1 集美大学 食品与生物工程学院，福建 厦门 361021;
2 厦门市食品科技研发检测中心，福建 厦门 361021
收稿日期：2016-07-15;接收日期：2016-11-7; 网络出版时间：2017-02-13 基金项目：福建省自然科学基金(No. 2015J01614)，厦门市科技计划项目(No. 3502Z20133012) 资助
摘要： 数字PCR是继实时定量PCR之后新兴发展起来的一种绝对定量分析技术。通过将单个DNA分子转移入独立的反应室，PCR扩增反应后，对荧光信号进行检测分析，实现单分子的绝对定量。数字PCR技术摆脱了对标准曲线的依赖，具有更高灵敏度和准确度，在基因突变检测、拷贝数变异检测、微生物检测、转基因食品检测以及下一代测序等方面均得到广泛应用。本文介绍数字PCR技术的定量方法，并评述该技术在主要应用领域的研究进展。
关键词： 数字PCR 绝对定量 泊松分布 突变检测 拷贝数变异检测 微生物检测 转基因食品检测
Progress in digital PCR technology and application
Jiaqi Lin1, Guocheng Su1,2, Wenjin Su1,2, Changyi Zhou1,2
1 College of Food and Bioengineering, Jimei University, Xiamen 361021, Fujian, China;
2 Xiamen Food Research and Inspection Centre, Xiamen 361021, Fujian, China
Received: July 15, 2016; Accepted: November 7, 2016; Published: February 13, 2017
Supported by: Natural Science Foundation of Fujian Province (No. 2015J01614), Science and Technology Project of Xiamen (No. 3502Z20133012)
Corresponding authors:Changyi Zhou. Tel: +86-592-6181487; E-mail: chyizhou@163.com
Abstract: Digital PCR is an emerging analysis technology for absolute quantification after realtime-PCR. Through digital PCR, single DNA molecules are distributed into isolated reactions, and the product with fluorescence signal can be detected and analyzed after amplification. With the advantages of higher sensitivity and accuracy, digital PCR, independent of a standard curve, is developing rapidly and applied widely to the next generation sequencing and detection fields, such as gene mutation, copy number variation, microorganism, and genetically modified food. In this article, we reviewed the quantitative method and research progress of digital PCR technology in the main application fields.
Key words: digital PCR absolute quantification poisson distribution mutation detection copy number variation detection microbial detection genetically modified food detection
