唐山师范学院 生命科学系，河北 唐山 063000
收稿日期：2016-10-28;接收日期：2017-04-14; 网络出版时间：2017-05-03 基金项目：河北省高等学校科学技术研究项目(No. QN2017415)，河北省自然科学基金(No. C2014105067)，河北省留学人员科技活动择优资助项目(No. C2015005009)，唐山师范学院科学研究基金(Nos. 2016C05, 2014E04) 资助
摘要： STK1基因是玉米大斑病菌调控分生孢子发育、渗透胁迫调节和致病性的重要MAPK基因。本文首先构建了含有增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的毕赤酵母GSS115 (Pichia pastoris GS115) 表达载体pPIC3.5K-EGFP，再以玉米大班病菌模式菌株01-23的菌丝cDNA为模板，PCR扩增STK1基因，克隆到pPIC3.5K-EGFP，构建了STK1-EGFP融合基因的GS115表达载体pPIC3.5K-STK1-EGFP。利用电击转化法将该融合基因表达载体转化到GS115感受态细胞内，利用MD培养基筛选、PCR鉴定，获得了STK1-EGFP融合基因的毕赤酵母转化子。通过RT-PCR和荧光观察，发现STK1基因和EGFP基因均可以高效稳定地表达。另外，在试验中我们还发现，在STK1基因起始密码子前加入Kozak序列可以使STK1-EGFP融合基因的表达强度增强4.8倍。以上研究结果为STK1基因表达蛋白的亚细胞功能定位和抗体制备奠定了基础。
关键词： 玉米大斑病菌 STK1-EGFP融合基因 毕赤酵母 基因表达
Construction of Setosphaeria turcica STK1-EGFP fusion gene vector and its expression in Pichia pastoris
Yunfeng Zhang
Department of Life Sciences, Tangshan Normal University, Tangshan 063000, Hebei, China
Received: October 28, 2016; Accepted: April 14, 2017; Published: May 3, 2017
Supported by: Science and Technology Research Project of Hebei Higher Education (No. QN2017415), Natural Science Foundation of Hebei Province (No. C2014105067), Hebei Overseas Students Science and Technology Activities Merit Aid Projects (No. C2015005009), Science Research Foundation of Tangshan Normal University (Nos. 2016C05, 2014E04)
Corresponding author:Yunfeng Zhang. Tel: +86-315-3863376; E-mail: zyfikx@126.com
Abstract: STK1 is one important MAPK gene regulating the conidial development, osmotic stress and pathogenicity of Setosphaeria turcica. At first, the Pichia pastoris GS115 expression vector pPIC3.5K-EGFP containing enhanced green fluorescent protein gene (EGFP) was constructed, then STK1 gene was first amplified by PCR with the template of cDNA of S. turcica model isolate 01-23, and then cloned into the vector pPIC3.5K-EGFP with enhanced green fluorescent protein gene (EGFP) to construct the STK1-EGFP fusion gene expression vector pPIC3.5K-STK1-EGFP. The vector was transformed into the susceptible cells of Pichia pastoris GS115 by electric shock process, and the transformants were identified by MD medium screening and PCR determination. The STK1 gene and EGFP gene could be expressed effectively and stably in the transformants as detected by RT-PCR and fluorescence observation. In addition, we also found that the Kozak sequence before the start codon of STK1 gene could increase 4.8 folds expression level of STK1-EGFP fusion gene. The above research results laid a good foundation for subcellular localization and antibody preparation of STK1 protein.
