王禹焜^1,2, 张斯童^1,2, 陈光^1,2
1. 吉林农业大学 秸秆生物学与利用教育部重点实验室，吉林 长春 130118;
2. 吉林农业大学 生命科学学院，吉林 长春 130118
收稿日期：2020-03-09；接收日期：2020-05-18；网络出版时间：2020-10-15
基金项目：国家重点研发计划(No. 2017YFD0501000)，吉林省教育厅重点课题(No. JJKH20180688KJ)资助

摘要：内切葡聚糖酶(EG)是纤维素酶的重要组分，在纤维素降解酶系中发辉重要作用。由于天然微生物来源的内切葡聚糖酶产量低，极大地制约了其生产和应用，所以对内切葡聚糖酶进行高效异源表达是解决这一问题的有效途径。为了获得高效内切葡聚糖酶酿酒酵母工程菌，本研究从纤维梭菌中克隆了内切葡聚糖酶(EG)基因，全长1 996 bp，编码440个氨基酸，并与来源于酿酒酵母的PGK启动子序列、来源于pPIC9K质粒的α-信号肽序列以及来源于pSH65质粒的CYC1终止子序列通过重叠延伸PCR法构建完整表达盒(PαEGC)，通过整合rDNA的方法构建内切葡聚糖酶酿酒酵母的表达载体，在酿酒酵母中进行内切葡聚糖酶的随机多拷贝表达。利用微滴数字PCR鉴定内切葡聚糖酶拷贝数，并探索拷贝数与蛋白表达量之间的关系。通过rDNA整合法获得了拷贝数为1、3、4、7、9、11、15、16、19、21、22、23的内切葡聚糖酶酿酒酵母工程菌，结果表明当拷贝数为15时，酶活性最高，为351 U/mL。本研究成功构建了内切葡聚糖酶酿酒酵母工程菌，为其他工业酶异源高效表达提供参考和借鉴。
关键词：酿酒酵母内切葡聚糖酶rDNA整合法微滴数字PCR技术
Construction of an engineered Saccharomyces cerevisiae expressing endoglucanase efficiently
Yukun Wang^1,2, Sitong Zhang^1,2, Guang Chen^1,2
1. Key Laboratory of Straw Biology and Utilization, Ministry of Education, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, Jilin, China;
2. College of Life Sciences, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, Jilin, China
Received: March 9, 2020; Accepted: May 18, 2020; Published: October 15, 2020
Supported by: National Key Research and Development Program Projects (No. 2017YFD0501000), Key Issues of Jilin Provincial Education Department (No. JJKH20180688KJ)
Corresponding author: Sitong Zhang. Tel/Fax: +86-431-84333712; E-mail: 18943132269@163.com;
Guang Chen. Tel: +86-431-84333713; Fax: +86-431-84333712; E-mail: chg61@163.comm.

