, 陈鹏 西北农林科技大学 生命科学学院，陕西 杨凌 712100
收稿日期：2018-11-29；接收日期：2019-01-09；网络出版时间：2019-02-18
基金项目：国家自然科学基金(Nos. 30400282，31171606)，陕西省重点研发计划(No. 2017NY-033)资助
摘要：核酸外切酶Ⅷ (Exonuclease Ⅷ，Exo Ⅷ)是一种不依赖于ATP的dsDNA 5?-3?核酸外切酶，可作为体外DNA重组反应极具应用价值的候选蛋白。目前关于Exo Ⅷ在体外DNA重组反应中的应用尚未有文献报道。本研究构建了保留完整外切活性的截短Exo Ⅷ (Truncated exonuclease Ⅷ，tExo Ⅷ)的重组表达载体pET28a-tExo Ⅷ，实现了tExo Ⅷ在大肠杆菌中的高效表达，在纯化获得高纯度蛋白的基础上，对体外重组反应的温度、反应时间、同源臂长度等因素进行了优化分析。研究结果表明，tExo Ⅷ在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达，每升可纯化92.40 mg tExo Ⅷ，比活力为1.21×105 U/mg；在10 μL的重组体系中，2.5 U的tExo Ⅷ于25 ℃反应12.5 min随后50 ℃保温50 min时重组效率最高。添加Pfu DNA聚合酶的体外同源臂延伸策略可以有效提高重组克隆的效率。以转化效率为2.2×106 CFU/μg的Mach1T1为受体细胞，对于含有21 bp同源臂的1 kb片段与5.8 kb线性化载体的重组，每微克载体可形成1.1×104个重组克隆，且阳性率大于80%。同源臂长度在8–21 bp范围内，重组反应效率随着同源臂长度增加而提高。在最佳反应条件下，同源臂长度仅为8 bp仍可实现有效的重组反应。Exo Ⅷ介导的体外重组体系具有酶制备方法简单、对DNA的克隆无酶切位点限制及高重组克隆效率等显著优点，是分子生物学领域具有潜在应用价值的高效基因克隆新体系。
关键词：核酸外切酶Ⅷ截短体表达纯化体外同源重组
Recombinant expression of truncated exonuclease Ⅷ and its application in in vitro DNA recombination
Yan Zhu, Xiaowei Han, Yinan Niu, Bei Zheng, Xuejun Li, Quanle Xu
, Peng Chen College of Life Sciences, Northwest A & F University, Yangling 712100, Shaanxi, China
Received: November 29, 2018; Accepted: January 9, 2019; Published: February 18, 2019
Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 30400282, 31171606), Key Research and Development Program of Shaanxi Province (No. 2017NY-033)
Corresponding author: Quanle Xu. Tel/Fax: +86-29-87091637; E-mail: xuquanle@nwsuaf.edu.cn;
Peng Chen. Tel/Fax: +86-29-87091637; E-mail: pengchen@nwsuaf.edu.cn.
Abstract: Exonuclease Ⅷ (Exo Ⅷ), an ATP-independent dsDNA 5′-3′ exonuclease, is a candidate protein with great application value for in vitro DNA recombination. However, the application of Exo Ⅷ in DNA recombination in vitro has not been reported. In this study, the recombinant expression vector of the truncated Exo Ⅷ (tExo Ⅷ) with the full exonuclease activity was built and used to achieve the overexpression of tExo Ⅷ in Escherichia coli. Based on the purified tExo Ⅷ protein with high-purity, the feasibility of tExo Ⅷ applied in vitro DNA recombination and effects of the reaction temperatures, reaction duration, and homology arm lengths were examined. The results showed that tExo Ⅷ was highly expressed in soluble form in E. coli. One liter of bacterial culture yielded 92.40 mg of purified tExo Ⅷ with the specific activity of 1.21×105 U/mg. In a 10 μL recombination system containing 2.5 U tExo Ⅷ, the highest cloning efficiency was achieved in a reaction at 25 ℃ for 12.5 min and followed by incubation at 50 ℃ for 50 min. With addition of Pfu DNA polymerase, the homology arm extension strategy can effectively improve the recombination efficiency. Using competent E. coli Mach1 T1 with 2.2×106 cfu/μg transformation efficiency as recipient cell, the recombination of a 1 kb fragment with a 21 bp homology arm and a 5.8 kb linearized vector can form about 1.1×104 recombinant clones per μg vector, and the positive rates was over 80%. The recombination efficiency was increased with the increasing length of homology arm ranged from 8 to 21 bp. Under the optimal reaction condition, only 8 bp homology arm can still achieve valid DNA recombination. This novel in vitro DNA recombination system mediated by tExo Ⅷ was particularly characterized by its easy preparation, no limitation on restriction sites and high recombination cloning efficiency. All results revealed that the new efficient gene cloning system has potential application in the field of molecular biology.
