宋绍征^1,2, 朱孟敏¹, 袁玉国^1,2, 荣耀¹, 徐晟¹, 陈思¹, 梅珺琰¹, 成勇^1,2
1 扬州大学 兽医学院 江苏省转基因动物制药工程研究中心，江苏 扬州 225009
2 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009

网络出版时间：2015-11-11
基金项目：国家转基因生物新品种培育重大专项 (No. 2011ZX08008-004)，江苏高校优势学科建设工程资助项目，扬州大学研究生科研创新计划项目 (No. CXLX-1435) 资助。


摘要: 为了敲除山羊乳中致敏源β-乳球蛋白 (BLG) 基因，同时在BLG基因座定点整合人乳铁蛋白 (hLF) 基因。首先针对山羊BLG第3外显子识别位点设计了1对特异性TALEN-3-L/R质粒对；同时，构建了含有1个HSV-TK负筛选基因的hLF基因打靶载体BLC14-TK。TALENs质粒对转染山羊胎儿成纤维细胞，2 μg/mL嘌呤霉素筛选3 d，PCR扩增产物测序来验证其切割DNA活性。打靶载体BLC14-TK与TALEN-3-L/R质粒对共转染山羊胎儿成纤维细胞，经700 μg/mL G418 和2 μg/mL GCV共筛选药物抗性细胞株；通过整合检测和同源重组检测来筛选hLF基因打靶细胞株；BLG^-/hLF⁺打靶细胞株作为供核细胞进行山羊体细胞核移植。结果为：TALEN-3-L/R致突变率为25%?30%；获得BLG^-/hLF⁺打靶细胞6株；共制作重构胚胎335枚，移植受体山羊23只，B超检测到30?35 d的妊娠受体9只 (妊娠率39.1%)，其中1只50日龄克隆胎儿验证为BLG^-/hLF⁺基因型。以上结果表明获得BLG基因座定点整合hLF基因的基因打靶山羊是可行的，为培育羊乳中含低致敏原和富含hLF的山羊新品系奠定了基础。
关键词: TALENs 人乳铁蛋白 BLG 基因打靶 体细胞核移植
BLG gene knockout and hLF gene knock-in at BLG locus in goat by TALENs
Shaozheng Song^1,2, Mengmin Zhu¹, Yuguo Yuan^1,2, Yao Rong¹, Sheng Xu¹, Si Chen¹, Junyan Mei¹, Yong Cheng^1,2
1 Jiangsu Provincial Research Center for Animal Transgenesis and Biopharming, College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu, China;
2 Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonosis, Yangzhou 225009, Jiangsu, China

Received: June 28, 2015; Accepted: October 15, 2015
Supported by:National Major Special Projects on New Cultivation for Transgenic Organisms (No. 2011ZX08008-004), PriorityAcademic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions, Graduate Research and Innovation Projects in YangzhouUniversity (No. CXLX-1435).
Corresponding authors:Yong Cheng. Tel: +86-514-87979348; E-mail: ssz0610@163.com