1999年，美国****Kenneth Kinzler与Bert Vogelstein首次提出了“数字PCR (Digital PCR，dPCR)”的概念[1]，该技术实现了核酸拷贝数绝对定量的突破。其主要特点之一在于将目标分子分散入单个反应室中，使每个反应室中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子，是实现数字PCR高灵敏度和高准确度的关键。
1 技术原理数字PCR主要原理是将单个DNA分子置于独立的反应室中，并对其进行PCR扩增，利用TaqMan?化学试剂及染料标记探针检测特定的靶序列，通过呈现两种信号类型的反应单元比例和数目进行统计学分析，实现样品的绝对定量。因此，数字PCR也称单分子PCR，其检测过程主要包括两部分内容，即PCR扩增和荧光信号分析。在PCR反应前，将样品分散至几万个单元(反应室) 中，使每个单元中只存在单个DNA分子。PCR扩增阶段的扩增程序、扩增体系与普通PCR并没有什么不同。在荧光信号分析阶段，采用终端检测，是对每个反应单元的荧光信号进行采集，然后直接计数或者借用泊松统计得到样品的原始浓度或含量(图 1)。与实时荧光定量PCR不同的是，整个数字PCR过程不需要扩增标准曲线和看家基因，具有良好的准确度和重现性，可以实现真正意义上的绝对定量。
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| 图 1 数字PCR原理[2] Figure 1 The schematic diagram of digital PCR[2]. |
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基于分液方式的不同，数字PCR主要分为3种：微流体数字PCR (Microfluidic digital PCR，mdPCR)、微滴数字PCR (Droplet digital PCR，ddPCR) 和芯片数字PCR (Chip digital PCR，cdPCR)。分别通过微流体通道、微液滴或微流体芯片实现分液，分隔开的每个微小区域都可进行单独的PCR反应，其中mdPCR基于微流控技术，对DNA模板进行分液，微流控技术能实现样品纳升级或更小液滴的生成，但液滴需要特殊吸附方式再与PCR反应体系结合，mdPCR已逐渐被其他方式取代；ddPCR技术，是相对成熟的数字PCR平台，利用油包水微滴生成技术，目前的仪器主要有Bio-rad公司的QX100/QX200微滴式dPCR系统和RainDance公司的RainDropTM dPCR系统，其中Bio-rad公司的dPCR系统利用油包水生成技术将含有核酸分子的反应体系生成20 000个纳升级微滴，经PCR扩增后，微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测；cdPCR利用微流控芯片技术将样品的制备、反应、分离和检测等集成到一块芯片上，目前的仪器主要有Fluidigm公司的Bio-Mark?基因分析系统和Life Technologies公司的QuantStudio系统。利用集成流体通路技术在硅片或石英玻璃上刻上许多微管和微腔体，通过不同的控制阀门控制溶液在其中的流动来实现生物样品的分液、混合、PCR扩增，实现绝对定量。
2 数字PCR的优势传统PCR技术是将目的基因经过PCR扩增循环，一个DNA分子模板复制成成千上万的子代双螺旋，然后用凝胶电泳进行检测。但是，凝胶电泳检测只能对扩增产物的分子大小进行判断，而无法推断出起始样品中DNA的含量，因此无法进行定量分析；实时荧光定量PCR可以进行绝对定量和相对定量，其中绝对定量是用一系列已知浓度的标准品制作标准曲线，在相同的条件下目的基因测得的荧光信号量同标准曲线进行比较，从而得到目的基因的量，标准品可选择纯化的质粒DNA或体外合成的ssDNA等，相对定量通过内参等进行换算起始样品中DNA的相对含量。数字PCR是基于传统PCR、实时荧光定量PCR基础上发展起来的第3代PCR技术，它不需要标准品，也不要制作标准曲线，即能实现更灵敏、更准确的绝对定量。
数字PCR高精确度的另一个重要因素是将泊松统计引入数字PCR的检测应用中。由于数字PCR是一种终端检测的分析方法，如果目标分子没有得到很好的离散，在一个反应室中不止存在一个靶DNA，那么得到的浓度便不可信。泊松统计是对随机分布的一种描述方法，当反应室/液滴量和其中阴性比例已知，即可通过泊松模型获得初始浓度。所以，如果反应室没有达到饱和，研究者也可以计算样品的起始分子数。Beer等的研究表明，基于液滴方法的优势在于其可扩大性，增加反应容器的数量，数据的质量也就随之增大[3]。即当扩大或增加了反应容器的数量时，泊松精度也随之提升。
