西南大学 家蚕基因组生物学国家重点实验室，重庆 400716
收稿日期：2016-07-18;接收日期：2016-09-20 基金项目：国家重点基础研究发展计划(973计划) (No. 2012CB114600)，重庆市基础与前沿研究计划项目(No. CSTC2014JCYJA80010) 资助
摘要： 表皮生长因子受体(EGFR) 是广泛存在于后生动物中的多功能受体，其配体的种类、活化方式、配体与EGFR之间的相互作用以及激活的信号通路在哺乳动物中研究得较为深入。而非脊椎动物中，EGFR配体在各物种间差异较大，目前缺乏对除果蝇以外的其他昆虫EGFR配体的认识。通过同源比对、结构域预测、mRNA翻译起始序列分析和系统进化树构建，在家蚕中鉴定到2个EGFR的配体，命名为BmEGF-1和BmEGF-2。BmEGF-1与果蝇Spitz有较高的同源性和一致的Rhomboid识别序列，BmEGF-2为Vein的同源分子。经原核表达和纯化获得了BmEGF-1胞外区段，利用Sf9细胞分泌BmEGFR胞外区段，并通过pull-down实验验证了两者之间存在相互作用。在BmE细胞中表达BmEGF-1后，通过Western blotting检测到ERK和p38 MAPK的磷酸化水平增强，说明其不仅能激活经典的ERK信号通路，还可能通过p38 MAPK信号通路参与其他生理过程，为进一步研究EGFR配体在家蚕中的生物学功能提供了参考。
关键词： 家蚕 表皮生长因子受体 配体 蛋白互作 信号通路
Identification and characterization of epidermal growth factor receptor ligands in Bombyx mori
Fei Wang, Shifeng Dong, Liang Song, Qingyou Xia
State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Southwest University, Chongqing 400716, China
Received: July 18, 2016; Accepted: September 20, 2016
Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2012CB114600), Basic Research Program of Chongqing Municipality (No. CSTC2014JCYJA80010)
Corresponding authors:Qingyou Xia. Tel: +86-23-68251996; Fax: +86-23-68250099; E-mail: xiaqy@swu.edu.cn
Abstract: Epidermal growth factor receptor (EGFR) is a multi-functional receptor distributed throughout the metazoa. Study on its ligands so far remained mainly on mammals, including how ligands are processed into active forms, their interaction with EGFR, and the signaling pathway they induce. However, in invertebrates, ligands are more divergent among species. Currently, except for Drosophila, less is known about the insect EGFR ligands. Here, we identified two EGFR ligands in Bombyx moriby homology search, domain prediction, analysis of the potential translation initiation sequence and construction of phylogenetic tree, termed as BmEGF-1 and BmEGF-2. BmEGF-1 shows the greatest similarity to Drosophila Spitz and their Rhomboid-recognition motifs are highly identical. BmEGF-2 is a homolog to Drosophila Vein. Then we purified BmEGF-1 extracellular domain expressed in E. coli, and performed pull-down assay with BmEGFR extracellular domain secreted by Sf9 cells. The result confirmed their interaction. Lastly, we found the phosphorylation level of ERK and p38 MAPK was elevated after expression of BmEGF-1 in BmE cells, which suggested that BmEGF-1 is not only able to activate the canonical ERK signaling pathway, but may participate in other cellular processes by inducing p38 MAPK signaling pathway. Our study provides reference to further study of the biological function of BmEGF in silkworm.