Abstract: Endoglucanase (EG) is an important component of cellulases and play an important role in cellulose degradation. However, its application is limited due to the low yield of endoglucanase from natural microorganisms. Efficient heterologous expression of endoglucanase is an effective way to solve this problem. To obtain the engineered Saccharomyces cerevisiae for high-yield endoglucanase, endoglucanase gene was cloned from Clostridium cellulovorans, with a total length of 1 996 bp, encoding 440 amino acids, and the complete expression cassette (PαEGC) was constructed with the PGK promoter sequence from Saccharomyces cerevisiae, α-signal peptide sequence from pPIC9K plasmid and CYC1 terminator sequence from pSH65 plasmid by gene splicing by overlap extension PCR (SOE PCR), and the expression vector of endoglucanase in Saccharomyces cerevisiae was constructed by rDNA integration. The relationship between copy number and protein expression was explored. Random multicopy expression of endoglucanase was performed in Saccharomyces cerevisiae. The copy number of endoglucanase was identified by Droplet Digital PCR and explore the relationship between copy number and protein expression.The engineered Saccharomyces cerevisiae of endoglucanase with copy numbers of 1, 3, 4, 7, 9, 11, 15, 16, 19, 21, 22 and 23 were obtained by rDNA integration, respectively. The results showed that when the copy number was 15, the enzyme activity was the highest, namely 351 U/mL. The engineered strain of Saccharomyces cerevisiae for endoglucanase was successfully constructed, which can provide reference for the heterologous expression of other industrial enzymes.
Keywords: Saccharomyces cerevisiaeendoglucanaserDNA integration methoddroplet digital PCR technology
纤维素是地球上储量最丰富的可再生资源，近年来，随着能源问题愈发严峻，纤维素资源的开发与利用已经成为研究的热点^[1]。降解和利用纤维素的方法有很多，一般采用物理、化学、生物法，物理和化学降解法一般存在成本高、危险性高、环境污染严重等问题，生物降解法因其作用条件温和、环境友好而备受青睐^[2]。纤维素酶可以有效降解纤维素生成葡萄糖，Novozymes、Genencor等国际酶制剂巨头控制了纤维素酶、木聚糖酶等木质纤维类物质转化酶的生产和供应，高昂的酶制剂成本严重阻碍了我国纤维素类资源综合利用。因此，研究开发具有自主知识产权的高产纤维素酶菌株迫在眉睫。纤维素酶中的内切葡聚糖酶(Endo-1, 4-β-D-glucanohydrolase，EC 3.2.1.4，简称EG)能够水解糖苷键、打破纤维素链，在纤维素降解酶系中发挥重要作用^[3]。但由于天然微生物产的内切葡聚糖酶通常产量较低，纯化困难，严重限制了其生产与应用。通过异源表达的方式提高内切葡聚糖酶的表达成为研究人员关注的热点，虽然实现了在原核和真核系统中的表达，但表达量大多不高，无法实现内切葡聚糖酶的工业化生产^[4-5]。因此，选择合适的宿主并采取多种手段相结合的方式构建高效内切葡聚糖酶工程菌的探索显得尤为重要。
酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae是典型的真核生物单细胞模型和重要的模式生物，属于酵母菌科，其具有生长繁殖快、代谢周期短、易于分离培养、遗传背景清晰等特性，得到研究者的青睐，目前已有多种外源蛋白以其作为宿主实现异源表达^[6-7]。酿酒酵母基因组中，有100-200个序列长度为9.1 kb的重复单元，大约占基因组全长的60%，存在于第ⅩⅡ条染色体上，被称为核糖体DNA (ribosomal DNA，rDNA)^[8]。研究表明，酵母基因组中rDNA的拷贝数明显高于其他位点，是介导外源基因同源重组的位点之一，将rDNA介导的外源基因整合至酿酒酵母中可使外源基因得到高效表达^[9]。孙恒一等利用rDNA整合法实现降钙素(Calcitonin，CT)在酿酒酵母中的稳定高效表达，经ELISA检测其表达量占酵母总蛋白的2.05%^[10]；赵文萱等利用rDNA整合法成功实现β-葡萄糖苷酶在酿酒酵母中的多拷贝表达，酶活力是单拷贝时的3.04倍^[11]。
微滴数字PCR (Droplet digital PCR，ddPCR)采用泊松分布原理，通过大量单个反应室的单分子DNA进行PCR扩增，最终将正信号转换为绝对定量的技术。通过检测终端收集每个反应单元的荧光信号，直接计数样品的原始含量或通过泊松分布原理计数，以实现样品的绝对定量^[12-15]。
本研究中，为了构建高效内切葡聚糖酶酿酒酵母工程菌，利用重叠延伸PCR技术将组成型启动子PGK、分泌信号肽α-factor、来源于纤维素梭菌Clostridium cellulovorans的内切葡聚糖酶基因(EG)和终止子CYC1组合在表达盒(PαEGC)中，通过rDNA整合法实现内切葡聚糖酶基因(EG)在酿酒酵母中的多拷贝表达，希望通过启动子、分泌信号肽的引入及基因剂量的提高以实现内切葡聚糖酶在酿酒酵母中的高效表达。应用ddPCR技术对重组内切葡聚糖酶的工程菌拷贝数进行鉴定，结合对重组工程菌内切葡聚糖酶酶活力的考察，研究内切葡聚糖酶基因拷贝数与酶活力之间的关系，并对酶活力最高的转化子遗传稳定性进行研究。
1 材料与方法1.1 材料与试剂本研究用到的菌种和质粒如表 1所示。
表 1 本研究所用菌株和质粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