Keywords: truncated exonuclease Ⅷexpression and purificationhomologous recombination in vitro
分子克隆技术通常使用限制性核酸内切酶和DNA连接酶实现DNA的体外克隆，载体多克隆位点有限的酶切位点和DNA分子内部存在的酶切位点限制了该方法的通用性和可操作性[1-2]。不依赖连接酶的克隆方法(Ligase independent cloning，LIC)即无缝克隆技术的出现大大提高了体外DNA重组克隆的效率。LIC通过特定的DNA外切酶使两个DNA分子产生可互补的单链末端，单链末端的退火推进DNA发生重组，这种重组克隆的方式不受限制性内切酶酶切位点的限制，使基因克隆的操作更灵活，可满足高通量DNA克隆的需求[3-5]。
目前不依赖连接酶克隆系统用于形成DNA单链末端的酶主要有核酸外切酶Ⅲ、T4 DNA聚合酶、λ核酸外切酶等。核酸外切酶Ⅲ具有3?-5?核酸外切酶活性，已有的研究显示，使用适量的核酸外切酶Ⅲ处理载体和片段30–60 s即可产生有效的末端同源臂[6]。核酸外切酶Ⅲ对存在3?单链末端的dsDNA无外切活性，因此由形成3?单链末端的限制性内切酶(如Pst Ⅰ)制备的DNA无法选择该体系进行克隆[7]。T4 DNA聚合酶具有3?-5?核酸外切酶活性，且在dNTPs存在条件下可以催化DNA的合成，使用该酶处理目的片段和载体可产生5?单链末端，经退火复性即可实现重组[8]。然而由于T4 DNA聚合酶外切活性强且具有持续性，因此容易对双链DNA造成过度外切而产生过长的单链末端，长的末端容易形成二级结构而抑制有效的重组反应[9-10]。λ核酸外切酶是一种噬菌体来源的5?-3?核酸外切酶，可使载体和目的片段产生3?单链末端促进重组反应[11]，然而λ核酸外切酶的最适底物是5?磷酸化的dsDNA，对于通过PCR制备的载体和PCR产物外切效率极低，因此λ核酸外切酶用于体外的重组反应时存在作用底物上的巨大局限[12-13]。除了上述酶系统外，大肠杆菌RecA重组系统也被用于体外的重组反应，该系统利用RecBCD的解旋酶和5?-3?外切酶活性产生3?单链末端，在RecA的作用下完成重组。但该体系不仅需要较为复杂的蛋白因子和辅因子(如ATP等)，而且需要151 bp以上的同源区才能实现有效的重组，体外条件下超长的同源区不仅增加单链末端自身形成二级结构的概率，同时增加引物合成的成本和出错率[14-16]。
大肠杆菌核酸外切酶Ⅷ (Exonuclease Ⅷ，Exo Ⅷ)是一种不依赖ATP的dsDNA 5?-3?核酸外切酶，在37 ℃的反应条件下表现为持续性的底物外切活性，即造成所结合的特定DNA链的连续外切，而在10 ℃的反应条件下对线性双链DNA外切表现为分配性，即反应体系中形成具有较为均一长度3?单链的DNA。Exo Ⅷ对5?磷酸化和非磷酸化的双链DNA具有相同的外切效率[17-18]。Chang等报道大肠杆菌Exo Ⅷ C端分子量约为34 kDa的截短体保留了完整的5?-3?外切酶活性，且具有与98 kDa完整酶相同的催化特性[19]。Zhang等报道在大肠杆菌中诱导表达Rac噬菌体Exo Ⅷ和RecT蛋白可以实现外源线性化的DNA和环状载体在大肠杆菌体内的高效重组，反应需要35–60 bp的同源臂[20-21]。目前Exo Ⅷ主要用于去除环状双链DNA或环状ssDNA中的线性dsDNA，而利用Exo Ⅷ外切活性介导体外DNA重组的研究至今尚未见报道。
本研究在重组表达和纯化具完整外切活性的Exo Ⅷ截短体(Truncated exonuclease Ⅷ，tExo Ⅷ)的基础上，对tExo Ⅷ介导体外重组的可行性及反应体系进行优化，为建立基于tExo Ⅷ的高效体外重组体系奠定基础工作。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株和载体本研究采用的菌株大肠杆菌Escherichia coli Mach1 T1、BL21 Star (DE3)以及质粒pET28a、pYES2等均为实验室保存。
1.1.2 培养基LB培养基(1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl，固体培养基添加1.5%琼脂，pH 7.0)用于培养大肠杆菌。