Key words: Bombyx mori epidermal growth factor receptor ligand protein-protein interaction signaling pathway
普遍存在于后生动物中的表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor，EGFR) 具有调控细胞增殖、迁移和分化的功能，参与包括器官发育、机体生长和生殖、创口修复等一系列重要的生理过程，因此EGFR及其配体之间的相互作用和由此激活的信号通路，是后生动物尤其是哺乳动物中研究得最为广泛和深入的受体-配体组合之一。
哺乳动物EGFR有7个配体，分别是EGF、transforming-growth factor-α(TGFα)、amphireguin (AR)、betacelluin (BTC)、heparin-binding EGF (HB-EGF)、epiregulin (EPR) 和epigen，组成EGF相关蛋白家族(EGF-related protein family)[1]。该家族成员均为Ⅰ型跨膜蛋白，其胞外区具有一个或多个EGF基序；该基序由35-40个氨基酸残基组成，其中6个半胱氨酸残基遵循保守的排列方式，即CX7CX3-5CX10-12CXCX8C，并形成3个链内二硫键C1-C3、C2-C4和C5-C6。EGFR配体胞外区段经由锚定在细胞质膜上的解整合素金属蛋白酶ADAM (A disintegrin and metalloprotease) 裂解而释放，从而结合EGFR并激活下游信号通路[2]。
与哺乳动物相比，非脊椎动物EGFR配体的数目较少，物种间的变异度较大。例如在秀丽线虫Caenorhabditis elegans中仅发现1个EGFR配体，Lin-3[3]；在黑腹果蝇Drosophila melanogaster中则鉴定到5个，分别为Spitz、Keren、Gurken、Vein和Argos[4]。其中Argos并非与果蝇EGFR (DER) 直接结合，而是与Spitz形成复合体后使其无法与DER相结合从而阻止了Spitz对EGFR信号通路的激活，因此Argos并非一个典型的EGFR配体[5]；而在同为双翅目的冈比亚按蚊Anopheles gambiae中则未鉴定到Keren和Gurken[6]。实际上Spitz、Keren和Gurken均为哺乳动物TGFα的同源分子，特别是Spitz与Keren在进化上具有较近的亲缘关系，因此Keren也曾一度被命名为Spitz-2；而Vein则为哺乳动物neuregulin的同源分子。作为DER的配体，这些分子均具有1个EGF基序；除Vein是以分泌蛋白的形式合成外，其余分子均为Ⅰ型跨膜蛋白，而其胞外区的裂解方式与哺乳动物EGFR配体大相径庭。以DER的主要激活配体Spitz为例，内质网膜上的Spitz在Star蛋白的协助下转运到高尔基体，并在此由7次跨膜丝氨酸蛋白酶Rhomboid (Rho) 裂解后被运输和释放到细胞外。
EGFR为受体型酪氨酸激酶，其胞外区段具有2个配体结合结构域(L结构域) 以及2个富含半胱氨酸的结构域(CR结构域)，该4个结构域的排列方式从N端开始为L1-CR1-L2-CR2，胞内区段包含酪氨酸激酶结构域(TK结构域) 以及对分子活性具有关键作用的C末端酪氨酸残基[7]。L结构域一旦与配体结合后即促使EGFR胞外区段发生构象变化，暴露CR结构域中的二聚化位点从而导致EGFR的二聚化。随着二聚体的形成，其胞内TK结构域转变为活化构象，C末端特定酪氨酸残基发生磷酸化，招募多种信号分子，激活不同的信号传递通路，其中一条重要的通路为Ras/ERK信号通路[8]。该通路始于具有SH2(Src homology 2) 结构域的Shc和Grb2结合到EGFR磷酸化的酪氨酸序列上，并与鸟苷酸交换因子Sos形成复合体活化Ras，Ras随后活化Raf，最终激活ERK。该信号通路是EGF-EGFR发挥绝大部分生理功能所必需的。另外，对于某些类型的细胞，如肠道上皮细胞和卵巢颗粒细胞瘤细胞，EGF等配体激活p38 MAPK信号通路，从而促使肠道上皮细胞在伤口愈合过程中由增殖转而迁徙以及肿瘤细胞的转移[9-10]。
目前，对果蝇以外的其他昆虫EGFR配体的认识较少，其类型和功能均未知。本研究从鳞翅目昆虫的模式生物--家蚕入手，通过多序列比对和结构域分析鉴定家蚕EGFR配体，通过检测候选蛋白是否与家蚕EGFR (BmEGFR) 存在互作以及是否激活家蚕细胞MAPK信号通路来验证其作为配体的功能，为更深入研究这些蛋白在家蚕个体发育和生殖中的作用奠定基础。
1 材料与方法1.1 材料与主要试剂实验所用家蚕品种为大造，由西南大学家蚕基因库提供。实验所用家蚕胚胎细胞系BmE，由本实验室保存；无血清培养基培养的Sf9细胞系购自Thermo Fisher Scientific公司。