Strains and plasmids	Features	Source
E. coli DH5α	Host of gene cloning	TaKaRa, Japan
Clostridium cellulovorans	Used to clone EG gene	China Industrial Microbial Species Preservation Center
S. cerevisiae INVSc1	Expression host of MATa, his3, leu2, trp, ura3	Invitrogen, American
pYES2	Expression host of ura3 Saccharomyces cerevisiae	Invitrogen, American
pPIC9K	Applied to amplify signal peptide α-factor sequence	China Plasmid Strain Preservation Center(NTCC)
pMD19-T	Gene cloning vector	TaKaRa, Japan
pSH65	Used to amplify terminator CYC1	China Plasmid Strain Preservation Center(NTCC)
pYES2-PαEGC	Constitutive single copy expression of endoglucanase vector	This study
pYES2-PαEGC-rDNA	Constitutive multi copy expression of endoglucanase vector	This study

表选项


去磷酸化试剂盒、反转录试剂盒、限制性内切酶、SD-Ura培养基，购自日本TaKaRa公司；质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；Salmon Sperm DNA购自上海源叶生物科技有限公司；Droplet reader oil、ddPCR Eva Green Supermix购自美国BIO-RAD公司；酵母基因组提取试剂盒购自美国OMEGA公司；总RNA提取试剂盒购自美国AXYGEN公司；其他试剂均为国产分析纯。
PDA固体培养基(g/L)：葡萄糖20，MgSO₄·7H₂O 1.5，KH₂PO₄ 1，琼脂粉20，马铃薯200，蒸馏水定容，自然pH。
YPD液体培养基(g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖10，蒸馏水定容，自然pH。
YPD固体培养基(g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖10，琼脂糖20，蒸馏水定容，自然pH。
LB液体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，蒸馏水定容，自然pH。
LB固体培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，琼脂糖20，蒸馏水定容，自然pH。
纤维素梭菌发酵培养基(g/L)：马铃薯200，葡萄糖2.4，蛋白胨10，KH₂PO₄ 1.5，MgSO₄·7H₂O 1.5，CaCl₂·2H₂O 0.1，吐温-80 1，蒸馏水定容，自然pH。
1.2 引物本文所用引物如表 2所示，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表 2 本研究所用引物Table 2 Primers used in this study

Primer	Sequence (5′-3′)
EG-F	ATCATACATTATTAAAATCAACTAG
EG-R	ACATTATTAGAACTTATATTAACTC
PGK-F	CCGGAATTCAGCTTTCTAACTGATCTATCCAAAAC
PGK-R	GCTGCCTTGATCTGAACCATTGTTTTATATTTGTTGTAAAAAGTAGA
α-factor-F	TCTACTTTTTACAACAAATATAAAACAATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGC
α-factor-R	TGTCGATGCTCACTGAAGCCTGTCTTTTCTCGAGAGATACCCCTT
CYC1-F	ACACTGCTATCGCAAATGCTCTCTAGGTCATGTAATTAGTTATGTCACGC
CYC1-R	TGCTCTAGACGGCCGCAAATTAAAGCCTT
rDNA-F	CCTACGTACAACGAACGAGACCTTAACCT
rDNA-R	GGTACGTACGGAACCTCTAATCATTCGCT
Note: italic letters indicate restriction enzyme sites.

