含量先增加后减小，复合胁迫下，则表现出更加复杂的生理响应。白花泡桐幼苗对Cd的富集部位集中在根部；对Zn的富集部位集中在地上部，且转移系数大于1.00；Zn的加入会促进重金属向地上部分的转移；白花泡桐具有对复合重金属污染地进行有效的生态恢复的潜力。
关键词：白花泡桐幼苗重金属镉锌土壤修复
Physiological and enrichment characteristics of Paulownia fortunei seedlings under zinc, cadmium and their combined stress
Xiuhong Zhu, Hongmei Cheng, Liuyang Ji, Guangxin Ru, Zhulin Zhao, Yaoqi Cai, Daoyuan Wen
College of Forestry, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, Henan, China
Received: July 26, 2020; Accepted: October 28, 2020; Published: November 18, 2020
Supported by: Biosafety and Genetic Resources Project of National Forestry and Grass Administration of China (No. KJZXSA2019042), Forest Germplasm Resources Construction Project of Henan Province, China (No. 30601998)
Corresponding author: Guangxin Ru. Tel: +86-371-63558813; E-mail: ruguangxin@163.com.

Abstract: The hydroponic culture test method was used to study the physiological and biochemical responses of Paulownia fortunei seedlings under Zn stress, Cd stress, and combined Zn and Cd stress as well as changes in the enrichment and transfer characteristics of heavy metals. Under single and combined heavy metal stress, the biomass, plant height, and peroxidase (POD) activity of P. fortunei decreased as the treatment concentration increased. Combined Zn and Cd affected adversely plant height and biomass. As the concentration of Zn increased when applied alone, the chlorophyll content and catalase (CAT) activity of P. fortunei first increased and then decreased, the superoxide dismutase (SOD) activity increased, and the aboveground malondialdehyde (MDA) content first decreased and then increased. As the concentration of Cd increased when applied alone, chlorophyll content and CAT activity increased, and SOD activity and aboveground MDA content first increased and then decreased. Under both Cd and Zn, the physiological response was more complex. Cd in the seedlings of P. fortunei was concentrated in the root. In contrast, Zn was concentrated in the upper part of the ground, and its transfer coefficient was greater than 1.00. Thus, the addition of Zn promotes the transfer of heavy metals to the above-ground portions of plants. Generally, P. fortunei can effectively promote ecological restoration under complex forms of heavy metal pollution.
Keywords: Paulownia fortunei seedlingsheavy metalCdZnsoil remediation
随着工业化的快速发展，重金属污染已经成为全球性环境污染问题，据2014年《全国土壤污染状况调查公报》显示^[1]，全国土壤总的超标率为16.1%，无机污染物超标点位数占全部超标点位的82.8%，其中重金属镉(Cd) 居无机污染物点位超标第一位，高达7%，而锌(Zn) 的点位超标率为0.9%，位于第七。传统的重金属污染土壤治理方法主要以物理和化学方法为主^[2]，而近年来，植物修复作为一种相对新兴的土壤污染治理技术，因其成本低、对环境友好以及可大规模原位修复等优点，在实际中得到了越来越广泛的应用^[3]。
白花泡桐Paulownia fortunei (Seem.) Hemsl. 是玄参科泡桐属植物，是我国常见的速生树种，分布广泛，品质优良，可作为用材树种、园林绿化树种等。目前，大多数****关于白花泡桐的研究主要集中在泡桐花和叶的化学成分分析、木质素结构与木材材性研究以及如何解决泡桐丛枝病^[4-6]等方面，而关于重金属对泡桐的影响以及泡桐对重金属富集能力的研究较少。朱连秋等^[7]的研究表明，木本植物泡桐具有较高的重金属综合富集能力，因此，研究重金属胁迫下白花泡桐的生长及富集特征具有重要的现实意义。
为了研究泡桐在重金属胁迫下的耐性机理及对重金属的富集能力，本试验通过对Ca、Zn单一及复合胁迫处理下白花泡桐的抗氧化防御系统响应、叶绿素含量变化以及其对重金属Cd、Zn的吸收富集等特征进行探讨，以了解白花泡桐在重金属胁迫下的响应机制，揭示其对重金属胁迫的抗性机理，同时对Cd、Zn重金属的富集能力进行量化和科学评价，为利用该树种进行矿区土壤复合污染和城市土壤污染治理提供科学依据。
1 材料与方法1.1 试验设计在2018年3–6月，选取种源为江西省赣江市的白花泡桐幼嫩茎段为外植体材料，进行组培。待幼苗长出4–6对叶时，选择性状一致、生长健壮的白花泡桐组培苗炼苗一周，用蒸馏水将根部的培养基冲洗干净后，移栽至含有l/2 Hong land营养液的塑料水培盒(24 cm×15 cm×7.5 cm)中，用定植板固定，部分根系在营养液面和定植板之间的空隙气生，每盆定植6株，2–3 d后更换Hong land全营养液继续培养，此时即可进行Cd、Zn单一及其复合重金属的胁迫处理，营养液每隔2–3 d更换一次。试验设置9个处理梯度(表 1)，分别为：空白Cd 0 mmol/L+Zn 0 mmol/L(CK)、Cd 0.05 mmol/L (C1)、Cd 0.10 mmol/L(C2)、Zn 8 mmol/L (Z1)、Zn 16 mmol/L (Z2)、Zn 8 mmol/L+Cd 0.05 mmol/L (Z1C1)、Zn 16 mmol/L+Cd 0.05 mmol/L (Z2C1)、Zn 8 mmol/L+Cd 0.10 mmol/L (Z1C2)、Zn 16 mmol/L+ Cd 0.10 mmol/L (Z2C2)，每个梯度6个平行。培养15 d后，毁灭性采收幼苗全株用于生物量的测定。
表 1 试验处理Table 1 Test treatment