RNase抑制剂和反转录试剂盒均购自Promega公司；Total RNA Kit购自OMEGA公司；Tubulin抗体、HRP标记山羊抗小鼠抗体、HRP标记山羊抗兔抗体、DEPC水、彩色预染蛋白质分子量标准均购自碧云天公司；His标签抗体、HA标签抗体、磷酸化ERK和p38 MAPK抗体均购自Sigma公司；X-tremeGENE HP DNA细胞转染试剂购自Roche公司；Grace昆虫细胞培养基、Sf-900TM Ⅲ无血清培养基(SFM)、Cellfectin转染试剂和ECL化学发光检测试剂盒均购自Thermo Fisher Scientific公司。
1.2 家蚕EGFR配体的生物信息学分析从NCBI下载黑腹果蝇Spitz (GenBank Accession No.NP_599118)、Keren (NP_524129)、Gurken (NP_476568)、Vein (NP_523942) 和Argos (NP_524107) 的序列，并在NCBI和家蚕基因组数据库SilkDB (http://www.silkdb.org/silkdb/) 中进行BLAST搜索和比对，用SMART软件(http://smart.embl-heidelberg.de/) 对候选分子进行功能域预测。采用MEGA 6.0软件构建系统发生树，选择Neighbor-Joining进化分析法，以JTT matrix-based模式进行Bootstrap检测1 000次。采用的序列包括光肩星天牛Anoplophora glabripennisAgSpitz (JAB60801)、冬尺蠖蛾Operophtera brumata ObSpitz (KOB78754)、梭鱼草蜂Dufourea novaeangliae DnSpitz (KZC07024)、埃及伊蚊Aedes aegypti AeSpitz (XP_001660618)、家蝇Musca domestica MdSpitz (XP_005182447)、赤拟谷盗Tribolium castaneum TcKeren (EFA01327)、白纹伊蚊Aedes albopictus AaKeren (JAC09959)、茄科果实蝇Bactrocera latifrons BlGurken (JAI51163)、铜绿蝇Lucilia cuprinaLcGurken (KNC29771)、冬尺蠖蛾ObVein (KOB67206)、冈比亚按蚊Anopheles gambiae AgVein (XP_001237118)、人Homo sapiens HsTGFα(NP_003227)。
1.3 BmEGF-1的克隆、表达和纯化1.3.1 BmEGF-1的克隆和表达载体构建取胚胎期第5天的蚕卵，液氮研磨后，用Trizol法提取总RNA，用反转录试剂盒反转录为cDNA。根据生物信息学分析鉴定到的家蚕EGFR配体(BmEGF-1，NCBI登录号为XP_004926209) 的编码序列和结构特征，设计引物BmEGF-1-F、BmEGF-1-R和BmEGF-1act-F、BmEGF-1act-R (表 1)，经PCR扩增分别得到编码C端带有HA标签的BmEGF-1及其胞外区段的核酸序列。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃再延伸7 min，12 ℃保存。PCR产物经BamH Ⅰ和Not Ⅰ酶切后分别连接到真核表达载体pSL1180和原核表达载体pGEX-4T-1中，并予以测序验证。
表 1 引物序列Table 1 Primer sequences
| Primer name | Primer sequences (5′-3′) |
| BmEGF-1-F | CGCGGATCCATGCGAGCAAAGGA TTCCTGTT |
| BmEGF-1-R | TTGCGGCCGCCTAAGCGTAGTCTG GGACGTCGTATGGGTAGTGCGGCTGGTGCGAAACG |
| BmEGF-1act-F | CGCGGATCCATGCCGCAGCCCCA ACCG |
| BmEGF-1act-R | TTGCGGCCGCCTAAGCGTAGTCTG GGACGTCGTATGGGTACACATACGAGTTGTCCAGGTCC |
| BmEGFRECD-F | AAGGATCCATGGTCGCTGCTCGTGCCTT |
| BmEGFRECD-R | TTGCGGCCGCTCAATGGTGATGG TGATGATGTTGTTCATCAAAATATATTTTA |
| The BamH Ⅰ and Not Ⅰ recognition sites are underlined, the HA tag sequence is in italic, the His tag sequence is in bold. | |
表选项
1.3.2 BmEGF-1胞外区段的原核表达将重组质粒pGEX-4T-1-BmEGF-1act转化到大肠杆菌Transetta (DE3) 表达菌种中，筛选阳性克隆并接种到加有氯霉素和氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37 ℃培养至OD600达到0.8，用0.15 mmol/L的IPTG在16 ℃诱导20 h或在37 ℃诱导4 h后，收集菌体，用结合缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH 8.0) 重悬，并用超声波破碎，离心分离上清和沉淀，SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况。