Abstract: To knock out β-lactoglobulin (BLG) gene and insert human lactoferrin (hLF) coding sequence at BLG locus of goat, the transcription activator-like effector nucleases (TALEN) mediated recombination was used to edit the BLG gene of goat fetal fibroblast, then as donor cells for somatic cell nuclear transfer. We designed a pair of specific plasmid TALEN-3-L/R for goat BLG exon Ⅲrecognition sites, and BLC14-TK vector containing a negative selection gene HSV-TK, was used for the knock in of hLF gene. TALENs plasmids were transfected into the goat fetal fibroblast cells, and the cells were screened three days by 2 μg/mLpuromycin. DNA cleavage activities of cells were verified by PCR amplification and DNA production sequencing. Then, targeting vector BLC14-TK and plasmids TALEN-3-L/R were co-transfected into goat fetal fibroblasts, both 700 μg/mL G418 and 2 μg/mL GCV were simultaneously used to screen G418-resistant cells. Detections of integration and recombination were implemented to obtain cells with hLF gene site-specific integration. We chose targeting cells as donor cells for somatic cell nuclear transfer. The mutagenicity of TALEN-3-L/R was between 25% and 30%. A total of 335 reconstructed embryos with 6 BLG^-/hLF⁺ targeting cell lines were transferred into 16 recipient goats. There were 9 pregnancies confirmed by ultrasound on day 30 to 35 (pregnancy rate of 39.1%), and one of 50-day-old fetus with BLG^-/hLF⁺ was achieved. These results provide the basis for hLF gene knock-in at BLG locus of goat and cultivating transgenic goat of low allergens and rich hLF in the milk.
Key words: TALENs human lactoferrin BLG gene targeting somatic cell nuclear transfer
随着人类生活品质的提高，对乳品质的要求也越来越高^[1]。由于山羊乳更接近于人乳，成为牛乳过敏症患者最理想的替代乳品^[2]。β-乳球蛋白 (BLG) 是山羊乳的主要过敏源之一，山羊乳可通过转基因技术进行人乳化改造，降低乳汁中过敏源和增加人乳铁蛋白 (Human lactoferrin，hLF) 成分，可以提高羊奶的品质和质量，使其更具消费价值^[3]。人乳铁蛋白是一种最初在人乳汁中发现的铁结合蛋白，分子量大小为80 kDa^[4]，具有广泛的抗菌活性。现在已有很多转基因动物乳腺生物反应器来生产人乳
铁蛋白的报道^{[5, 6]}，在牛^[7]和山羊^[8]中，已经成功培育出转hLF基因的克隆动物，但到目前为止还没有定点敲入hLF基因山羊的报道。
TALE (Transcription activator-like effector) 是一类转录激活因子样效应蛋白^[9]，利用TALENs可使DNA双链发生断裂，引发生物体的内源性修复机制，介导同源重组或非同源末端连接，能够特异性地提高定点修饰的效率。通过TALENs介导的基因打靶技术，对致敏原乳蛋白基因进行敲出，同时可定点引入人源的功能蛋白，利用内源的乳腺特异性表达调控序列，在乳腺中特异性的表达人源蛋白，实现乳汁的人乳化，改善乳汁品质和营养价值。2004年孙丽新等将人乳铁蛋白 (hLF) 基因在山羊β-酪蛋白基因位点定点插入，希望在家畜乳汁中特异性地高效表达人乳铁蛋白，但最终未获得基因打靶的山羊^[10]。2007年Shen等报道了在山羊胎儿成纤维细胞中敲除山羊β-酪蛋白基因，希望能获得降低乳过敏原性的山羊新品系^[11]，但未能获得基因打靶的山羊。
本研究应用TALENs基因打靶技术，在山羊中敲除致敏原BLG基因，同时在BLG基因座定点敲入hLF基因，并通过体细胞核移植技术获得基因打靶的克隆山羊胎儿。以此验证TALENs介导下BLG基因座基因编辑；hLF cDNA精确整合山羊BLG基因座染色体，为精准转基因分子育种建立基础。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 质粒与菌种 TALENs质粒及试剂盒购自上海斯丹赛生物技术有限公司 (CMV-SP6-TALENs Vector Set，Cat No.: 1803-015)。BLC14质粒菌种 (包含山羊BLG5'调控序列、CMV增强子、hLF cDNA、PolyA信号、NEO基因、山羊BLG3'调控序列) ^[12]，宿主菌为埃希氏大肠杆菌Escherichia coli DH5α，含有单个负筛选HSV-TK基因的质粒Porf-hsv1tk (Invitrogen，4.4 kb)，均由本实验室保存。
1.1.2 引物 PCR引物设计借助于Primer Premier 5.0软件完成，引物由上海英骏生物技术有限公司和上海生工生物工程技术有限公司合成 (表 1)。
表1 检测所用引物Table1 Primers for detection