表选项


1.3 方法1.3.1 PGK启动子序列克隆用YPD固体培养基将酿酒酵母INVSc1菌株活化后，挑取单菌落接种到YPD液体培养基培养48 h后提取菌体，用OMEGA酵母基因组提取试剂盒，提取酿酒酵母的基因组^[16]。以提取后的酿酒酵母基因组作为模板，PGK-F、PGK-R为引物扩增PGK启动子序列，采用琼脂糖凝胶电泳进行验证并对目的条带进行回收^[17]。扩增条件如下：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃后延伸7 min。
1.3.2 α-factor序列克隆使用LB固体培养基将携带有pPIC9K质粒的大肠杆菌DH5α活化，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，12 h后用质粒抽提试剂盒提取pPIC9K质粒，以质粒为模板，α-F、α-R为引物扩增α-factor序列，采用琼脂糖凝胶电泳进行验证并对目的条带进行回收^[17]。扩增条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，30个循环；72 ℃延伸30 s；72 ℃后延伸7 min。
1.3.3 内切葡聚糖酶基因克隆将纤维梭菌菌种经PDA平板划线活化后，挑取单菌落接种到发酵培养基中，在30 ℃、150 r/min条件下培养72 h后，按照AXYGEN总RNA提取试剂盒的方法提取纤维梭菌菌种的总RNA。以纤维梭菌菌种提取的总RNA作为模板，按照TaKaRa反转录试剂盒合成cDNA，再以cDNA作为模板，EG-F、EG-R为引物扩增EG基因，采用琼脂糖凝胶电泳进行验证并对目的条带进行回收^[17]。扩增条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，30个循环；72 ℃延伸2 min，72 ℃后延伸7 min。
1.3.4 CYC1终止子序列克隆将含有pSH65质粒的大肠杆菌经LB平板活化后，挑取单菌落接种至LB液体培养基，12 h后按照质粒提取试剂盒的方法提取pSH65质粒。以pSH65质粒为模板，CYC1-F、CYC1-R为引物扩增CYC1序列，采用琼脂糖凝胶电泳进行验证并对目的条带进行回收^[17]。扩增条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，30个循环；72 ℃延伸30 s，72 ℃后延伸7 min。
1.3.5 克隆载体的连接、转化、鉴定将1.3.1-1.3.4中的回收产物分别与pMD19-T载体进行连接^[18]，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，接种至含有Amp的LB抗性固体培养基上进行筛选。12 h后，选择单克隆用于菌落PCR鉴定，收集阳性克隆并在含Amp抗性的LB液体培养基，于37 ℃和150 r/min培养^[17]。12 h后通过离心收集菌体，并提取质粒送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序。
1.3.6 重叠延伸PCR构建PαEGC完整表达盒确定1.3.1-1.3.4回收的PGK、α-factor、EG及CYC1的片段准确无误后，等比例混合后进行片段融合预实验^[19]，最终确定最佳融合条件：59 ℃退火，延伸60 s，35个循环数，各个片段稀释8倍后使用^[17]，融合条件如下：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，35个循环；72 ℃延伸1 min；72 ℃后延伸7 min。