1.1.3 酶和试剂2× IProof DNA polymerase Mix购自Bio-Rad公司；Taq DNA聚合酶、Pfu DNA polymerase购自Promega公司；Nde Ⅰ、Xho Ⅰ、Hind Ⅲ、Xba Ⅰ、T4 DNA Ligase购自Thermo Scientific公司；dNTPs购自Roche公司；Talon resin购自Clontech公司。
1.1.4 感受态细胞参考Chung等的方法采用TSS法大量制备Mach1 T1感受态细胞[22]。采用KCM法转化质粒pUC18检测感受态细胞的转化效率为2.2×106 CFU/μg[23]。
1.2 方法1.2.1 目的基因的扩增根据tExo Ⅷ序列利用Primer Premier 5.0设计并合成引物序列EXO8-1和EXO8-2 (表 1)，并以大肠杆菌TOP10基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应条件为：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共32个循环；最后72 ℃延伸10 min。
表 1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study
| Primer name | Primer sequence (5?–3?) |
| EXO8-1 | CAGAGAACATATGGATAACTGCCCTGACTGTGGTG |
| EXO8-2 | GGGGTCTCGAGTTAGTCATTTGCATATTCCTTAGCCCAG |
| pYES2-Nramp3-F | ACTATAGGGAATATTAAGCTTATGGCTGAGCTCGCTTTGATC |
| pYES2-Nramp3-R | TACATGATGCGGCCCTCTAGATCAATTTACTAATCTTTCATCATTCTTGG |
| pYES2-B1-F | ACTATAGGGAATATTAAGCTTATGTCACAAGATTTGAAGGAAATAAACACAG |
| pYES2-B1-R | TACATGATGCGGCCCTCTAGATCAGTCATCTTCTCTTGGTTTCCCTG |
| pYES2-G11(21)-F | ACTATAGGGAATATTAAGCTTATGTCGGATCATCTCGCCATGGA |
| pYES2-G11(21)-R | TACATGATGCGGCCCTCTAGATTACCTTCTACCAGGGGCAACATACC |
| pYES2-G11(17)-F | TAGGGAATATTAAGCTTATGTCGGATCATCTCGCCATGGA |
| pYES2-G11(17)-R | TGATGCGGCCCTCTAGATTACCTTCTACCAGGGGCAACATACC |
| pYES2-G11(13)-F | GAATATTAAGCTTATGTCGGATCATCTCGCCATGGA |
| pYES2-G11(13)-R | GCGGCCCTCTAGATTACCTTCTACCAGGGGCAACATACC |
| pYES2-G11(8)-F | TTAAGCTTATGTCGGATCATCTCGCCATGGA |
| pYES2-G11(8)-R | CCTCTAGATTACCTTCTACCAGGGGCAACATACC |
| Underlined letters indicate homologous sequences for pYES2 vector. | |
表选项
1.2.2 重组表达载体的构建tExo Ⅷ的PCR扩增产物和质粒pET28a分别用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后回收纯化，经T4 DNA连接酶连接后转化大肠杆菌Mach1 T1感受态细胞，利用Taq DNA聚合酶，并以EXO8-1和EXO8-2为引物进行菌落PCR鉴定阳性克隆并测序，测序正确的重组质粒命名为pET28a-tExo Ⅷ。