Primer name	Primer sequence (5′-3′)	Size (bp)
TALEN-3-a	TCTGGCTTCATTTGACTTCTC	729
TALEN-3-b	TTTCTCATCTCGGATTTAGGAC
CMV+LTF1	ATGGGCGTGGATAGCGGTTTGAC	470
CMV+LTF2	CCACCATCAAGGGTCACAGCATCG
TK1	GCAAGAAGCCACGGAAGT	780
TK2	GCCCGAAACAGGGTAAAT
NEO-3'-a	CCGAGAAAGTATCCATC	2 391
NEO-3'-b	GGTGTTCCCAGGTCA

表选项


1.1.3 主要试剂 DMEM/F12 (Hyclone，Cat No. D2906)，FBS (Hyclone，Cat No. SH30070.03)，Trypsin (Amresco，Cat No. 0458)，嘌呤霉素、M2、M16、透明质酸酶、核荧光染料hochest 33342、细胞松弛素B、6-甲基氨基蝶呤等均购自美国Sigma公司；各种限制性内切酶、DNA连接酶和DNA聚合酶购自宝生物工程 (大连) 有限公司；DNA纯化试剂盒购自QIAGEN公司；TALEN快速构建试剂盒购自上海斯丹赛生物技术有限公司。其他未说明试剂均为国产分析纯，分别购自上海药剂、上海生工生物工程有限公司、南京生兴生物有限公司。
1.1.4 实验动物 萨能奶山羊购自杭州彩洋牧业有限公司，实验用白羊来自扬大联环药业基因工程有限公司实验羊场。
1.2 方法1.2.1 BLC14-TK打靶载体构建 含有单个负筛选HSV-TK基因的质粒Porf-hsv1tk经XhoⅠ酶切线性化，纯化后用Klenow酶补平末端。质粒BLC14经SalⅠ+ NotⅠ酶切并回收10 600 bp的片段，用Klenow酶补平末端；末端补平的Porf-hsv1tk片段与补平的BLC14片段连接获得打靶载体BLC14-TK。
1.2.2 TALENs核酸蛋白表达载体的构建对于奶山羊基因组中BLG基因座的序列进行TALENs的设计，奶山羊BLG基因序列 (NCBI，emb|Z33881.1|，8 088 bp) 来自Nucleotide数据库。根据TALENs核酸酶TAL Effector Nucleotide Targeter 2.0在线软件，其网址为“https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen”。
TALEN的识别位点位于山羊BLG第3外显子，转录起始位点下游，其中，L臂：3 959-3 974；R臂：3 992-4 008；spacer长度为17 bp，见表 2。
1.2.3 山羊胎儿成纤维细胞的分离、培养 无菌手术取约35日龄山羊胎儿，D-Hank’s洗涤2次，去除头、四肢、内脏后，将剩余部分组织剪碎成约1 mm³大小，D-Hank’s洗涤3次；加入5 mL消化液 (0.05%胰酶+0.04% EDTA)，移液管反复吹打消化15 min；待溶液浑浊后，静置1 min，取上层浑浊液于另一洁净离心管，D-Hank’s液离心洗涤2次，细胞计数并用培养液 (含DMEM/F12+10% FBS) 调整密度至 5×10⁵个/mL接种于六孔板中，置 CO₂培养箱中，37 ℃、5% CO₂、饱和湿度下静置培养。剩余未消化组织重复上述步骤再次消化，直至组织块基本消失。
表2 TALENs识别位点Table2 Recognition sequence of TALENs

Name	Recognition sequence (5′-3′)
TALEN-3-L	TGTGCTCAGAAGAAGAT
TALEN-3-R	TGAACACCGCAGGGATCT