用融合实验的产物为模板，以PGK-F和CYC1-R为引物，扩增PGK、α-factor、EG及CYC1全长的融合片段，称为PGK-α-factor-EG-CYC1 (PαEGC)表达盒，采用琼脂糖凝胶电泳进行验证并对目的条带进行回收，将回收产物连接pMD19-T载体，命名为pMD19-T-PαEGC，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后，经菌液PCR检测，提取质粒并送至苏州金唯智生物科技有限公司测序^[17]。扩增条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，30个循环；72 ℃延伸3 min 30 s，72 ℃后延伸7 min。
1.3.7 rDNA序列扩增以1.3.1中提取的酿酒酵母基因组为模板，以rDNA-F、rDNA-R为引物扩增rDNA单元中的核心元件序列，将回收产物与pMD19-T载体连接，命名为pMD19-T-rDNA，转化到大肠杆菌DH5α中，并接种在含有Amp抗性的LB平板上进行筛选。12 h后选择单个菌落进行菌落PCR鉴定，选择阳性克隆在含有Amp抗性的LB液体培养基中，37 ℃、150 r/min下培养12 h后离心收集菌体，提取质粒并送至苏州金唯智生物科技有限公司测序^[17]。扩增条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，30个循环；72 ℃延伸2 min 30 s，72 ℃后延伸7 min。
1.3.8 pYES2-PαEGC载体的构建在上述构建PαEGC完整表达盒时，在上下游引物中引入了EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点，用EcoRⅠ和XbaⅠ分别对pYES2载体和PMD19-T- PαEGC质粒进行双酶切，酶切后回收目的条带，经T4 DNA连接酶于16 ℃过夜连接，连接体系全量转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经菌液PCR检测，将阳性转化子接种于含Amp的LB液体培养基中，摇瓶过夜，提取质粒，送至苏州金唯智生物科技有限公司测序^[17]。
1.3.9 pYES2-PαEGC-rDNA载体的构建克隆rDNA片段时上下游引物引入了SnaBⅠ酶切位点，分别对载体pYES2-PαEGC和PMD19- T-rDNA用SnaBⅠ进行单酶切，对回收的pYES2- PαEGC片段去磷酸化后，经T4 DNA连接酶于16 ℃过夜后连接，连接体系全部用于转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经过菌液PCR后，将阳性转化子接种在含有Amp抗性的LB液体培养基中，摇床过夜，提取质粒后酶切鉴定，命名为pYES2-PαEGC-rDNA^[17]。
1.3.10 线性化pYES2-PαEGC-rDNA载体转化酿酒酵母用SphⅠ在rDNA上对pYES2-PαEGC-rDNA进行酶切，使质粒线性化后，经琼脂糖凝胶回收后，用LiAc/SS carrier DNA/PEG法转化酿酒酵母S. cerevisiae 50 μL、50% PEG3350 240 μL、1 mol/L LiAc 36 μL、2 mg/mL boiled carrier DNA 50 μL、Plasmid DNA 34 μL。42 ℃孵育30 min后，将细胞重悬于1 mL YPD液体培养基中，30 ℃、150 r/min培养1 h，收集菌体，用100 μL ddH₂O重悬菌体后，将它涂布在SD-U平板上，30 ℃培养箱培养直至出现单菌落^[17]。对所挑取的单菌落进行内切葡聚糖酶基因的菌液PCR验证。
1.3.11 数字PCR鉴定阳性转化子的拷贝数引物及探针：将得到的阳性转化子接种于YPD培养基中，30 ℃、150 r/min培养48 h，收集菌体用OMEGA公司的酵母基因组提取试剂盒提取各转化子基因组DNA。以基因组DNA为模板，ACT1基因为内参基因，利用BIO-RAD QX200微滴数字PCR仪对EG基因拷贝数进行鉴定^[22-23]。内参基因荧光标记基团为HEX，目的基因荧光标记基团为FAM。引物探针序列如表 3所示。
表 3 探针及引物序列Table 3 Probes and primer sequences