表选项


整个试验过程中，温度为(25±2) ℃，光强为1 600–1 800 lx，光照时间为12 h/d，湿度控制在80%以上。采样地点为河南农业大学科技园区泡桐种质资源圃(N34°86′，E113°5′)。供试的重金属以ZnSO₄、CdN₂O₆·4H₂O等重金属盐用去离子水溶解后，以溶液的形态处理，所用试剂均为分析纯(AR) 级。
1.2 生理生化指标测定植株生物量的测定：在处理15 d后取样，用蒸馏水冲洗根部3–5遍，用滤纸将表面的水分吸干后，用皮尺测量株高。将收获好的样品称完鲜重后，将植株分为根、茎、叶3部分，放置在105 ℃烘箱中杀青2 h，在60 ℃下烘干至恒重，称其干质量。
生理指标的测定：混合取样植株新鲜叶片0.1 g，测定各项生理指标。叶绿素含量的测定采用乙醇提取比色法^[8]；丙二醛(MDA) 含量的测定采用硫代巴比妥酸法^[9]；超氧化物歧化酶(SOD) 的测定采用氮蓝四唑法^[10]；过氧化物酶(POD) 的测定采用愈创木酚法^[11]；过氧化氢酶(CAT) 的测定采用双氧水法^[12]。
1.3 白花泡桐幼苗对重金属富集和转运能力的测定将各处理泡桐幼苗根、茎和叶用去离子水冲洗干净后分开，准确称取0.1 g用于测定。植物样品用HNO₃-HClO₄ (4︰1) 湿法消化^[13]，金属元素采用FAAS-M6火焰原子吸收分光光度计测定。
金属离子富集系数(Bioconcentration factors，BCF)的计算：
BCF=收获的植物中重金属含量/溶液中重金属含量。
金属离子转运系数(Translocation factor，TF)的计算。
TF=植物地上部分重金属含量/地下部分重金属含量。
1.4 数据处理重金属处理选择3个生物学重复，每个生物学重复设置3个操作重复。运用EXCEL、SPSS 25.0、ORIGIN 2018软件对数据进行相关分析，数据的差异显著性检验采用LSD检验。
2 结果与分析2.1 Cd、Zn单一及复合胁迫对白花泡桐幼苗生理指标的影响2.1.1 对生物量和苗高的影响单一Cd处理下，生物量和株高显著高于其他处理，且随着Cd浓度的增加，生物量和株高均呈下降趋势。单一Zn胁迫下，生物量和株高均显著低于其他处理，在Zn浓度为16 mmol/L时达到最低，株高为对照组的89.4%，根生物量是对照组的76.4%，叶生物量是对照组的65.5%，表明Zn对植物的毒害作用更强。复合胁迫下，随着Cd的加入，白花泡桐幼苗的株高及生物量，与同水平单一Zn胁迫相比，都有所提高，且均高于对照组，说明低浓度的Cd促进泡桐幼苗的生长(表 2)。
表 2 不同重金属处理对白花泡桐幼苗苗生物量和苗高的影响Table 2 Effects of different heavy metal treatments on the biomass and seedling height of P. fortunei seedlings