1.2.3 tExo Ⅷ的表达与纯化将重组质粒pET28a-tExo Ⅷ转入表达菌株E. coli BL21 Star (DE3)中，挑取单菌落接种于5 mL含50 μg/mL卡那霉素(Kana)的LB液体培养基中，于37 ℃、180 r/min培养过夜。按1:100的比例接种菌液于200 mL LB液体培养基中，37 ℃振荡培养至菌液OD600值为1.0，加入终浓度为0.8 mmol/L的IPTG，30 ℃诱导表达8 h。取1 mL菌液，10 000 r/min离心5 min，弃上清，同时以未加入IPTG的菌体作为对照。将菌体悬浮于100 μL SDS-PAGE上样缓冲液中，100 ℃煮沸5 min，离心取上清，使用SDS-PAGE (分离胶浓度为12.5%，浓缩胶浓度为4%)检测tExo Ⅷ重组蛋白的表达。
将诱导的菌体悬浮于破菌缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，pH 7.5)中进行超声波破碎，裂解液在12 000 r/min离心10 min，分别取上清和沉淀按上述方法进行SDS-PAGE分析，以检测表达蛋白的可溶性[24]。
参考Mitsudome等的方法用钴离子螯合层析柱(Talon Resin，Clontech)对目的蛋白进行分离纯化[25]。洗脱的目的蛋白用截留分子量为10 kDa的超滤管进行浓缩，SDS-PAGE检测纯化蛋白的纯度。蛋白浓度的测定采用考马斯亮蓝G250法，用牛血清白蛋白制作标准曲线。
1.2.4 tExo Ⅷ活性的测定参照Ko等的方法[26]，酶活力单位定义为50 μL反应体系，37 ℃、30 min生成1 nmol核苷酸所需的酶量。以线性化pGEX-6P-1质粒DNA为底物。反应体系为：冰浴条件下在PCR管中加入5 μL 10×反应缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L KCl，100 mmol/L MgSO4，10 mmol/L DTT，pH 8.0)，10 μg线性化pGEX-6P-1质粒及纯化的tExo Ⅷ并用ddH2O补充体积至50 μL，混匀，37 ℃保温30 min。反应结束后，加1/4体积1 mol/L HCl，并用25% TCA终止反应。上清用灭菌ddH2O稀释，测定260 nm处光吸收值。
1.2.5 tExo Ⅷ介导的体外重组反应的可行性为验证tExo Ⅷ进行体外重组的可行性，以经Hind Ⅲ/XbaⅠ双酶切线性化的pYES2质粒为载体，苦荞抗性相关巨噬细胞蛋白3(Natural resistance- associated macrophage protein 3，Nramp3)、ABC (ATP-binding cassette，ABC)家族G11蛋白、ABC家族B1蛋白的基因片段nramp3 (1 000 bp)、g11 (2 200 bp)、b1 (4 000 bp)为克隆目标进行tExo Ⅷ介导的体外重组反应。
pYES2质粒的制备及目的基因的PCR扩增：使用质粒抽提试剂盒(TIANprep Mini Plasmid Kit)提取pYES2质粒，经Hind Ⅲ和Xba Ⅰ双酶切后回收。用引物pYES2-Nramp3-F和pYES2-Nramp3-R扩增nramp3目的片段(同源臂长度为21 bp)，pYES2- B1-F和pYES2-B1-R扩增b1目的片段(同源臂长度为21 bp)，分别用pYES2-G11(21)-F和pYES2- G11(21)-R、pYES2-G11(17)-F和pYES2-G11(17)-R、pYES2-G11(13)-F和pYES2-G11(13)-R、pYES2- G11(8)-F和pYES2-G11(8)-R扩增同源臂长度分别为21、17、13、8 bp的g11目的片段。
tExo Ⅷ介导的体外重组反应的可行性：基于前期预实验的结果，在10 μL的重组体系中加入2.5 U的tExo Ⅷ即可完成有效的重组。按照载体和重组基因片段摩尔比值1︰3的比例取对应量的线性化载体pYES2 (5 856 bp)和nramp3 (1 000 bp)，加入5 μL含有tExo Ⅷ的重组反应液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5，40 mmol/L KCl，1 mmol/L DTT，5 mmol/L MgCl2，2.5 U tExo Ⅷ)，用ddH2O补足体系至10 μL后进行重组反应。分别在25 ℃、30 ℃外切反应10 min，重组反应液冰浴后用KCM法转化至大肠杆菌Mach1 T1感受态细胞[23]，根据平板的克隆数、PCR及双酶切鉴定评价重组的可行性。PCR鉴定采用基因特异性引物进行。每个重组反应至少重复3次。