Primer probe		Sequence (5′-3′)
ACT1	Upperreaches	TATCCCCTGCATCCCTATCA
	downstream	CAGGCTTCGTTGCAGATACA
	probe	CATCTTCGTTAGCTTCATCCGACGCTA
EG	Upperreaches	GCTAAAATCACAAAAGTATGGACACAA
	downstream	TAGGAGCCACCAGACCATTCA
	probe	AATGAACCTCGTCCAGTAGGCGCAGC

表选项


微滴数字PCR反应包括4个步骤：配制PCR反应体系、微滴生成、扩增循环和信号读取^[24]。ddPCR体系为20 μL, 包括10 μL 2×ddPCR Master Mix，10 μmol/L内参基因的上游和下游引物各1.8 μL，探针各0.5 μL，基因组模板2 μL。微滴的产生需要专用的微滴产生卡和微滴生成仪。将20 μL PCR体系加入微滴生成卡中，并加入专用的微滴生成油后覆盖专用胶垫置入微滴生成仪，启动程序，生成微滴^[17]。微滴数字PCR扩增条件为：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火60 s，45个循环。扩增结束后进行98 ℃、10 min的热失活。每个模板重复3个平行检测。扩增完成后，将孔板放置在液滴读取器上读取荧光信号，使用Quanta Soft V1.3.2软件分析实验数据，获得绝对定量结果^[25-26]。
1.3.12 内切葡聚糖酶酿酒酵母工程菌发酵液蛋白制备发酵液蛋白制备步骤如下：(1)将野生型酿酒酵母1拷贝、6拷贝、15拷贝和21拷贝的内切葡聚糖酶酿酒酵母工程菌接种于YPD培养基，30 ℃、150 r/min培养72 h后，取5 mL菌液8 000×g离心5 min，收集上清。(2)在上清液中依次加入20 mL甲醇、5 mL CHCl₃和15 mL ddH₂O，漩涡振荡30 s，于冰上静置30 min。(3) 4 ℃、10 000×g离心15 min，这时液体出现分层。(4)用移液器轻轻移去上层甲醇和下层CHCl₃，中间为蛋白沉淀。(5)残留的蛋白沉淀经4 ℃、12 000×g离心5 min后去除液体，得到发酵液蛋白。
1.3.13 SDS-PAGE检测按照1︰1的比例在蛋白提取物中加入上样缓冲液，煮沸10 min后，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，取10 μL用于SDS-PAGE。
1.3.14 转化子产酶能力测定将在1.3.11微滴数字PCR中鉴定出的不同拷贝数的阳性转化子分别接种到YPD培养基中，在30 ℃、150 r/min条件下培养48 h后，取上清，测定内切葡聚糖酶的酶活性。内切葡聚糖酶酶活力具体测定方法参考文献[27]。
酶活力单位定义：1 mL酶液1 min分解底物生成1 μg葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位(U)。
酶活力(U/mL)=(N×D×1 000)/(M×T×V)。
式中，N为还原糖浓度；D为酶液的稀释倍数；M为葡萄糖分子量；T为水解反应时间；V为酶液体积；1 000为将葡萄糖由mg换算为μg的换算。
1.3.15 转化子产酶稳定性实验将在1.3.14中获得的具有最高酶活力的阳性转化子接种于YPD液体培养基中，并连续通过10次传代。每次传代后，取1 mL酶液用于测内切葡聚糖酶的酶活力。
2 结果与分析2.1 PGK启动子序列、α-factor序列克隆、EG基因序列、CYC1终止子序列克隆及PαEGC表达盒构建以提取的酿酒酵母基因组DNA为模板，PGK-F、PGK-R为引物扩增，得到预期大小的目的片段，大小为850 bp (GenBank登录号：AH001380)。以pPIC9K质粒为模板，α-F、α-R为引物扩增，得到预期大小的目的片段，大小为254 bp (GenBank登录号：KM032189)。以提取的纤维梭菌总RNA为模板，一步法反转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板，以EG-F、EG-R为引物扩增得到EG目的片段，大小为1 996 bp (GenBank登录号：M75706.1)。以pYES2质粒为模板，CYC1-F、CYC1-R为引物扩增，得到预期大小的目的片段，大小为260 bp (GenBank登录号：AF298780.1)。扩增产物大小均与预期相符。将上述基因片段均连接至pMD19-T载体，以转化感受态大肠杆菌DH5α，经菌液PCR验证后提取质粒进行测序，将测序结果与GenBank对比，相似度100%，表明序列扩增成功。
在进行PGK、α-factor、EG和CYC1序列扩增时，设计的引物是重叠延伸PCR的引物，每个序列下游均带有与下一序列的融合位点，利用重叠延伸PCR技术将组成型启动子PGK、分泌信号肽α-factor、EG基因、终止子CYC1片段融合构建PαEGC表达盒，得到预期大小的目的片段，大小为3 360 bp (图 1)。

图 1 PGK启动子、α-factor信号肽、EG基因、CYC1终止子及PαEGC表达盒PCR扩增 Fig. 1 Amplification of PGK promoter, α-factor signal peptide, EG gene, CYC1 terminator sequence and PαEGC expression cassette construction. M: DL5000 marker; lanes 1, 2, 3, and 4 are PCR amplified products of the PGK promoter, α-factor signal peptide, EG gene, and terminator CYC1 fragment; lane 5 is the PCR amplification of the PαEGC expression cassette.

图选项

2.2 表达载体pYES2-PαEGC的构建用EcoRⅠ和XbaⅠ分别对pYES2载体和pMD19-T-PαEGC质粒进行双酶切，回收目的片段后，T4 DNA连接酶16 ℃过夜连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经EG基因菌液PCR鉴定得到质粒pYES2-PαEGC，结果如图 2所示。图中第三泳道即为pYES2-PαEGC质粒单酶切后的电泳结果，大小约为9 220 bp。

图 2 质粒pYES2-PαEGC的构建 Fig. 2 Construction of plasmid pYES2-PαEGC. M: DL15000 marker; lane 1 is 5 864 bp pYES2 expression vector; lane 2 is PCR amplification of PαEGC expression cassette; lane 3 is pYES2-PαEGC vector.