表选项


1.2.4 TALENs特异性位点致突变活性检验 收集对数生长期山羊胎儿成纤维细胞，用电转染液洗涤离心后重悬细胞密度至1×10⁶个/mL。TALEN-3-L/R质粒经QIAGEN试剂盒纯化后溶于超纯水中，细胞悬液中等比例加入TALEN-3-L/R质粒，使其总浓度至10 μg/mL，在2 mm间隙电极杯中，以1.5 kV/cm、200 μs的条件电击2次，静置5 min，转移到正常的培养液 (DMEM/F12+10% FBS) 中，接种到6孔细胞培养板上，置于37 ℃、5% CO₂、饱和湿度下的CO₂培养箱内培养。24 h后加入2 μg/mL嘌呤霉素筛选，隔天换液1次，同时设置正常未转染的细胞作对照；3-4 d后待对照细胞全部死亡后，换正常培养液继续培养10-15 d后，观察存活细胞。
待细胞汇合至80%左右时，收集存活细胞，提取DNA，进行PCR检测，引物分别为TALEN-3-a/b，序列详见1.1.2的表 1，PCR扩增产物经上海华大基因科技有限公司进行测序。
1.2.5 hLF基因打靶细胞系的建立 打靶载体BLC14-TK经NotⅠ酶切而线性化，使用QIAGEN胶回收试剂盒回收长度为 15 kb的DNA片段，溶解于无菌超纯水中，与TALEN-3-L/R共转染山羊胎儿成纤维细胞，基因浓度均为10 μg/mL，转染方法同1.2.4，同时设置正常未转染的细胞作对照。
转染36 h后，在培养液中添加G418 (700 μg/mL) 和GCV (2 μg/mL) 继续筛选培养；筛选培养10-14 d后，即正常细胞对照组全部死亡时，挑取单克隆细胞株以正常培养液 (DMEM/F12+10% FBS) 扩大培养，收集细胞，其中1/2冻存 (DMEM/F12 + 10% DMSO + 20% FBS) 以作体细胞核移植供核细胞，另1/2提取DNA以作PCR检测。
以单克隆细胞株DNA为模板，应用CMV+LTF1/2引物进行人乳铁蛋白整合检测，应用TK1/2引物进行TK基因检测，NEO-3'-a/b引物进行靶位点同源重组检测，引物序列见1.1.2的表 1。
1.2.6 体细胞核移植试验羊的准备 正常成年雌性白山羊为供质羊，于发情后第9-13天开始注射FSH，连续3 d，每天2次，总剂量240-300 IU。第4天注射氯前列烯醇1 mL (0.1 mg)，第5天注射LHRH 50 μg。寄母羊同步发情。
1.2.7 核移植、融合与激活 冷冻细胞于37 ℃复苏后，贴壁细胞生长至80%更换为0.5% FBS培养液中饥饿培养48 h，细胞悬浮于M2培养液备用。卵母细胞置于 5 μg/mL Hochest33342 和7.5 μg/mL CB的M2中处理30 min，在荧光显微镜下去除细胞核与第一极体，并移入供核细胞。
重构卵在M16培养液中培养30 min后进行融合 (融合液: 0.3 mmol/L甘露醇+0.05 mmol/L 氯化钙+0.1 mmol/L 硫酸镁+3% BSA)，条件为1.2 kV/cm、40 μs、2个脉冲。融合后在M16中培养 30 min 后观察，未融合卵按上述条件重复1次。
融合卵在M16中培养5 h后开始激活 (M16培养液+5 μmol/L 离子霉素+7.5 μg/mL CB)，精确控制5 min；然后在含2 mmol/L 6-DMAP和7.5 μg/mL CB的M16中培养5 h，最后移至M16培养液中直到胚胎移植^{[13, 14, 15]}。
1.2.8 胚胎移植与妊娠检查 激活后的重构卵在M16培养中培养 (5% CO₂，38 ℃)，挑取排出“第二极体”的胚胎 (单细胞)，通过手术法移入同步发情寄母山羊的输卵管，每只受体移植5-20枚胚胎，在胚胎移植后30-35 d进行B超检查，妊娠羊单饲养，常规管理。
1.2.9 克隆胎儿鉴定 无菌手术剖宫产取出50日龄克隆胎儿，并获得细胞系，应用跨NEO基因和山羊BLG-3’调控区外侧的NEO-3'-a/b引物PCR扩增，PCR产物测序，DNAStar软件分析测序比对结果，进行基因打靶鉴定。
2 结果与分析2.1 打靶载体BLC14-TK的构建 将HSV-TK基因片段与线性化的BLC14片段连接，构建了BLC14-TK打靶载体，其结构见图 1。

图1 BLC14-TK打靶载体结构示意图 Figure1 The structure diagram of BLC14-TK targeting vector.