表选项


2.1.2 对叶绿素含量的影响叶绿素在植物的光合作用中发挥着重要的作用，叶绿素含量的多少显示出光合作用的强弱，因此以叶绿素的含量来衡量植物的抗逆性^[13]。与对照组相比，重金属Cd单一胁迫下，白花泡桐叶片叶绿素a含量分别高出对照组20.6%、11.8%，叶绿素b含量分别增加了37.5%、35.7%，说明单一Cd处理有利于白花泡桐叶片中叶绿素的合成，而叶绿素a/b先增加后减少，表明随着Cd浓度的增加，叶片衰老加速。重金属Zn单一胁迫下，与CK相比，叶绿素(a+b) 含量呈现先增加后减小的趋势，叶绿素a/b值小于对照组，其中叶绿素a含量变化不明显，叶绿素b含量分别增加了37.5%、0.07%。复合胁迫下，随着处理浓度的增加，叶绿素a、b含量均呈现下降趋势，且均小于对照组，在Cd浓度0.10 mmol/L、Zn浓度为16 mmol/L时含量最小，与对照组相比下降20%，而在Z1C2、Z2C2处理下，叶绿素a/b显著高于对照组，表明在高浓度的Zn、Cd复合胁迫下，植物受到较为严重的外界胁迫，叶绿体结构被破坏，叶绿素含量减少，光合能力减弱(图 1)。


2.1.3 对丙二醛MDA含量的影响MDA是生物体内自由基作用于脂质发生过氧化反应的最终产物，它的含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度，是衡量植物逆境生长的重要指标^[14]。单一Cd胁迫下，白花泡桐体内MDA含量均高于对照组，其中根部MDA含量随着处理浓度的增加呈上升趋势，叶片MDA含量随着处理浓度的增加而下降；单一Zn胁迫下则相反，叶片MDA含量最高值出现在Cd浓度为0.05 mmol/L，比对照组增加了15%，根部MDA含量最高值出现在Cd浓度为0.10 mmol/L时，比对照组增加了7%，说明单一重金属胁迫下，Cd对白花泡桐脂质过氧化损害较大。复合胁迫下，叶片中MDA含量在相同水平Cd处理下，随着Zn浓度的增加而减少；根部MDA含量随着处理浓度的增加呈上升趋势，分别是对照组的1.16倍、1.30倍、1.44倍、1.50倍，说明复合胁迫浓度越高对白花泡桐根部脂质过氧化损害越大(图 2)。


2.1.4 对SOD酶活性的影响与对照组相比，在单一Zn胁迫条件下，白花泡桐体内SOD酶活性随着浓度的增加而增加；单一Cd胁迫下，白花泡桐SOD酶活性随着浓度的增加先升高后降低，仅在单一Cd浓度为0.10 mmol/L时，白花泡桐幼苗根部SOD酶活性最低，是对照组的83.5%，其他处理下的SOD酶活性均高于对照组。在单一Zn浓度为16 mmol/L时，根部SOD酶活性达到最高值454 U/g，比对照组增加了83.06%。复合胁迫下，白花泡桐体内SOD酶活性显著大于CK及同水平单一Cd胁迫下的SOD酶活性，其中叶片的SOD值随着Zn浓度的增加而显著增加，根中则相反，说明Zn的加入促进了白花泡桐体内SOD酶的活性(图 3)。


2.1.5 对POD酶活性的影响单一胁迫下POD活性均随处理浓度的升高而降低，根部Cd、Zn单一胁迫浓度最高时，POD活性分别比对照降低了39.08%、28.57%，地上部Cd、Zn单一胁迫浓度最高时，POD活性分别比对照降低了48.68%、42.11%。复合胁迫时，根和叶POD含量随处理浓度的增加呈下降趋势。重金属处理下，白花泡桐地下部和地上部的POD活性与对照相比均有显著降低，Zn对白花泡桐POD活性的影响最小(图 4)。


2.1.6 对过氧化氢酶(CAT) 活性的影响在Cd浓度为0.10 mmol/L时，地下部和地上部CAT含量均显著高于其他处理。与对照组相比，Cd、Zn单一胁迫均能使白花泡桐CAT活性增强。Cd单一胁迫下，白花泡桐CAT含量随着浓度的升高而增加，浓度最高时，地下部CAT含量最高达到15.17 U/g，地上部达到32.83 U/g，与对照组比分别升高了21.65%、41.27%。Zn单一胁迫下，与CK相比，CAT含量随着处理浓度的增加呈先上升后下降趋势，在Zn浓度为8 mmol/L时达到最大值，此时叶中CAT活性为14.60 U/g、根中为25.43 U/g，分别是对照组的1.17倍和1.09倍。复合胁迫下，白花泡桐CAT含量在C1水平下随着Zn浓度的增加而增加，在C2水平下随着Zn浓度的增加而减小(图 5)。