Key words: Setosphaeria turcica STK1-EGFP fusion gene Pichia pastoris gene expression
玉米大斑病菌Setosphaeria turcica是玉米上一种重要的病原真菌，由其引起的玉米大斑病是玉米上的重要叶部病害，在流行年份常造成50%的减产损失[1]。植物病原真菌促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase，MAPK)信号途径是重要的信号途径，主要参与调控植物病原真菌的生长、发育及致病性等[2-4]。STK1基因是玉米大斑病菌中一个重要的MAPK基因，前期研究表明该基因主要参与调控玉米大斑病菌分生孢子的发育、渗透胁迫调节、分生孢子萌发、附着胞产生和致病性等[5]。毕赤酵母Pichia pastoris表达系统是一种成熟的蛋白表达系统，表达蛋白能够正确折叠并行使功能[6]。
STK1基因是玉米大斑病菌MAPK信号传导途径中的关键基因[7]，但对于研究STK1蛋白的结构及细胞内功能定位目前尚无报道。本实验通过构建适于毕赤酵母GS115中稳定、高效表达STK1-EGFP融合基因的甲醇诱导型表达载体，为进一步制备STK1蛋白结晶体及其抗体、明确STK1蛋白的功能定位奠定基础。
1 材料1.1 菌株和质粒菌株：毕赤酵母GS115 (Pichia pastoris GS115) 和玉米大斑病菌模式菌株01-23由河北农业大学董金皋教授惠赠。
质粒：酵母表达载体pPIC3.5K和增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1由南开大学生化与分子生物学实验室惠赠。
1.2 试剂TaqTM DNA聚合酶、Pyrobest高保真DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、酵母基因组DNA提取试剂盒等购自TaKaRa公司；真菌总RNA快速抽提试剂盒、M-MuLV逆转录酶，YNB、生物素、甘油、甲醇和无水乙醇等试剂均购自BBI公司。
PCR扩增STK1和EGFP等基因的引物由BBI公司合成(表 1)。
表 1 试验用引物及其用途Table 1 The PCR primers used in the experiment and the function of them
| Primer name | Primer sequence (5′→3′) | Tm(℃) | Restriction sites | Primer application |
| EGFP-F | GCGAATTCGGGCCCATGGTGAGCAAGGGCGAG | 64.0 | EcoRⅠ, ApaⅠ | Application of EGFP gene |
| EGFP-R | GCGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG | Not I | ||
| STK1-F1 | GCGGATCCATGGCGGAATTCGTACGCGC | 61.5 | BamHⅠ | Application of STK1 gene |
| STK1-F2 | GCGGATCCCACCATGGCGGAATTCGTACGCGC | |||
| STK1-R | CCGGGCCCGCTGCCGTTGCTCTCTGG | ApaⅠ |
表选项
2 方法2.1 玉米大斑病菌STK1基因cDNA的克隆玉米大斑病菌模式菌株01-23的总RNA提取和第一条链的合成参照王梅娟等[8]的试验方法进行，然后以获得的cDNA为模板，分别利用引物对STK1-F1/STK1-R和STK1-F2/STK1-R扩增在起始密码子前不含有Kozak序列的STK1基因(STK1-A)和在起始密码子前含有Kozak序列的STK1基因(STK1-B)。PCR扩增体系：cDNA模板50 ng，10×Taq缓冲液5 μL，dNTPs 4 μL，引物(10 μmol/L)各2 μL，TaqTM DNA聚合酶(5 U/μL) 0.25 μL，补ddH2O至50 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30个循环；72 ℃保温10 min。琼脂糖凝胶电泳后回收并纯化扩增片段。
2.2 毕赤酵母表达载体的构建以pEGFP-N1质粒为模板，利用引物EGFP-F和EGFP-R扩增EGFP基因，用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后利用DNA连接酶将EGFP克隆入载体pPIC3.5K，构建EGFP基因载体pPIC3.5K-EGFP。将STK1基因和pPIC3.5K-EGFP同时进行EcoRⅠ和ApaⅠ双酶切，然后利用连接酶将STK1基因克隆入EGFP基因载体pPIC3.5K-EGFP，构建STK1-EGFP融合基因表达载体pPIC3.5K-STK1-EGFP。