图选项

2.3 表达载体pYES2-PαEGC-rDNA的构建将酿酒酵母提取的基因组DNA为模板，使用特异性引物rDNA-F和rDNA-R扩增预期大小为2 300 bp的目的片段(GenBank登录号：BK006945.2)。将rDNA基因片段与pMD19-T载体连接，并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在菌液PCR验证后提取质粒并测序。将测序结果与GenBank进行对比，相似度为100%。用SnaBⅠ分别酶切质粒pYES2-PαEGC和质粒pMD19-T-rDNA，回收目的片段后，用T4 DNA连接酶在16 ℃连接过夜，并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，菌液PCR验证后提取质粒进行酶切和验证，结果如图 3所示，rDNA片段大小为2 300 bp；pYES2-PαEGC载体大小为9 224 bp；pYES2-PαEGC-rDNA载体大小为11 524 bp。

图 3 质粒pYES2- PαEGC-rDNA的构建 Fig. 3 Construction of plasmid pYES2-PαEGC-rDNA. M: DL15000 marker; lane 1 is the PCR amplification product of rDNA; lane 2 is the pYES2- PαEGC vector; lane 3 is the pYES2-PαEGC-rDNA vector.

图选项

2.4 ddPCR检测转化子拷贝数使用SphⅠ在rDNA位置对pYES2-PαEGC- rDNA线性化后，转化酿酒酵母INVSc1，对经SD-U培养基筛选得到的转化子提取基因组后，使用ddPCR检测转化子拷贝数。图 4显示仪器在两个检测通道下，检测到的阴性和阳性微滴数的分布，图中阴性和阳性微滴数的分布清晰可辨，仪器可以准确判断阴性和阳性微滴的数量^[28]。

图 4 ddPCR鉴定转化子拷贝数 Fig. 4 Detection of copy number of transformants by ddPCR. The upper graph shows the number of positive and negative droplets under the FAM channel, the lower graph shows the number of positive and negative droplets under the HEX channel.

图选项

数字微滴PCR扩增每个样品中数万个微滴，并总结HEX和FAM荧光信号的结果。在比较目的基因和内参基因的荧光信号强度后，获得目的基因EG的拷贝数。即利用rDNA整合法，共得到12种不同拷贝数内切葡聚糖酶酿酒酵母工程菌，其拷贝数分别为：1、3、4、7、9、11、15、16、19、21、22、23 (图 5)。

图 5 ddPCR测定转化子拷贝数结果 Fig. 5 Identification of the copy number of converters by digital microdrop polymerase chain reaction.

图选项

2.5 内切葡聚糖酶SDS-PAGE分析将野生型酿酒酵母、1拷贝、6拷贝、15拷贝和21拷贝的内切葡聚糖酶酿酒酵母工程菌分别接种于YPD培养基中，培养72 h后，提取酿酒酵母发酵液总蛋白，并进行SDS-PAGE分析。如图 6所示，在48 kDa处呈现出特异条带，与蛋白理论预测值相符。

图 6 不同拷贝数转化子发酵液SDS-PAGE分析 Fig. 6 SDS-PAGE analysis of fermentation broth of transformants with different copy numbers.

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2.6 不同拷贝数转化子中的内切葡聚糖酶活力分析通过摇瓶发酵培养，对12株不同拷贝数的转化子菌株，每12 h用DNS法测定内切葡聚糖酶活力，如图 7所示，12株不同拷贝数转化子内切葡聚糖酶活力，当拷贝数小于15时，内切葡聚糖酶活力随拷贝数增加而增加，15拷贝时内切葡聚糖酶活力最高为351 U/mL，是单拷贝时内切葡聚糖酶活力的1.47倍；超过15拷贝后，内切葡聚糖酶活力下降，到23拷贝时，酶活力仅为15拷贝时的62%。酶活力随着拷贝数增加呈现先增加后降低的趋势，并不与拷贝数呈线性关系。

图 7 拷贝数与酶活力的关系 Fig. 7 The relationship between copy number and enzyme activity.

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2.7 转化子产酶稳定性实验对获得的酶活力最高的15拷贝转化子，进行遗传稳定性实验，结果如图 8所示，用rDNA整合法获得的内切葡聚糖酶转化子产酶稳定性良好，经过10次传代后，酶活力几乎没有变化，仍能保持稳定遗传。

图 8 传代稳定性验证 Fig. 8 Progeny stability verification.