2.2 白花泡桐幼苗富集和转移重金属能力2.2.1 白花泡桐幼苗各部位对Cd的富集能力单一Cd胁迫下，白花泡桐幼苗体内Cd的含量随着处理浓度的增加而增大，在单一Cd浓度为0.10 mmol/L时，根、茎、叶中的富集量达到最大，分别是低浓度Cd处理的150.3%、114.6%、120.9%。Cd的累积量均表现为根＞叶＞茎，说明地下部分比地上部分具有更强的Cd富集能力。复合胁迫下，根、茎、叶的富集量均显著低于单一Cd处理，在Zn浓度为8 mmol/L、Cd浓度为0.10 mmol/L时，根、茎、叶的Cd含量明显低于其他处理，仅是浓度单一Cd处理下的49.2%、59.6%、65.4%，说明Zn的加入，不利于Cd在白花泡桐体内的富集，二者为拮抗作用。在高浓度的Zn、Cd复合处理时，Cd的富集量显著高于其他复合胁迫，表明高浓度Zn对根、茎、叶Cd的富集的拮抗作用减弱(图 6)。


2.2.2 白花泡桐幼苗各部位对Zn的富集能力单一Zn胁迫下，白花泡桐体内Zn的富集量显著高于其他处理，随着Zn浓度的增加而增加，在Zn浓度为18 mmol/L时达到最大，根、茎、叶中的Zn含量分别高出对照组66.9%、149.0%、284.4%，表明白花泡桐幼苗对Zn的富集量受外界Zn浓度的限制，对Zn的富集主要集中在地上部分。单一Cd处理下，白花泡桐幼苗体内Zn的富集量随Cd处理浓度的增加而减小，在单一Cd浓度为0.10 mmol/L时，根、茎中对Zn的富集量仅是对照的68%、84%。复合处理下，随着Cd的加入，根、茎、叶中Zn的富集量明显低于单因素Zn处理，随着Cd浓度的升高，白花泡桐幼苗体内Zn的富集量升高，说明重金属Cd对Zn在白花泡桐体内的富集主要起拮抗作用，随着Cd浓度的增加，拮抗作用减弱(图 7)。


2.2.3 单一及复合胁迫处理下Cd的富集系数与转运系数富集系数反映植物从土壤中提取重金属的能力。转移系数反映重金属在植物体内的迁移与累计情况，转移系数越大，越有利于重金属在植物地上部分累积。单一Cd胁迫下，根、茎、叶中Cd的转运和富集系数均随处理浓度的增加而减小，在Cd浓度为0.10 mmol/L时，富集系数达到最小，分别是低浓度单一Cd处理的81.3%、57.7%、61.4%，说明随着Cd浓度的增加，白花泡桐幼苗对Cd的转运及富集能力减弱。复合胁迫中，转运系数均高于单一Cd胁迫，说明随着Zn离子的加入，有利于增强Cd从白花泡桐根部向上迁移到茎叶的能力；在同水平Cd处理下，随着Zn的加入，白花泡桐幼苗对Cd的富集系数均小于单一处理，说明Zn抑制了Cd在白花泡桐体内的富集(表 3)。
表 3 重金属处理下Cd在白花泡桐体内的转运和富集Table 3 Cd transport and enrichment in Paulownia fortune under heavy metal treatment

表选项


2.2.4 单一及复合胁迫处理下Zn的富集系数与转运系数单一Cd胁迫下，根、茎、叶中Zn的富集系数随着Cd处理浓度的增加而减小，随着Zn处理浓度的增加而增大。复合胁迫下，白花泡桐幼苗体内Zn的富集系数及转运系数均小于同水平单一Zn胁迫，但随着Cd浓度的增加，富集系数及转运系数呈上升趋势，说明重金属Cd抑制Zn在植物体内的富集，表现为拮抗作用，但随着Cd浓度的增加，Zn在植物根、茎、叶中的富集量增加，拮抗作用减弱。单一胁迫下，转运系数随着Cd浓度的增加而增加，随着Zn浓度的增加而减小，在Zn浓度为8 mmol/L时，达到最大值，高出对照130.53%，此时幼苗对Zn的富集主要集中在地上部分。复合胁迫下，转运系数值均低于单一Zn胁迫，随着Zn浓度的增加，转运系数也增加，说明随着Zn的加入，促进了其从根部向上迁移到茎叶的能力(表 4)。
表 4 重金属处理下Zn在白花泡桐体内的转运和富集Table 4 Zn transport and enrichment in P. fortunei under heavy metal treatment