同时，数字PCR能够有效避免反应抑制剂的影响。随着反应室的增加，反应受到抑制剂的影响就越小。
3 数字PCR的应用在Web of Knowledge平台Science Citation Index Expanded数据库中搜索1999年至2016年6月间“digital PCR，dPCR”关键词(截止至2016年6月25日)，搜索结果显示，共有1 787篇相关文献，针对其中1 405篇article类文章进行文献统计分析。如图 2表明，与数字PCR相关的研究文章数量逐年增加，而且自2010年起每年论文数的增加量迅猛；在众多国家中，美国和中国是数字PCR研究大军中的主要国家(图 3)。据Kalorama Information发布的研究报告显示，2019年全球数字PCR和qPCR市场预计将达到39.7亿美元，中国是最主要的新兴市场[4]。
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| 图 2 SCIE数据库统计1999?2016年间全球数字PCR论文发表量 Figure 2 Number of published papers on digital PCR from 1999 to June 2016 according to SCIE. |
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| 图 3 数字PCR论文发文量排在前十位的国家 Figure 3 Top 10 countries which ranked in the number of published papers on digital PCR. |
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3.1 在突变检测方面的应用常规组织和血液等样品中，由于单个突变的体细胞含量低，使得检出其的存在变得困难。而dPCR可对复杂的大背景进行有限的稀释或分区，通过有限稀释，降低野生基因型的背景信号，使得低丰度的目的序列能够被灵敏的检出，特别适用于稀有突变的检测应用。研究表明，低至1/100 000的变异频率能被检测出来[5-6]。并且随着反应室数量的增加，对稀有变异的分析更灵敏。
dPCR在稀有突变检测方面有广泛的应用和研究，尤其是与癌症相关的检测和定量研究，如EGFR[7]、BRAF[8]、KRAS[9]、PIK3CA[10-11]、JAK2[12]和miRNAs[13]等。PIK3CA可由IGF-1、HGF、EGF等生长因子激活，与生长因子一同作用于受体酪氨酸激酶，促进增殖、血管生成和细胞的新陈代谢。Kim等用ddPCR对血清中游离的DNA进行PIK3CA突变的检测分析[10]，血清中低丰度的PIK3CA突变成功被检测出来。对38份转移性胆道癌样品进行试验，匹配的一份血清样品PIK3CA p.E542K对28突变拷贝呈阳性，相当于48 copies/mL血清和0.3%的等位基因的患病率；另一血清样品PIK3CA p.H1047R对10突变拷贝呈阳性，相当于18 copies/mL血清和0.2%的等位基因的患病率。Miotto等研究表明EvaGreen染料法和TaqMan探针法均可用于人体血浆和血清中循环miRNA的ddPCR检测定量[14]。
3.2 在拷贝数变异检测方面的应用通常基因表达分析依赖于琼脂糖凝胶电泳、realtime PCR等方法，拷贝数的确定总是受到限制。而使用dPCR进行直接计数目标基因和参照基因的双重反应，通过计算比值，便直接得到目标基因的拷贝数[15-17]。
影响HIV感染和疾病进展的CCL3编码基因拷贝数变异(Copy number variations，CNV) 的发现引起广泛的争议，已经在一定程度上归因于拷贝数评估方法获得的不同结果。CCL3基因编码CC趋化因子CCL4，也是CCR5受体的自然配体，对HIV-1起到了保护作用。Bharuthram等用标准方法qPCR和ddPCR对CCL4L基因拷贝数进行评估测定[18]。研究表明，与qPCR (r=0.87，P < 0.000 1) 相比，由ddPCR测得CCL4L拷贝与CCL4L1和CCL4L2拷贝之和具有良好的相关性(r=0.99，P < 0.000 1)。而qPCR在高拷贝数时出现准确性明显下降。Whale等模拟不同CNVs的HER2基因扩增，相同试验条件下，dPCR能够检测比qPCR更低的CNVs[19]。由于dPCR准确度与扩增大小和模板浓度是直接相关性的，他们也建立了用于测量CNV的dPCR方法。利用泊松和二项分布，得出dPCR的方差表达式。