图选项

2.2 胎儿成纤维细胞的培养 利用胰蛋白酶消化得到的原代胎儿成纤维细胞通常较小，胎儿成纤维细胞是一种贴壁细胞，通常呈梭形长条状。细胞群呈涡旋状或者不规则排列，细胞密度过大时成纤维细胞会呈细长条状，细胞群会呈现肉眼可见的白色群落。典型的胎儿成纤维细胞如图 2所示。

图2 原代胎儿成纤维细胞(100×) Figure2 P0 generation of fetal fibroblast cells (100×).

图选项

2.3 TALENs活性细胞PCR检测和测序结果TALENs-3-L/R质粒转染胎儿成纤维细胞后获得了嘌呤抗性细胞，以提取细胞DNA为模板PCR扩增，产物经测序进一步验证了突变细胞系，见图 3。从图上箭头所示处开始出现重叠套峰，此处位于山羊BLG基因第3外显子 (TALENs-3-L/R识别位点)。根据重叠套峰的情况，可初步确定TALEN-3-L/R质粒对在胎儿成纤维细胞中切割基因组DNA双链的致突变活性为25%-30%之间。

图3 TALEN-3-L/R PCR活性产物测序峰图 Figure3 The sequencing peak diagram of TALEN-3-L/R PCR products.

图选项

2.4 人乳铁蛋白基因打靶细胞系的验证 打靶载体BLC14-TK与TALEN-3-L/R质粒对共转染山羊胎儿成纤维细胞2×10⁷个，经G418和GCV筛选获得34株药物抗性细胞。
hLF基因整合检测，获得32株转人乳蛋白基因细胞，PCR产物大小均为470 bp (图 4)。
通过对HSV-TK基因检测从反面验证同源臂重组的可能性，经PCR引物TK1/2对基因打靶细胞株DNA进行PCR扩增，产物大小为780 bp (图 5)，有6株未检测到TK基因。初步证明这6株细胞为同源重组细胞株，分别命名为T-1、T-2、T-3、T-4、T-5、T-6。
经跨NEO基因和山羊BLG-3′外侧的PCR引物NEO-3′-a/b对上述6株细胞进一步进行同源重组检测，扩增产物大小为2 391 bp，证明该6株细胞均为打靶细胞株 (图 6)。

图4 部分hLF整合检测PCR图 Figure4 hLF transgenic integration analysis of PCR.

图选项

图5 部分转hLF基因细胞株的TK基因检测PCR图 Figure5 PCR detection of the TK gene.

图选项

图6 部分PCR检测转hLF基因细胞株同源臂重组 Figure6 Homologous recombination detection of hLF transgenic cells by PCR.

图选项

2.5 克隆胚的发育情况 如表 3所示，共获得430枚去核卵，融合后获得352 枚重构卵，融合率为81.9%；激活后的335枚重构胚胎短暂培养后移入23只同步发情受体山羊输卵管中，在移植后的30-35 d进行B超诊断，9只怀孕，妊娠率为39.1%。手术剖宫产获取1只50日龄胎儿 (T-4)，胎儿和B超检查见图 7和8，测序比对结果如图 9所示，
表3 细胞核移植生产克隆胎儿统计Table3 Details of production of cloned fetuses by nuclear transfer

Donor cells	Embryo transfer	Receptors	30-35 d pregnancy (%)
T-1	63	4	1 (25.0)
T-2	28	2	2 (100.0)
T-3	84	5	0 (0)
T-4	36	3	2 (66.7)
T-5	29	2	1 (50.0)
T-6	95	7	3 (42.9)
Total	335	23	9 (39.1)

表选项

图7 BLG-/hLF+基因型克隆胎儿照片 Figure7 The photo of cloned fetus with BLG-/hLF+.