2.3 毕赤酵母GS115菌株电击转化感受态细胞的制备、转化和筛选毕赤酵母GS115菌株感受态细胞的制备、转化和筛选参照高炳淼等方法[9]。
2.4 酵母转化子的PCR鉴定利用酵母基因组DNA提取试剂盒提取酵母转化子的基因组DNA，用EGFP和STK1的特异引物进行PCR体系扩增：酵母DNA 40 ng，2.5 mmol/L MgCl2 1.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.5 μL，上下游引物(10 μmoL/L)各1.0 μL，10×PCR缓冲液2.0 μL，rTaq 0.2 μL，补足ddH2O至20 μL。在PCR仪上94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火30 s (Tm见表 1)，72 ℃延伸1.5 min，35个循环，72 ℃保温10 min。1%琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像系统检测。
2.5 STK1和EGFP基因表达的RT-PCR检测参照Zuo等[10]的试验对转化子进行甲醇诱导表达。毕赤酵母菌总RNA的提取和第一条链的合成参照王梅娟等[8]的试验方法进行，然后以获得cDNA为模板进行EGFP和STK1序列的扩增检测，体系如下：cDNA模板5 μL，10×Taq缓冲液2 μL，dNTPs 1.5 μL，STK1 (或EGFP)上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，TaqTM DNA聚合酶(5 U/μL) 0.15 μL，补ddH2O至20 μL。PCR反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃终止。经过电压4 V/cm的琼脂糖凝胶电泳20 min后，凝胶成像系统检测。
2.6 STK1和EGFP基因表达的荧光检测用BMMY液体培养基培养酵母转化子，离心收集菌体，用磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline，PBS)悬浮菌体，激光共聚焦荧光显微镜(Olympus FV1200) 观察融合蛋白的荧光情况[11]并照相，利用ImageJ软件对酵母细胞的荧光强度进行分析，每个实验组选取100个酵母细胞[12]。
3 结果与分析3.1 EGFP和STK1-EGFP融合基因载体的构建通过提取玉米大斑病菌模式菌株01-23的总RNA反转获得的cDNA为模板，利用特异引物STK1-F1/STK1-R和STK1-F2/STK1-R进行PCR获得大约1 071 bp的STK1-A和含有Kozak序列的STK1-B基因序列；以pEGFP-N1为模板，利用EGFP基因特异引物进行PCR获得726 bp的绿色荧光蛋白的基因序列。首先将质粒pPIC3.5K和EGFP基因同时进行EcoRⅠ和NotⅠ限制性内切酶酶切、回收和连接最终获得pPIC3.5K-EGFP质粒。再分别对STK1-A (或STK1-B)基因和质粒pPIC3.5K-EGFP的EcoRⅠ和NotⅠ酶切、回收和连接，获得了pPIC3.5K-STK1-EGFP(A) (或pPIC3.5K-STK1-EGFP(B))表达载体。经过对pPIC3.5K-EGFP、pPIC3.5K-STK1-EGFP(A)和pPIC3.5K-STK1-EGFP (B)表达载体的酶切鉴定，3种表达载体结构正确(图 1)，经过生工生物工程(上海)股份有限公司测序，确定3种载体序列正确。
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| 图 1 质粒酶切鉴定 Figure 1 Enzyme digestion of plasmid. 1: pPIC3.5K-EGFP plasmid double digested by EcoRⅠand NotⅠ; 3: pPIC3.5K-STK1-EGFP(A) plasmid double digested by EcoRⅠ and ApaⅠ; 5: pPIC3.5K-STK1-EGFP(B) plasmid double digested by EcoRⅠ and NotⅠ; 2, 4 and 6: pPIC3.5K-EGFP, pPIC3.5K-STK1-EGFP(A) and pPIC3.5K-STK1-EGFP(B) digested by NotⅠ; M: DNA marker-Q. |