1.3.3 BmEGF-1胞外区段的纯化确定原核表达的最适温度后，经扩大培养收集超声波破碎的上清，与GST填料4 ℃孵育4 h，用结合缓冲液清洗3次，用0.10、0.25、0.50、1、2、5和10 mmol/L还原型谷胱甘肽缓冲液进行梯度洗脱，SDS-PAGE检测纯化的效果。用10 kDa超滤管对洗脱蛋白进行脱盐处理，并置换到磷酸缓冲液PBS中，用Bradford法测定蛋白浓度。
1.4 BmEGFR胞外区段的真核表达1.4.1 BmEGFR胞外区段的真核表达载体构建取5龄第3天家蚕幼虫脂肪体，液氮研磨后，用Trizol法提取总RNA，按照反转录试剂盒说明书反转录为cDNA。根据BmEGFR(XM_004929742) 的序列以及所编码蛋白质的结构特征，设计引物BmEGFRECD-F和BmEGFRECD-R (表 1)，经PCR扩增得到编码C端带有His标签的BmEGFR胞外区段(BmEGFRECD) 的核酸序列。PCR反应条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃再延伸7 min，12 ℃保存。PCR产物连接到pEASY-T5 Zero载体，经测序验证的阳性克隆用BamH Ⅰ和Not Ⅰ酶切后，插入到pSL1180载体中，用于真核细胞表达。
1.4.2 细胞转染将Sf9细胞(1×106个/孔) 接种于6孔板中，在27 ℃用无血清培养基培养24 h后，按照Cellfectin转染试剂操作说明转染4 μg DNA。转染48 h后，收集培养基用于pull-down试验。
1.5 Pull-down试验将200 mL转染pSL1180-BmEGFRECD的Sf9细胞培养基与Ni-NTA琼脂糖珠4 ℃孵育4 h，用PBS清洗3次，加入2 μg纯化的BmEGF-1胞外区段孵育5 h后再用PBS清洗5次，将Ni-NTA琼脂糖珠重悬于SDS-PAGE上样缓冲液，并煮沸10 min，离心取上清用于Western blotting检测。
1.6 Western blotting检测对pull-down试验结果的检测，样品经SDS-PAG电泳和转膜后，用5%的脱脂奶粉封闭1 h后，用HA抗体或His抗体室温孵育1 h，TBST (150 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，0.05% Tween 20) 清洗3次后用HRP标记的羊抗小鼠抗体室温孵育1 h，再用TBST清洗5次，最后用ECL化学发光检测试剂进行显色反应。
对磷酸化蛋白的检测，使用X-tremeGENE HP DNA转染试剂在BmE细胞中转染pSL1180-BmEGF-1，24 h后与未转染的BmE细胞混合培养8 h。用细胞裂解液(100 mmol/L Hepes-NaOH，300 mmol/L NaCl，3 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EDTA，20%甘油，2% TX-100(W/V)，1%脱氧胆酸钠，0.2% SDS pH 7.5) 裂解细胞后提取总蛋白，采用BCA蛋白浓度测定法测定蛋白浓度。蛋白经12% SDS-PAGE电泳和转膜后，用5%的BSA封闭1 h后，用一抗(磷酸化ERK兔多抗、磷酸化p38 MAPK兔多抗或Tubulin小鼠单克隆抗体) 室温孵育1 h，TBST清洗3次后用相应二抗(HRP标记山羊抗兔抗体或HRP标记山羊抗小鼠抗体) 室温孵育1 h，再用TBST清洗5次，最后用ECL化学发光检测试剂进行显色反应。
2 结果与分析2.1 家蚕EGFR配体的鉴定和结构域分析BLAST搜索和比对的结果显示，NCBI登录号为XP_004926209的分子与果蝇Spitz、Keren和Gurken具有较高的同源性，其序列相似度分别达到43%、42%和28%，所包含的EGF结构域的序列相似性分别为66%、66%和56%；而登录号为XP_012545622的分子与果蝇Vein具有25%的序列相似度，其EGF结构域序列相似度达到40%。未鉴定到Argos的同源分子。