1.2.6 体外同源臂延伸对于重组效率的影响参考1.2.5的方法和体系，在重组反应体系中添加dNTPs和Pfu DNA聚合酶，形成在体外条件下单链同源臂区的延伸，即按照载体和重组基因片段摩尔比值1︰3的比例取对应量的线性化载体pYES2 (5 856 bp)和nramp3 (1 000 bp)，加入5 μL含有tExo Ⅷ的重组反应液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5，40 mmol/L KCl，500 μmol/L dNTPs，1 mmol/L DTT，5 mmol/L MgCl2，2.5 U tExo Ⅷ，1 U Pfu DNA聚合酶)，用ddH2O补足体系至10 μL后进行重组反应。分别在25 ℃、30 ℃外切反应10 min后，50 ℃保温50 min延伸同源臂。重组反应液经冰浴后使用KCM法转化至大肠杆菌Mach1 T1感受态细胞[23]，根据平板的克隆数、PCR及双酶切鉴定评价重组效率，每个重组反应至少重复3次。
1.2.7 外切反应温度对重组效率的影响参考1.2.6的重组反应体系，分别在0 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃外切反应10 min后，50 ℃保温50 min延伸同源臂。重组反应液冰浴后用KCM法转化至大肠杆菌Mach1 T1感受态细胞[23]，根据平板的克隆数、PCR及双酶切鉴定评价重组效率，每个重组反应至少重复3次。
1.2.8 外切反应时间对重组效率的影响参考1.2.6的反应体系，分别在25 ℃、30 ℃外切反应5、7.5、10、12.5 min，转化至大肠杆菌Mach1 T1感受态细胞，根据平板的克隆数、PCR及双酶切鉴定评价重组效率。
1.2.9 基因片段大小对体外重组反应效率的影响参考1.2.6的反应体系，在25 ℃、12.5 min和50 ℃、50 min的反应条件下将载体和目的片段按摩尔比值1︰3的比例取对应量的线性化载体pYES2 (5 856 bp)，分别与nramp3 (1 000 bp)、g11 (2 200 bp)、b1 (4 000 bp)基因片段进行重组反应，重组产物转化至大肠杆菌Mach1 T1感受态细胞，根据平板的克隆数、PCR及双酶切鉴定评价重组效率。每个重组反应至少重复3次。
1.2.10 同源臂长度对重组效率的影响将载体和目的片段按摩尔比值1︰3的比例取对应量的线性化载体pYES2和纯化的同源臂长度分别为21、17、13、8 bp的g11目的片段，参考1.2.6的反应体系和条件进行重组反应，重组产物转化至大肠杆菌Mach1 T1感受态细胞，根据平板的克隆数、PCR及双酶切鉴定评价重组效率。
2 结果与分析2.1 Exo Ⅷ截短体基因的扩增和重组表达载体的构建以EXO8-1和EXO8-2为引物扩增目的基因tExo Ⅷ，电泳结果显示约为900 bp的单一条带(图 1A)，大小与预期基因片段大小相符。
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| 图 1 Exo Ⅷ截短体基因的克隆(A)及pET28a-tExo Ⅷ重组载体的双酶切鉴定(B) Fig. 1 PCR amplification of truncated Exo Ⅷ gene (A) and double digestion of pET28a-tExo Ⅷ (B). (A) M: DL2000 DNA marker; 1: PCR product of tExo Ⅷ. (B) M: DL2000 DNA marker; 1, 2: double digested pET28a- tExo Ⅷ. |
| 图选项 |
使用Nde Ⅰ、Xho Ⅰ对重组质粒进行双酶切鉴定，电泳结果显示分别为约5 300 bp的载体及约900 bp的目的基因条带(图 1B)，与预期结果相符。测序结果显示构建的表达载体正确，将其命名为pET28a-tExo Ⅷ。