图选项

图8 B超检查妊娠图 Figure8 The pregnancy by B-ultrasound.

图选项

图9 BK-94打靶胎儿同源臂测序对比结果图 Figure9 Sequence homology result of BK-94 targeting fetus.

图选项

BK-94#胎儿与BLG-3’下游具有同源序列 (方框所示)，充分证明该胎儿为BLG基因座打靶胎儿，并建立细胞系。
3 讨论 本研究应用定向BLG基因座的基因置换和TALEN介导的基因打靶技术，获得了BLG^-/hLF⁺靶向性修饰细胞系及胎儿，在国内外尚未见报道^{[5, 6]}。动物基因打靶技术可以对家畜遗传基因进行精确修饰，使家畜转基因育种的随机性转变为可控性，有利于单一性状的改良，降低了外源基因漂移和丢失的可能性，也降低了动物转基因育种的风险度。在乳汁中添加人乳铁蛋白等功能成分，减少或去除致敏原，是乳产品人乳化改造重要途径^{[3, 16]}。
早期有关基因打靶研究报道是应用长片段同源臂作为打靶载体获得的，不仅其效率低，而且检测和筛选繁琐，并且导致后期基因打靶动物克隆的困难。2004年，孙丽新等^[10]将hLF基因在山羊β-酪蛋白基因位点定点插入的研究，Shen等^[11]将人纤溶酶原激活物 (htPAm) 基因在山羊β-酪蛋白基因定点插入的研究，Marques等^[17]在α1 (Ⅰ) 原骨胶原 (COL1A1) 基因的3′非翻译区引入人alpHa-1-antitrypsin (hAAT) 基因的研究，张学明等^[18]在β酪蛋白基因位点敲入gdnf基因的研究，但是均没有获得基因打靶动物个体。本研究中主要使用TALENs能够明显地提高打靶效率，主要是对山羊β-乳球蛋白 (BLG) 基因进行敲除，同时定点整合hLF基因，成功地获得了6株BLG^-/hLF⁺基因打靶细胞株，结果显示其基因打靶效率得到明显提高。
TALEN是近年来发展起来基因编辑技术，前几年在微生物、植物和小鼠胚胎干细胞中有较多应用报道^{[19, 20, 21]}，在大家畜及动物体细胞中应用尚未见报道，本研究证实了TALEN能够介导对靶向基因敲入和敲出。从34株药物抗性细胞株中有6株为打靶细胞株 (效率高达17.6%)，远远高于经典基因打靶的效率^{[22, 23]}。此外，本实验室保存的BLC14乳腺特异性表达载体含有hLF基因、CMV增强子及山羊BLG调控区，其稳定表达能力在小鼠、山羊乳腺上皮细胞以及成体转基因山羊乳腺中已经得到了验证^{[12, 15, 24, 25]}。
本研究在山羊BLG基因座的第3外显子上设计了TALENs的识别位点，左右臂长度分别为16 bp、17 bp，spacer长度为17 bp，TALENs作用时FokⅠ酶会形成一个异源二聚体的结构。研究结果表明，这种TALENs在BLG基因座上的定点切割效应同时会催化打靶载体 (BLC14-TK) 在宿主动物染色体BLG基因座上的同源重组事件，TALENs的这一作用在国内外也鲜有报道。
本试验还表明，TALEN左臂的载体存在嘌呤霉素抗性基因有利于中靶细胞的早期筛选，因为嘌呤霉素筛选可以杀死几乎所有的正常细胞 (非转基因的细胞)，在此基础上进行NEO^r+和GCV^-筛选，减少或消除了假阳性细胞的残留，这样极大地提高了细胞筛选的效率，更有利于细胞的聚集。这一结果虽然目前仅在BLG基因座和胎儿成纤维细胞上获得成功，但从试验原理来看，在其他基因座及细胞系基因打靶研究中应该也具有借鉴作用。
总之，本研究共获得6株hLF基因打靶细胞作为供核细胞，制备重构胚移植23只受体，30-35 d B超检测到妊娠受体9只，获得1只50日龄打靶胎儿，并建立细胞系。这些结果表明TALENs介导和编辑的基因打靶胎儿成纤维细胞在去核山羊卵母细胞中具有恢复发育全能性和发育成个体的能力，同时山羊BLG基因的部分敲除和hLF基因敲入未影响胚胎早期的发育。但9只受体均未出生羔羊的结果似乎提示中靶细胞对胎儿中后期的发育有一定干扰或影响，但体细胞克隆出现中后期胎儿停止发育也是比较公认的因素^{[13, 23]}，因此，相关后续研究有必要继续进行。