对XP_004926209进行功能域预测发现，除EGF结构域以外，其N端和C端均具有一个跨膜结构域(TM)，因此该分子结构域组成与果蝇Spitz、Keren和Gurken有所不同；而迄今为止，未见EGFR配体为两次跨膜分子的报道。对该分子的mRNA进一步分析发现，其mRNA包含2个潜在的翻译起始ATG，属同一开放阅读框，间隔132个核苷酸(图 1A)。如果从第1个翻译起始ATG开始翻译，产生长度为217个氨基酸的蛋白质，即XP_004926209；如果从第2个翻译起始ATG开始翻译，则产生长度为173个氨基酸的蛋白质。第一翻译起始ATG 5'端序列为gccg，在已确定的家蚕基因翻译起始位点中未见-3位置为c的ATG，且具有翻译起始序列为cxxATG的基因在家蚕细胞中的翻译效率较低[11]。而第2个翻译起始ATG 5'端序列为gaaa，符合家蚕基因翻译起始位点5'端序列的统计规律，因此该分子很可能从第二潜在翻译起始ATG开始翻译。对由此产生的长度为173个氨基酸的蛋白质进行结构域分析，发现其N端具有1段信号肽(SP)，C端具有1个TM，与果蝇Spitz、Keren和Gurken的结构域组成一致，为一次跨膜蛋白，将其命名为BmEGF-1(图 1B)，该分子与SilkDB中编号为BGIBMGA012584-PA的蛋白质序列相同。XP_012545622则与果蝇Vein的结构域组成相同，N端具有SP，其后依次为IGc2和EGF结构域，为分泌型蛋白质，命名为BmEGF-2(图 1C)。通过系统进化分析，进一步明确了BmEGF-1与Spitz和Keren具有高度的序列相似度，是人类TGFα的同源分子，而BmEGF-2则与Vein具有较高的同源性(图 1D)。并且Spitz在各物种间的序列变异度远低于Vein，这可能也说明了Spitz功能的高度保守性。
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| 图 1 家蚕EGFR配体的序列、结构域和系统进化分析 Figure 1 Sequence, domain and phylogenetic analysis of silkworm EGFR ligands. (A) Sequence analysis of two potential translation initiation sites. (B) BmEGF-1 domain prediction and Rho-recognition motif analysis. Arrow indicates the cleavage site by Rho. (C) BmEGF-2 domain prediction. (D) A phylogenetic tree of EGFR ligands from different species. |
| 图选项 |
果蝇Spitz、Keren和Gurken均由Rho酶切后分泌到胞外，其近跨膜区的氨基酸残基组成Rho特异性识别序列[12-13]。其中Spitz和Keren近跨膜区序列分别为KASIASGA和KASVASGA，Gurken则差异较大，而BmEGF-1近跨膜区序列为TASIAGGA，与前两者具有高度一致性，因此推测此序列能够被Rho所识别，并在特定位置裂解(图 1B)。
2.2 BmEGF-1胞外区段的原核表达和纯化为表达经Rho酶切后所产生的BmEGF-1胞外区段(BmEGF-1act)，截取SP序列之后以及Rho酶切位点前的BmEGF-1部分序列(从40到106位氨基酸)，构建了GST重组蛋白表达载体。在16 ℃和37 ℃下分别进行诱导表达后，SDS-PAGE电泳检测发现GST-BmEGF-1act重组蛋白在16 ℃诱导条件下，主要以可溶性蛋白的形式表达，而在37 ℃诱导条件下，则以包涵体的形式表达，分子量大小约为35 kDa (图 2A)。虽然在37 ℃诱导条件下，重组蛋白的表达量较在16 ℃诱导条件下产生的多，但为方便纯化和后续实验，采用了16 ℃的诱导条件进行了扩大培养。经不同浓度的还原型谷胱甘肽洗脱液进行梯度洗脱后，对流出液进行SDS-PAGE分析，结果表明5 mmol/L和10 mmol/L洗脱液中有较纯的目的蛋白(图 2B)。
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| 图 2 GST-BmEGF-1act的原核表达和纯化检测 Figure 2 SDS-PAGE analysis of the prokaryotic expression and purification of GST-BmEGF-1act recombinant protein. (A) SDS-PAGE analysis of the expression of GST-BmEGF-1act. M: protein molecular weight standard; 1-4: production of GST-BmEGF-1act at 16 ℃; 5-8: production of GST-BmEGF-1act at 37 ℃; 1, 5: supernatant without IPTG induction; 2, 6: supernatant with IPTG induction; 3, 7: cell pellet without IPTG induction; 4, 8: cell pellet with IPTG induction. Arrow indicates GST-BmEGF-1act induced by IPTG. (B) SDS-PAGE analysis of the purified proteins. M: protein molecular weight standard; 1: supernatant of cell lysates; 2: flow-through from the supernatant bound to GST resin; 3-9: elution by reduced glutathione of different concentrations; 3: 0 mmol/L; 4: 0.1 mmol/L; 5: 0.25 mmol/L; 6: 0.5 mmol/L; 7: 1 mmol/L; 8: 3 mmol/L; 9: 5 mmol/L; 10: 10 mmol/L. |