2.2 tExo Ⅷ表达与纯化重组质粒pET28a-tExo Ⅷ转化大肠杆菌BL21 Star (DE3)，0.8 mmol/L IPTG诱导8 h的菌体经超声细胞破碎，上清液通过钴离子螯合层析进行纯化。SDS-PAGE检测诱导的菌体及纯化蛋白，如图 2所示，诱导的菌体较未诱导的样品在约38 kDa位置出现一条明显的蛋白条带，与tExo Ⅷ蛋白的理论分子量大小一致，经钴离子柱纯化获得与之分子量一致的单一条带。每升诱导的菌液可纯化92.40 mg的tExo Ⅷ，比活力为1.21×105 U/mg。
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| 图 2 tExo Ⅷ表达与纯化的SDS-PAGE分析 Fig. 2 Expression and purification of tExo Ⅷ analyzed by SDS-PAGE. M: protein marker; 1: purified tExo Ⅷ; 2: induced cells containing pET28a-tExo Ⅷ; 3: non-induced cells containing pET28a-tExo Ⅷ. |
| 图选项 |
2.3 tExo Ⅷ介导体外重组反应的可行性以同源臂长度为21 bp，1 kb nramp3基因为插入片段，25 ℃、30 ℃外切反应10 min，每微克载体可分别形成2 640、5 181个克隆，阳性率检测显示均达到80%。结果表明tExo Ⅷ介导的体外重组反应存在有效性和可行性。
2.4 体外同源臂延伸及反应温度和时间对重组效率的影响2.4.1 体外同源臂延伸对tExo Ⅷ重组效率的影响以同源臂长度为21 bp，1 kb nramp3基因为插入片段，25 ℃、30 ℃外切反应10 min后，利用Pfu DNA聚合酶的聚合活性，50 ℃反应50 min进行同源臂同源匹配区的延伸，每微克载体可分别形成10 164、8 346个克隆，阳性率检测显示均大于80%。结果说明添加Pfu DNA聚合酶可以有效提高tExo Ⅷ介导体外重组的效率。基于此结果，后续仅对于tExo Ⅷ外切反应的时间和温度进行优化。
2.4.2 tExo Ⅷ外切反应温度对重组效率的影响使用0–37 ℃的外切反应温度及后续50 ℃、50 min的保温进行重组反应，结果显示各重组条件下均具有较高的阳性率，进一步说明利用tExo Ⅷ进行体外DNA重组反应的可行性。在0–30 ℃范围内，随着外切反应温度的升高重组效率持续增加，并且均具有较高的阳性率(表 2)。而在37 ℃外切反应10 min，重组反应的效率明显下降。结果表明tExo Ⅷ用于重组反应时适宜的外切反应温度范围为25–30 ℃。
表 2 不同外切反应温度对tExo Ⅷ介导的重组克隆效率的影响Table 2 Effect of different reaction temperatures on tExo Ⅷ-mediated recombinant cloning efficiency (per μg of vector)
| Reaction conditions | Number of clones | Cloning efficiency (%) |
| 0 ℃, 10 min; 50 ℃, 50 min | 297±96.03 | 80 |
| 20 ℃, 10 min; 50 ℃, 50 min | 1 155±432.30 | 90 |
| 25 ℃, 10 min; 50 ℃, 50 min | 3 927±679.14 | 90 |
| 30 ℃, 10 min; 50 ℃, 50 min | 8 877±1 254.99 | 100 |
| 37 ℃, 10 min; 50 ℃, 50 min | 996±179.33 | 90 |
| The number of clones indicates the number of clones formed per reaction. Each value of “number of clones” is the x±s deviation of three independent experiments. Cloning efficiency indicates the number of clones inserted into the correct fragment/the number of all clones. | ||
表选项