表选项


3 讨论3.1 Cd、Zn单一及复合胁迫处理对白花泡桐幼苗抗性生理的影响重金属对植物的毒害作用通常表现为抑制植物幼苗的生长和促使植物坏死^[15]。本研究表明，单一胁迫下，Cd胁迫对白花泡桐幼苗的生物量和株高起促进作用，Zn胁迫则抑制了幼苗的株高及生物量；复合胁迫下，加入Cd则会缓解单一Zn对株高及生物量的抑制，Zn、Cd表现为拮抗作用，与多数****认为低剂量下可刺激植物生长，低浓度范围内植物体内活性氧自由基含量升高，可激活蛋白酶，调节合成以及诱导基因表达，进而促进细胞分裂和增殖，宏观表现为刺激生长的结论相同^[16-20]。
单一Cd胁迫促进白花泡桐叶绿素的合成，促进其光合作用，产生相应的解毒物质缓解重金属的毒害，与王泽港等^[21]对重金属对水稻光合作用的影响的结果类似；高浓度和复合胁迫下，抑制叶绿素的合成，与孙晓灿等^[22]的研究结果相似。复合胁迫下，Zn的加入抑制了Cd对叶绿素合成的促进作用，Zn、Cd表现为拮抗。
单一Cd胁迫下，白花泡桐MDA含量均高于CK，单一Zn胁迫下，白花泡桐幼苗的MDA含量均小于CK，表明白花泡桐幼苗对重金属Cd的抗性较弱，对重金属Zn有较强的抗性。复合胁迫下，叶片中MDA含量随Zn浓度的增加而降低，表明Zn的加入会缓解Cd造成的膜质过氧化伤害，与叶片中的Cd起拮抗作用；根部的MDA含量随着处理浓度的升高而升高，表明Zn、Cd在根部的毒害表现为协同作用。
SOD、POD、CAT这3种抗氧化酶在植物抗氧化系统中清除植物在重金属胁迫下产生的氧自由基，这3种酶活性的高低决定植物对重金属的耐受程度^[23]。白花泡桐幼苗SOD酶活性在单一Cd胁迫下随着浓度升高而降低，在单一Zn胁迫及复合胁迫下则相反，表现出更高水平的活性氧自由基清除能力，表明Zn的加入促进了SOD酶活性。在重金属处理下，白花泡桐POD酶活性均呈下降趋势，这与万子栋等^[24]研究的单一胁迫下碱蓬芽期POD活性呈上升趋势结果不同，可能是重金属胁迫下，重金属离子通过与白花泡桐体内核酸结合，影响POD转录和翻译过程。单一Cd处理下，CAT活性呈上升趋势，且在高浓度Cd处理下CAT活性达到最高；单一Zn处理下则相反；复合胁迫下，白花泡桐CAT含量随着浓度的增加呈先上升后下降的趋势，表现为低促高抑。
3.2 Cd、Zn单一及复合胁迫处理下幼苗对重金属的转移和富集能力试验结果显示，单一胁迫下，Zn、Cd的富集量受外界环境的限制，复合胁迫下则表现为拮抗作用。重金属处理下对Zn的转运系数大于1.00，表明白花泡桐幼苗主要累积Zn的部位为地上部，这与朱连秋等^[7]的研究结果一致。白花泡桐幼苗对Cd的富集能力为根 > 叶 > 茎，对Zn的富集能力为叶 > 茎 > 根，表明白花泡桐对Cd的富集部位主要集中在根部，对Zn的富集部位主要集中在地上部，这与冯莲莲等^[25]和娄腾雪等^[26]发现Cd的富集部位主要在根部的研究结论相同。由试验结果可知，Zn的加入可以促进Cd向地上部分转移，因此在利用泡桐进行污染土地修复时，可适量加入Zn肥，便于最终回收处理重金属。
综上所述，白花泡桐幼苗在低浓度的Cd下表现为促进生长，高浓度下抑制生长；单一胁迫下，对Zn、Cd的富集量受外界环境的限制，且对Zn的转移系数大于1.00；在Cd胁迫下加入Zn，能促进Cd向地上部分的转移，便于回收处理重金属，因其生物量较一般的草本超富集植物巨大，具有速生、轮伐期短、生物量大、生长速度快等特点，因此，也不失为植物修复的良好选择。利用白花泡桐这种高生物量经济植物修复重金属污染的土壤，能够兼顾生态和经济效益，具有很大的应用前景。
参考文献