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3 讨论启动子改造、分泌信号肽的引入以及目的基因多拷贝是提高外源蛋白表达水平的主要策略^[29-30]。
启动子是表达载体的一个重要元件，它是影响mRNA分子合成速率的主要因素之一，一个强的启动子能有利于载体表达更高水平的外源蛋白^[31-32]。Julia等^[33]通过将组成型PGK启动子在毕赤酵母异源表达重组脂肪酶实现了在工业上对饲料的连续生产，增加了相当高的效率^[34]。本文在构建内切葡聚糖酶表达载体时使用了组成型PGK启动子，使原本需在半乳糖培养基中诱导表达的转化子可以直接在YPD培养基中实现内切葡聚糖酶的表达，且表达效率显著提高。
信号肽是蛋白分泌的关键因子，外源蛋白质产生后，在信号肽的引导下分泌到细胞特定区间，信号肽与靶蛋白的结合程度决定了外源蛋白在重组微生物中的分泌效率^[35]。Han等^[36]合成的新型信号肽可增加毒蛋白AT_H35L在大肠杆菌中的分泌水平，比采用普通信号肽时蛋白质表达提高了35倍。有研究人员对不同信号肽组合进行筛选优化，使抗HIV抗体VRC01在毕赤酵母中的分泌水平提高了2-7倍，在摇瓶水平上最高产量可达6.50 mg/mL^[37]。本研究在构建内切葡聚糖酶表达载体时添加了酿酒酵母偏好型信号肽α-factor，成功实现内切葡聚糖酶的胞外分泌表达。
增加目的基因拷贝数是提高外源蛋白质表达水平的有效手段，但并不是基因的拷贝数越高表达量越好。Rawsthorne等^[38]将绿色荧光蛋白基因和Ll.ltrB基因连接后，得到拷贝数为3-8的多条不同片段，结果发现4拷贝工程菌的外源蛋白质表达量最高；Tamakawa等^[39]将木酮糖激酶基因XYL3、木糖还原酶基因mXYL1、木糖醇脱氢酶基因XYL2分别构建了1-10不同拷贝数的表达载体并转化宿主细胞，结果发现拷贝数与基因表达量呈正相关但非倍数关系；兰雪等利用rDNA整合法将来源于黑曲霉Aspergillus niger的内切β-1, 4木聚糖酶基因在酿酒酵母中实现随机多拷贝表达，发现8拷贝时酶活力最高，超过8拷贝时，酶活力水平反而降低^[40]。本研究利用rDNA整合法实现了内切葡聚糖酶在酿酒酵母中的随机多拷贝表达，经拷贝数和酶活力测定发现15拷贝时工程菌内切葡聚糖酶酶活力最高，低于15拷贝时，酶活力随拷贝数增加而增高，超过15拷贝时，酶活力反而降低，说明基因拷贝数增加有利于提高蛋白表达量，但存在阈值。
近年来，随着纤维素资源受到越来越多的关注，对内切葡聚糖酶的报道也越来越多，虽然实现了在原核和真核系统中的表达，但表达量大多不高^[41]。刘海英等^[42]将来源于长梗木霉Trichoderma longibrachiatum SSL的内切-1-4-β-D-葡聚糖酶Ⅰ、Ⅲ通过重组质粒电转化毕赤酵母后成功表达，酶活力分别为73 U/mL和110 U/mL。Haifa等^[43]将来源于核盘菌GH45的内切葡聚糖酶用同样的方法在毕赤酵母中成功表达，比活力为19 U/mg。本实验选择酿酒酵母INVSC1为内切葡聚糖酶基因的表达宿主，利用组成型启动子PGK和分泌信号肽α-factor实现了内切葡聚糖酶的组成型分泌表达，并利用rDNA整合法获得了不同拷贝数的转化子，当拷贝数为15时，内切葡聚糖酶活力最高，达到351 U/mL，较目前文献报道的异源表达内切葡聚糖酶的酶活力水平均有较大幅度提升，实现了内切葡聚糖酶在酿酒酵母中的高效表达。
4 结论本研究通过启动子、分泌信号肽改造以及rDNA整合法实现了内切葡聚糖酶在酿酒酵母中的随机多拷贝组成型分泌表达，经ddPCR检测获得12个具有不同拷贝数的菌株；测定酶活性，发现当拷贝数小于15时，产酶能力和拷贝数成正相关。15拷贝时工程菌酶活力最高，酶活力为351 U/mL，超过15拷贝时，酶活力降低。在23个拷贝时，酶活力仅为15拷贝的62%。综上所述，本研究实现了内切葡聚糖酶在酿酒酵母中的高效表达。
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