2.4.3 外切反应时间对重组效率的影响在25 ℃、30 ℃温度下使用不同外切反应时间进行重组转化，结果显示在不加入50 ℃退火反应的快速重组中，反应条件为25 ℃ 12.5 min、30 ℃ 10 min时重组效率最高(表 3)。在这两种条件下后续进行50 ℃、50 min的同源臂延伸，结果显示外切反应条件为25 ℃ 12.5 min时重组效率最高，说明tExo Ⅷ介导的体外重组体系较为适宜的反应条件为在25 ℃下反应10–12.5 min。
表 3 不同外切反应时间对tExo Ⅷ介导的重组克隆效率的影响Table 3 Effect of different reaction duration on tExo Ⅷ-mediated recombinant cloning efficiency (per μg of vector)
| Reaction conditions | Number of clones | Cloning efficiency (%) | |||
| 25 ℃ | 30 ℃ | 25 ℃ | 30 ℃ | ||
| 5 min | 528±107.91 | 924±234.96 | 100 | 100 | |
| 7.5 min | 594±189.42 | 792±203.94 | 90 | 90 | |
| 10 min | 2 640±367.95 | 5 181±779.40 | 80 | 80 | |
| 12.5 min | 4 026±964.59 | 2 574±729.30 | 100 | 70 | |
| 15 min | 1 914±364.59 | 1 322±329.30 | 100 | 90 | |
| 25 ℃, 10 min; 50 ℃, 50 min | 9 316±277.95 | 90 | |||
| 25 ℃, 12.5 min; 50 ℃, 50 min | 10 164±665.94 | 90 | |||
| 30 ℃, 10 min; 50 ℃, 50 min | 5 214±679.80 | 80 | |||
表选项
2.4.4 基因片段大小对体外重组反应效率的影响为了分析基于tExo Ⅷ的体外重组体系对不同长度基因片段重组效率的差异，在25 ℃、12.5 min和50 ℃、50 min的反应条件下使用nramp3 (1 000 bp)、g11 (2 200 bp)、b1 (4 000 bp)三种不同大小的基因片段进行重组克隆。结果显示tExo Ⅷ介导的体外重组体系对于上述基因均可实现有效克隆，且体系对于nramp3及g11的重组效率较b1基因高，表现出随着片段长度的增加克隆效率下降的趋势(表 4)。
表 4 tExo Ⅷ介导的体外重组体系对不同长度DNA片段的克隆效率Table 4 Cloning efficiency of tExo Ⅷ mediated in vitro recombination for different DNA sizes (per μg of vector)
| Genes | Number of clones | Cloning efficiency (%) |
| nramp3 (1 000 bp) | 9 834±659.34 | 90 |
| g11 (2 200 bp) | 8 679±678.48 | 90 |
| b1 (4 000 bp) | 5 148±581.79 | 80 |
表选项
2.4.5 同源臂长度对重组反应的影响使用同源臂长度分别为21、17、13、8 bp的g11基因片段和pYES2线性化载体在25 ℃、12.5 min和50 ℃、50 min的反应条件下进行重组反应，以探究同源臂长度对于重组克隆效率的影响。结果如表 5所示，随着同源臂长度的增加重组效率增加，同源臂长度为21、17 bp时重组效率最高且无显著性差异。同源臂长度为8 bp时仍可形成有较高阳性率的克隆，降低后续同源臂延伸的反应温度至40 ℃可提高重组效率(表 5)。
表 5 同源臂长度对g11重组克隆效率的影响Table 5 Effect of homology arm lengths on the recombinant cloning efficiency of g11 (per μg of vector)
| Gene | Number of clones | Cloning efficiency (%) | |||