参考文献

[1]	Sackesen C, Assa'ad A, Baena-Cagnani C, et al. Cow's milk allergy as a global challenge.Curr Opin Allergy Clin Immunol, 2011, 11(3): 243–248(in Chinese).
[2]	Park YW. Hypo-allergenic and therapeutic significance of goat milk.Small Rumin Res, 1994, 14(2): 151–159(in Chinese).
[3]	Sabikhi L. Designer milk.Adv Food Nutr Res, 2007: 161–198(in Chinese).
[4]	Nuijens JH, Van Berkel PHC, Schanbacher FL. Structure and biological actions of lactoferrin. J Mamm Gland Biol Neopl, 1996, 1(3): 285-295.
[5]	Li Y, Li HJ, Han LQ, et al. Optimization of purifing method for lactoferrin.Chem Bioeng, 2007, 24(11): 38–40(in Chinese). 李岩, 李宏基, 韩立强, 等. 乳铁蛋白纯化方法的优化.化学与生物工程,2007,24(11):38–40.
[6]	Yang F, Chen YZ, Zhang JX. Lactoferrin Production in mammary gland bioreactor.Acad J Guangdong Coll Pharm, 2001, 17(2): 123–124(in Chinese). 杨帆, 陈燕忠, 张纪兴. 利用乳腺生物反应器生产人乳铁蛋白.广东药学院学报,2001,17(2):123–124.
[7]	Yu T, Guo CD, Wang JW, et al. Comprehensive characterization of the site-specific N-glycosylation of wild-type and recombinant human lactoferrin expressed in the milk of transgenic cloned cattle.Glycobiology, 2011, 21(2): 206–224(in Chinese).
[8]	Han ZS, Li QW, Zhang ZY, et al. High-level expression of human lactoferrin in the milk of goats by using replication-defective adenoviral vectors.Protein Expr Purif, 2007, 53(1): 225–231(in Chinese).
[9]	Bonas U, Stall RE, Staskawicz B. Genetic and structural characterization of the avirulence gene avrBs3 from Xanthomonas campestris pv.vesicatoria. Mol Gen Genet, 1989, 218(1): 127–136(in Chinese).
[10]	Sun LX. The production of gene-targeting at gef β-casein gene locus with human lactoferrin gene and analysis of gene integrate site[D]. Shanghai: East China Normal University, 2004 ((in Chinese) 孙丽新. hLF 基因打靶山羊胎儿成纤维细胞株的建立及其整合位点的分析[D]. 上海: 华东师范大学, 2004.
[11]	Shen W, Lan GC, Yang XY, et al. Targeting the exogenous htPAm gene on goat somatic cell beta-casein locus for transgenic goat production.Mol Reprod Dev, 2007, 74(4): 428–434(in Chinese).
[12]	Cheng Y, An LY, Yuan YG, et al. Hybrid expression cassettes consisting of a milk protein promoter and a cytomegalovirus enhancer significantly increase mammary-specific expression of human lactoferrin in transgenic mice.Mol Reprod Dev, 2012, 79(8): 573–585(in Chinese).
[13]	Cheng Y, Wang YG, Luo JP, et al. Cloned goats produced from the somatic cells of an adult transgenic goat.Chin J Biotech, 2002, 18(1): 79–83(in Chinese). 成勇, 王玉阁, 罗金平, 等. 由成年转基因山羊体细胞而来的克隆山羊.生物工程学报,2002,18(1):79–83.