| 图选项 |
3.2 EGFP和STK1-EGFP酵母转化子筛选和鉴定通过电击转化，分别将pPIC3.5K-EGFP、pPIC3.5K-STK1-EGFP(A)和pPIC3.5K-STK1-EGFP(B)表达载体转入毕赤酵母GS115中，通过在筛选培养基(MD)上的培养，获得GS115-EGFP、GS115-STK1-EGFP(A)和含有KozaK序列的GS115-STK1-EGFP(B) 3种转化子。经过在组氨酸缺失的MD培养基培养，发现转化子的生长速度显著高于野生型，表明3种载体转入了酵母基因组中，并得到了正常表达(图 2A)。分别利用EGFP和STK1的引物对转化子进行PCR鉴定，结果显示GS115-EGFP转化子中能够获得717 bp左右的特异片段；GS115-STK1-EGFP(A)、GS115-STK1-EGFP(B)转化子也能够扩增出1 071 bp左右的STK1基因片段(图 2B)。
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| 图 2 酵母转化子的MD筛选(A)和PCR (B)鉴定 Figure 2 Screening and PCR identification of yeast transformation. 1-2: GS115-EGFP transformation; 3-4: GS115-STK1-EGFP(A) transformation; 5-6: GS115-STK1-EGFP(B) transformation; M: DL2000. |
| 图选项 |
3.3 EGFP及STK1-EGFP融合基因mRNA的检测试验提取了酵母野生型GS115及其转基因转化子的总RNA，并通过Oligo(dT)18反转录成总cDNA。利用EGFP和STK1特异性引物分别对4种酵母总cDNA进行了检测，在酵母野生型GS115和GS115-EGFP转化子中没有检测到STK1的mRNA，但是GS115-EGFP、GS115-STK1-EGFP(A)和GS115-STK1-EGFP(B)转化子中检测到了721 bp的EGFP基因(图 3A)，而在酵母野生型GS115和GS115-EGFP(A)转化子中没有检测到STK1基因的mRNA，但是GS115-STK1-EGFP (A)转化子和GS115-STK1-EGFP(B)转化子中检测到了大约1 071 bp的STK1基因(图 3B)。
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| 图 3 甲醇诱导酵母的EGFP (A)和STK1 (B)基因的mRNA检测 Figure 3 mRNA detection of EGFP (A) and STK1 (B) genes in transgenic yeast cells induced by methanol. 1: GS115; 2: GS115-EGFP transformation; 3: GS115-STK1-EGFP(A) transformation; 4: GS115-STK1-EGFP(B) transformation; M: DL2000. |
| 图选项 |
3.4 STK1-EGFP融合蛋白在酵母中的荧光观察3.4.1 Kozak序列对STK1-EGFP融合蛋白表达载体的影响在激光共聚焦显微镜下观察GS115-STK1-EGFP(A)和GS115-STK1-EGFP(B)转化子发现，GS115-STK1-EGFP(B)转化子的荧光强度显著高于GS115-STK1-EGFP(A)转化子，利用Image J软件分析发现GS115-STK1-EGFP(B)转化子绿色荧光强度约为前者的4.8倍。表明在STK1-EGFP融合基因起始密码子前加入Kozak序列(CCCACC)显著增强了融合蛋白表达的强度(图 4)。
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| 图 4 Kozak序列对STK1-EGFP融合蛋白在酵母中表达荧光强度的影响 Figure 4 Effect of Kozak sequence on the fluorescence intensity of STK1-EGFP fusion protein in yeast. |
| 图选项 |