| 图选项 |
2.3 BmEGF-1和BmEGFR相互作用的检测EGFR配体与EGFR之间的相互作用仅涉及到EGFR胞外区段，因此为检测BmEGF-1是否能结合BmEGFR，我们克隆了BmEGFR的胞外区(BmEGFRECD) 并在其C端加上6×His标签，其总长度为2 367 bp，所编码蛋白质的理论分子量大小约为88 kDa，具有2个典型的EGFR L结构域和2个CR结构域及其排列方式。因在原核表达体系中该蛋白稳定性较差，对后续实验有较大影响，遂采用了Sf9真核表达体系。因仍保留BmEGFR自身的信号肽，BmEGFRECD表达后即分泌到细胞培养基中。为避免传统培养基中大量血清杂蛋白的影响，采用了无血清培养基。EGFR存在多个糖基化位点[14]，在Sf9细胞中表达的BmEGFRECD可能存在糖基化修饰，导致所表达的蛋白质分子量将比理论分子量大。通过银染可检测到转染了pSL1180-BmEGFRECD表达载体的细胞将BmEGFRECD分泌到培养基中，其分子量大于100 kDa (图 3A)。根据His标签进行Western blotting检测，证明其确实为目的蛋白(图 3B)。
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| 图 3 BmEGFRECD的真核表达和检测 Figure 3 Eukaryotic expression of BmEGFRECD. (A) SDS-PAGE analysis of BmEGFRECD in Sf9 cell culture medium detected by silver staining. 1: medium of untransfected cells; 2: medium of cells expressing EGFP (enhanced green fluorescent protein); 3: medium of cells expressing BmEGFRECD. Arrow indicates BmEGFRECD. (B) Detection of BmEGFRECD by His tag antibody. M: protein molecular weight standard; 1: medium of untransfected cells; 2: medium of cells expressing BmEGFRECD. |
| 图选项 |
利用His标签将BmEGFRECD结合到Ni-NTA琼脂糖珠上，并与纯化的BmEGF-1act重组蛋白(该蛋白C末端具有HA标签) 孵育，经多次清洗后检测BmEGF-1act和BmEGFRECD是否具有互作。Pull-down实验结果显示，虽然EGFP (增强绿色荧光蛋白) 和BmEGFRECD均能借His标签与Ni2+之间的亲和力结合到Ni-NTA上，但仅在结合了BmEGFRECD的Ni-NTA上检测到BmEGF-1act，说明两者之间存在相互作用。
EGFR配体与EGFR结合后，即激活包括MAPK在内的一系列信号通路。为进一步检测BmEGF-1是否具有激活胞内信号通路的功能，在无内源性BmEGF-1表达的BmE细胞中转染pSL1180-BmEGF-1载体，利用其C端的HA标签对其表达进行了Western blotting检测(图 5A)。结果显示，转染12 h后在细胞中检测到分子量约为20 kDa的蛋白质，符合BmEGF-1的理论分子量。转染24 h后，该蛋白的表达量明显增加；且能检测到多个裂解中间产物，其中分子量约为8 kDa的产物含量较高，推测该产物可能为经Rho酶切后的跨膜区和胞内片段。虽然没有直接检测到BmEGF-1的胞外区，但该酶切产物的出现表明胞外区片段的产生。转染36 h和48 h后，BmEGF-1和裂解产物的表达量无显著增加。
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| 图 4 Pull-down实验检测BmEGFRECD和BmEGF-1act之间的相互作用 Figure 4 Detection of the interaction between BmEGFRECD and BmEGF-1act using pull-down assay. M: protein molecular weight standard; IB: immune-blotting. |
| 图选项 |