[14]	An LY, Yuan YG, Yu BL, et al. Cloning goat producing human lactoferrin with genetically modified donor cells selected by single or dual markers.Chin J Biotech, 2012, 28(12): 1482–1491(in Chinese). 安礼友, 袁玉国, 于宝利, 等. 单、双标记基因筛选的转人乳铁蛋白基因供核细胞生产克隆山羊效率的比较.生物工程学报,2012,28(12):1482–1491.
[15]	An LY, Yuan YG, Yu BL, et al. Generation of human lactoferrin transgenic cloned goats using donor cells with dual markers and a modified selection procedure.Theriogenology, 2012, 78(6): 1303–1311(in Chinese).
[16]	Nowak-Wegrzyn A. New perspectives for use of native and engineered recombinant food proteins in treatment of food allergy.Immunol Allergy Clin North Am, 2007, 27(1): 105–127(in Chinese).
[17]	Marques MM, Thomson AJ, McCreath KJ, et al. Conventional gene targeting protocols lead to loss of targeted cells when applied to a silent gene locus in primary fibroblasts.J Biotechnol, 2006, 125(2): 185–193(in Chinese).
[18]	Zhang XM. Human gdnf gene knock-in at beta-casein locus in bovine fetal fibroblast cells and production of gene-targeted blastocysts by SCNT[D]. Hohhot: Inner Mongolia University, 2009 ((in Chinese) 张学明. 人gdnf 在牛胎儿成纤维细胞β-casein 基因座的定位整合及基因打靶克隆囊胚的制作[D]. 呼和浩特: 内蒙古大学, 2009.
[19]	Li T, Huang S, Jiang WZ, et al. TAL nucleases (TALNs): hybrid proteins composed of TAL effectors and FokI DNA-cleavage domain.Nucleic Acids Res, 2011, 39(1): 359–372(in Chinese).
[20]	Miller JC, Tan S, Wang J, et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.Nat Biotechnol, 2011, 29(2): 143–148(in Chinese).
[21]	Mahfouz MM, Li LX, Fang XY, et al. De novo-engineered transcription activator-like effector (TALE) hybrid nuclease with novel DNA binding specificity creates double-strand breaks.Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(6): 2623–2628(in Chinese).
[22]	Zhang Y, Zhang F, Li XH, et al. Transcription activator-like effector nucleases enable efficient plant genome engineering.Plant Physiol, 2013, 161(1): 20–27(in Chinese).
[23]	An LY. Human α-LA gene knock-in at BLG locus in goat fibroblast cells and production of gene targeted goats by SCNT[D]. Yangzhou: Yangzhou University, 2012 ((in Chinese) 安礼友. 人α-LA 在山羊胎儿成纤维细胞BLG 基因座的定点整合及基因打靶克隆山羊的制备[D]. 扬州: 扬州大学, 2012.
[24]	Yuan YG, An LY, Yu BL, et al. Construction of mammary gland specific vector for expression of human lactoferrin.Acad J Yangzhou Univ: Agric Life Sci Ed, 2011, 32(3): 6–10(in Chinese). 袁玉国, 安礼友, 于宝利, 等. 人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体的构建及其功能的验证.扬州大学学报: 农业与生命科学版,2011,32(3):6–10.
[25]	Cheng Y. Mammary gland-specific expression of hLF cDNA driven by lactoprotein and cytomegalovirus (CMV) chimeric promoters[D]. Nanjing: Nanjing Agricultural University, 2007 ((in Chinese) 成勇. 乳蛋白与CMV 复合启动子驱动hLF cDNA 乳腺特异性表达[D]. 南京: 南京农业大学, 2007.