| 50 ℃, 50 min | 40 ℃, 50 min | 50 ℃, 50 min | 40 ℃, 50 min | ||
| g11(8) | 330±99.33 | 957±137.61 | 100 | 90 | |
| g11(13) | 4 488±648.78 | 4 653±707.19 | 90 | 80 | |
| g11(17) | 7 161±663.30 | 90 | |||
| g11(21) | 8 679±678.48 | 90 | |||
表选项
3 讨论不依赖于连接酶的无缝克隆技术的发展大大加速了基因克隆的效率和操作通量。现有的体外重组系统依赖于核酸外切酶Ⅲ、T4 DNA聚合酶、λ核酸外切酶等形成单链的同源重组臂[6-9, 11-13]。其中，核酸外切酶Ⅲ是3?-5?核酸外切酶，其优选底物是平末端或3?凹陷末端，而对于存在四碱基或更长的3?单链末端的DNA分子无活性[7]，λ核酸外切酶对5?去磷酸化的双链DNA表现出低的外切效率(约为5?磷酸化底物的20%)[27]，T4 DNA聚合酶具有超强外切酶活性，在形成单链的同源重组臂时必须精确控制反应温度和时间等以防止酶切过度。鉴于上述原因导致现有的体外重组体系不同批次的克隆操作效率存在巨大差异，因此拓展新的外切酶种类用于体外重组反应中单链同源臂的形成具有重要的实践价值。
Exo Ⅷ是一种不依赖于ATP的5?-3?核酸外切酶，在10 ℃的反应条件下对线性双链DNA的外切呈分配性，能有效外切具有长达250个核苷酸的5?单链末端的DNA分子，其对底物的识别不依赖于双链DNA的5?磷酸基团，且对具5?单链末端、平末端、3?单链末端的双链底物能以较为一致的效率进行外切，这些特性使Exo Ⅷ非常适合于体外DNA重组中均一单链同源臂的形成[18]。Exo Ⅷ是体外DNA重组反应极具应用价值的候选蛋白，但迄今为止关于Exo Ⅷ用于体外重组的研究尚未有文献报道。已有文献报道Exo Ⅷ的C末端结构域有着完整的核酸外切酶活性[19]，本研究克隆了保留完整外切活性的Exo Ⅷ截短基因(tExo Ⅷ)，并实现了其在大肠杆菌内的重组表达。tExo Ⅷ表达量可达92.40 mg/L，纯化酶的比活力可以达到1.21×105 U/mg，按照本研究建立的体系可以用于超过300万次的重组反应。
在本研究的重组体系中，引入促进体外同源臂延伸的新策略(图 7)，25 ℃保温条件下Exo Ⅷ外切双链DNA可能形成长于设计的同源单链区，不同来源的同源单链区退火形成局部的双链，在重组体系中含有的Pfu DNA聚合酶的作用下，50 ℃、50 min的保温可以使Pfu DNA聚合酶以互补区域存在的两个3′端为起始点，催化两个片段同源重组互补区长度的增加，使后续转化大肠杆菌时同源双链区更加稳定，更有利于转入宿主细胞后进行缺刻质粒的修复。本研究结果证明促进同源臂稳定的匹配是提高重组效率的有效途径。在同源臂仅为8 bp的条件下进行重组反应，降低后续同源臂延伸的温度可以有效地提高克隆的效率，其主要原因是在50 ℃条件下延伸时，8 bp的同源区相互匹配的效率较低，造成同源臂的有效延伸下降，在保障充分的延伸时间条件下，降低延伸温度可以提升同源臂延伸的有效性。感受态细胞的转化效率是影响体外重组克隆的重要因素。本研究利用实验室自制的转化效率仅为2.2×106 CFU/μg的感受态细胞即可实现高效的克隆，充分说明本研究体系的有效性。利用商业化的转化效率为1.0×108 CFU/μg的感受态细胞进行重组转化，其形成的有效克隆数增加5–13倍(以同源臂长度为21、17、13 bp的1 kb nramp3基因为插入片段，每微克载体形成的平均克隆数分别为127 842、75 233、51 036)；另外研究中也尝试利用Exo Ⅷ介导体外DNA重组克隆体系进行多种类型载体和不同基因的克隆，均显示出高效性(结果未显示)。
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| 图 7 Exo Ⅷ介导的同源重组体系示意图 Fig. 7 Diagram of the homologous recombination system mediated by Exo Ⅷ. |
| 图选项 |
本研究首次报道和应用Exo Ⅷ于体外的DNA重组克隆体系，具有简便高效的显著特征。
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