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| 图 5 BmEGF-1的真核表达和磷酸化MAPK的检测 Figure 5 Detection of BmEGF-1 expression and MAPK phosphorylation in BmE cells. (A) Expression of BmEGF-1 in transfected BmE cells. M: protein molecular weight standard; 1: lysate of untransfected cells; 2: lysate of transfected cells harvested at 12 h after transfection; 3: lysate of transfected cells harvested at 24 h after transfection; 4: lysate of transfected cells harvested at 36 h after transfection; 5: lysate of transfected cells harvested at 48 h after transfection. Arrows indicate uncleaved and cleaved BmEGF-1 respectively. (B) Phosphorylation of p38 MAPK and ERK. Cells transfected with empty pSL1180 vector was used as control. IB: immune-blotting. |
| 图选项 |
BmE细胞本身具有内源性BmEGFR的表达[15]，因此我们将转染并表达BmEGF-1的细胞与未转染的BmE细胞混养(混养比例为1:10)，检测细胞内p38 MAPK和ERK的磷酸化水平是否变化。结果表明，两者的磷酸化水平均显著升高(图 5B)。
3 讨论本研究通过同源序列比对和分析，在家蚕中鉴定到2个EGFR配体，其中BmEGF-1与果蝇Spitz有较高的同源性和一致的Rho识别序列，BmEGF-2为Vein的同源分子。虽然在果蝇中，Spitz、Keren、Gurken和Vein这4种EGFR配体的功能存在一定的组织特异性，例如Gurken仅在卵巢生殖细胞中表达且对于卵母细胞的极性形成具有重要作用[16]，Vein则对于翅原基的发育是必需的[17]，但也有研究认为这四者的功能可能存在冗余，例如在合适的浓度下Spitz可挽救vein突变体的表型[18]，在眼的发育中Spitz和Keren可相互替代[19]。因此对于BmEGF-1和BmEGF-2在家蚕发育中的作用，需要具体到各个不同的组织或器官予以深入研究。
在S2细胞和果蝇个体中，若没有Rho和Star的共表达，Spitz无法被酶切产生胞内区段(包含跨膜区) 和释放胞外区段，Keren的酶切则能在一定程度上不依赖于Rho和Star，尽管该酶切效率较低[20]。我们在BmE细胞中检测到BmEGF-1经酶切后的跨膜区和胞内片段，说明BmE细胞中有内源性Rho和Star的表达，或者BmEGF-1也和果蝇Keren类似，其酶切可不依赖于Rho和Star。
和果蝇Spitz类似，BmEGF-1激活ERK，表明其具有典型的EGFR配体的功能。有意义的是，与此同时我们还检测到p38 MAPK磷酸化水平的升高。在哺乳动物细胞中，由EGFR配体激活的p38 MAPK调控细胞增殖和迁徙行为之间的平衡，但在果蝇中尚无此类报道。但对昆虫中一类和EGF空间结构相似而序列却全然不同的活性肽的研究发现，这类活性肽通过EGFR激活p38 MAPK信号通路，促进抗菌肽的产生和浆细胞的延展[15, 21-22]。BmEGF-1是否也具有相似的功能，需要对其所激活的转录因子或诱导表达的相关基因做进一步研究。
另外，为检测EGFR配体和EGFR之间的互作，大多数研究采用原核表达并纯化EGFR某一个或几个胞外结构域[23-24]。而EGFR胞外区富含半胱氨酸残基，存在大量的分子内二硫键，在原核表达系统中通常以包涵体的形式产生或较易降解。在验证果蝇Gurken和DER的结合时，采用了酵母表达DER的胞外片段和Far-Western blotting实验，但其中仍涉及变复性过程[25]。为确保蛋白具有正确的构象和活性，我们采用了无血清培养的Sf9细胞表达BmEGFR胞外区段和pull-down实验验证BmEGFR与BmEGF-1之间的相互作用。该表达体系虽然有利于蛋白质活性的维持，但表达量低，是后续大量蛋白纯化的制约因素，未来将采用杆状病毒表达体系予以改善。
4 结论通过生物信息学分析，在家蚕中鉴定到2个EGFR配体，BmEGF-1和BmEGF-2。通过pull-down实验验证了BmEGF-1的胞外区段与BmEGFR胞外区段相结合，并通过检测细胞内ERK和p38 MAPK的磷酸化证明了BmEGF-1能激活MAPK信号通路，从而确定BmEGF-1能作为BmEGFR的配体起作用，为进一步研究该分子在家蚕发育和生殖中的功能奠定了基础。
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