3.4.2 STK1-EGFP融合蛋白在毕赤酵母中的荧光观察分别在明场和蓝光激发的情况下观察转基因酵母的形态发现：GS115在激发条件下没有发现荧光，而GS115-EGFP和GS115-STK1-EGFP(B)转化子的细胞中发现了清晰的绿色荧光，但是，与GS115-EGFP转化子相比，GS115-STK1-EGFP(B)转化子的荧光在细胞内局部区域呈现集聚态(图 5)。以上结果表明了EGFP蛋白和STK1-EGFP融合蛋白在酵母细胞中得到了正确表达，且STK1融合EGFP蛋白后并未影响EGFP的结构和功能；GS115-STK1-EGFP(B)转化子中荧光状态显著区别于GS115-EGFP转化子，推测是由于STK1蛋白与酵母中Hog1信号蛋白具有结构和功能相似性[6, 13]，STK1蛋白参与了Hog1信号蛋白的部分生理功能。
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| 图 5 不同转化子在明场和蓝光激发条件下的荧光结果 Figure 5 Fluorescence of different transformation under the conditions of bright field and blue light. |
| 图选项 |
4 讨论大量研究表明，在动物、植物、真菌中MAPK级联途径是一条重要的细胞信号传导途径[14]，这些途径调控着组织形态发生、细胞增殖和分化以及适应性免疫等一系列生理反应[15-17]。在植物与病原真菌互作的过程中，病原真菌的MAPK级联途径参与调控其致病相关的过程，其中包括病菌分生孢子形成、附着胞发育及其侵入与定殖等[18-19]。
本试验克隆了玉米大斑病菌STK1基因，构建了STK1基因和绿色荧光蛋白基因EGFP融合基因的表达载体pPIC3.5K-STK1-EGFP(A)和含有Kozak序列的pPIC3.5K-STK1-EGFP(B)，并经过了酶切鉴定和测序分析，证明了表达载体序列准确。然后通过电击转化和营养缺陷培养基(MD培养基)初步筛选出了对应的酵母转化子；利用对转化子基因组DNA中EGFP基因和STK1基因的PCR扩增及其mRNA的RT-PCR检测，确定STK1-EGFP融合基因在插入了毕赤酵母基因组DNA中并能够正常转录；最后，试验利用激光共聚焦显微镜观察，发现融合基因表达蛋白在毕赤酵母细胞中发出绿色荧光。
Kozak序列是提高基因表达的一个上游调控元件[20]，能够调控起始翻译过程，并且能决定翻译效率[21]。本试验通过构建pPIC3.5K-STK1-EGFP(A)和含有Kozak序列的pPIC3.5K-STK1-EGFP(B)，并通过转化毕赤酵母，获得了相应的转化子GS115-STK1-EGFP(A)和GS115-STK1-EGFP(B)。荧光显微镜观察显示GS115-STK1-EGFP(B)转化子的荧光强度约是GS115-STK1-EGFP(A)的4.8倍。表明构建融合基因表达载体pPIC3.5K-STK1-EGFP(B)适用于毕赤酵母中诱导表达，且利于形成稳定、高效表达融合蛋白的转化子。
外源蛋白质在毕赤酵母中表达不仅可以用于蛋白功能的研究，而且在相关蛋白的晶体研究和抗体制备方面具有重要作用，例如张凯星等通过在酵母表达香蕉MaGBSSⅠ-3蛋白研究其生化特征[22]；Huo等在毕赤酵母GS115中表达源于维氏气单胞菌几丁质酶Chi92基因并研究其活性[23]；蔡立涛等[24]在毕赤酵母GS115中表达纳豆激酶(NK)基因用于制备NK的抗体。虽然利用毕赤酵母表达系统获得外源重组蛋白技术已经被广泛应用[25]，但是研究发现毕赤酵母外源蛋白的产率较低[26-27]。Nocon等通过构建葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(ZWF1)和葡糖酸内酯酶(SOL3)过表达毕赤酵母转化子可以使酵母中人血超氧岐化酶(hSOD)的产率提高3.8倍[28]。在本研究中仅利用构建的含有Kozak序列的表达载体转化毕赤酵母，可以使GS115-STK1-EGFP(B)转化子STK1-EGFP融合蛋白产率提高4.8倍。本研究将为我们明确玉米大斑病菌STK1蛋白的细胞功能定位、STK1蛋白抗体制备奠定了基础；为提高外源蛋白在毕赤酵母中产率的研究提供参考。
5 结论本实验构建了适于在毕赤酵母GS115中表达的载体pPIC3.5K-EGFP和pPIC3.5K-STK1-EGFP，建立了适宜本实验要求的毕赤酵母转化体系，筛选出了酵母转化子；利用RT-PCR技术检测了诱导酵母菌的STK1和EGFP基因的mRNA情况；利用激光共聚焦荧光显微镜在转基因酵母检测到STK1-EGFP融合蛋白的荧光信号，证明了STK1蛋白在GS115中稳定、高效表达。
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