3.3 在微生物检测方面的应用核酸扩增技术是病原微生物检测的一个重要方法，但可能存在的问题是，有时候低水平目标分子和小分子抑制剂的存在使得检测定量的结果发生偏移。dPCR则是一种不需要标准曲线并且对部分抑制剂不灵敏的检出方法。因此，研究人员纷纷将其应用于一些病毒或致病菌的检测研究中，如HBV[20-21]、肠病毒[22]、腺相关病毒[23]、巨细胞病毒[24]、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌[25]、结核分支杆菌[26]、产志贺毒素大肠杆菌[27]等。Strain等采用ddPCR和qPCR对HIV经过联合抗逆转录病毒疗法治疗的病人体内残留的DNA进行检测，研究发现，ddPCR具有更高的精确度和更低的拷贝变异系数[28]。Dong等对E. coli O157:H7的rfbE基因建立ddPCR，优化探针浓度，在20 μL体系中，对E. coli O157:H7基因组DNA的检测范围为4?1.25×105copies，线性相关系数为0.999[29]。同时用ddPCR和qPCR对16份实际样品进行检测得到相同结果。
在环境检测方面，dPCR也得到相应的应用[30-31]。Josefa等在对土壤、植物根茎样品中烟草疫霉菌的低拷贝DNA定性定量的研究发现，与qPCR相比，dPCR对反应抑制剂更不敏感[32]。由于基于标准曲线的realtime PCR方法在检测方面带来的偏差，Cao等利用双重ddPCR同时检测粪源和水质中的肠球菌和人源粪便相关标记HF183[33]。qPCR中双重的肠球菌和HF183相互竞争使得其无检出或超出其单重最低检测浓度范围，而ddPCR的单重和双重检测结果一致。其对抑制剂的较高耐受性、重复性、检测灵敏度以及准确度均比qPCR高，但是其定量上限较realtime PCR低。Anja等将ddPCR与qPCR联合起来使用，用ddPCR制备标准曲线，用realtime PCR进行定量，成功实现对不同生物膜形成时期的单增李斯特菌定量检测[34]。
3.4 在转基因食品检测方面的应用欧盟国家对转基因食品有着严格的限定，而目前，一般采用实时定量PCR用于商品中转基因的分子定量分析。但是在一些复杂的食物原料和饲料原材料中，目标DNA非常少，使得对其的检测和定量受到限制。dPCR为国内外研究人员提供了新的方法。Morisset等用ddPCR对MON810转基因和hmg玉米参考基因进行绝对定量[35]。研究表明，ddPCR对低浓度的检测具有更高的重复性，并且对抑制剂具有更高耐受性。Dobnik等用多重ddPCR检测定量12个欧盟授权转基因玉米，对于含转基因组织样品中，该方法比实时定量PCR更高通量、更高效[36]。Damira等建立双重ddPCR用于检测定量转基因玉米中T-nos/hmg基因的拷贝数比例，通过中心复合设计优化，并在体系中加入DNA消化酶减小检测偏差，所建立的方法T-nos检测限为11拷贝，T-nos /hmg比例的动态范围为0.08%-100%[37]。
3.5 在下一代测序方面的应用下一代测序(NGS) 又叫高通量测序，是测序技术革命性的进步，能一次上百万条DNA分子进行序列测定，使得对一个物种的转录组和全基因组进行细致全貌的分析成为现实。dPCR平台可以与NGS对接，实现对测序文库的质量控制、提供对测序文库的定量分析和质量评估信息。一方面，dPCR对NGS的测序结果进行验证，对诸如单核苷酸多态性，突变及拷贝数变异在内的基因组变异进行验证，确保测序结果的可信度；另一方面，所得到的结果还包含反映测序文库质量的信息，如接头与接头二聚体、错误连接片段、过长连接片段等，这是当前其他方法所不具备的优势。Alikian等研究表明，在慢性粒细胞白血病患者的检测中，dPCR比qPCR更准确，定量分析结果可靠性高、重复性好[38]。
4 展望dPCR与普通PCR、qPCR相比具有独特的技术优势，实现了单分子DNA绝对定量，使其成为了分子生物学研究中的重要工具，研究者对其应用分析也日益关注。近期，相应的分析软件有所突破，美国已推出一款ddpcr软件可用于使用者分析dPCR数据，免费在线网址为https://daattali.com/shiny/ddpcr/[39]。软件及网站的建立为dPCR技术的推广和应用提供重要支持。
未来如果能有效解决dPCR耗材成本高、实验通量少等问题和实现操作智能化，dPCR将在临床诊断与治疗、微生物检测和食品安全检测等方面拥有更广阔的应用前景。
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