嘉兴学院 生物与化学工程学院，浙江 嘉兴 314001
基金项目：国家自然科学基金 (No. 31100053)，浙江省自然科学基金 (No. LQ14C050002)，浙江省公益性技术应用研究计划项目 (No. 2014C31046)，浙江省纱线材料成型与复合加工技术研究重点实验室开放项目 (No. MTC2014-007)，嘉兴市科技项目 (No. 2014BY15001) 资助
摘要: 灵菌红素是一种微生物次级代谢产生的重要天然红色素，在医药开发、环境治理和染料制备等领域具有巨大的潜在应用价值。文中从3个方面归纳了国内外关于灵菌红素的研究进展：产灵菌红素微生物的发现与改造；灵菌红素发酵与提取过程的控制与优化；灵菌红素生物合成途径及其转录调控机制的解析。最后，讨论了微生物发酵法生产灵菌红素今后的研究方向。
关键词: 灵菌红素 发酵生产 菌株选育 优化控制 合成途径 转录调控
Progress in microbial production of prodigiosin
You Zhongyu, Wang Yujie, Sun Shiqing, Liu Xiaoxia
College of Biological,Chemical Sciences and Engineering,Jiaxing University,Jiaxing 314001,Zhejiang,China
Received: January 19, 2016; Accepted: April 18, 2016
Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31100053), Natural Science Foundation of Zhejiang Province (No.LQ14C050002), Public Welfare Technology Applied Research Projects of Zhejiang Province (No. 2014C31046), Open Project of KeyLaboratory of Yarn Material Molding and Composite Processing Technology of Zhejiang Province (No. MTC2014-007), Project ofJiaxing Science and Technology (No. 2014BY15001).
Corresponding authors:Xiaoxia Liu. Tel: +86-573-83646246; E-mail: sunliuxx@163.com
Abstract: Prodigiosin is an important natural red pigment that is produced as a secondary metabolite by microorganisms,and has great potential applications in the field of pharmaceutical development,environmental management and dye preparation. This paper reviews recent research progress in the production of prodigiosin by microbial fermentation,including discovery and modification of the prodigiosin-producing microorganisms,regulation and optimization of prodigiosin fermentation and extraction process,and resolution of biosynthetic pathway of prodigiosin and related transcriptional regulation. Finally,we discussed the future research directions in microbial production of prodigiosin.
Key words: prodigiosin fermentation strain breeding optimization and regulation synthesis pathway transcriptional regulation
灵菌红素类色素 (Prodigiosins，PGs) 是一类具有3个吡咯环的甲氧基吡咯骨架结构的天然红色素，它们是某些沙雷氏菌、放线菌及海洋细菌的次级代谢产物[1]。因其烷基侧链的不同分为多种结构类似物，包括灵菌红素 (Prodigiosin，PG)、十一烷基灵菌红素 (Undecylprodigiosin，UP)、环烷基灵菌红素 (Cycloprodigiosin)、间环丙菌素 (Metacycloprodigiosin)、链玉红菌素B (Streptorubin B)等[1-2]。其中灵菌红素是该类色素的典型代表之一，其外观为暗红色粉末，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等极性较大的有机溶剂，几乎不溶于水，在不同pH条件下可以呈现出不同的颜色[3-4]。研究发现，灵菌红素具有抗细菌、抗真菌、抗疟疾、抗原生动物、抗癌、免疫抑制等重要生物活性[1-2]，可用于特效的免疫抑制剂和抗菌、抗癌等药物的开发；而且灵菌红素对藻类的生长有明显的抑制作用，在治理由各种藻类造成的海洋赤潮和淡水水华等方面表现出极佳的效果，且无二次污染[5-6]；此外，灵菌红素作为微生物来源的天然色素，用作生态染料，具有良好的色牢度和上染率，有望推动传统染料工业乃至纺织工业的技术变革[7-8]。近来研究还发现由于灵菌红素对光敏感，可作为防晒霜等化妆品的添加剂，减小紫外线对皮肤的损伤[9]。因此灵菌红素在医药、环境治理、纺织染料乃至化妆品等领域具有广阔的应用前景和市场价值。
目前，灵菌红素可以通过化学合成法和微生物发酵法制备[2, 10]。由于化学合成法相对困难，反应步骤多，产率低，因此难以实现大规模的生产；而微生物发酵法生产灵菌红素具有环境友好、条件温和、成本低和易于工业化等优点，因此，近年来采用微生物发酵法生产灵菌红素已成为国内外研究的热点。本实验室也从自然界筛选到了1株产灵菌红素的菌株[3, 11]，并开展了菌种的诱变育种[12]、发酵及提取工艺优化[13]、灵菌红素的抗菌及染色性能研究[14-15]、灵菌红素合成关键酶的克隆表达[16]等研究工作，取得了一定的研究成果。本文在实验室前期研究的基础上，结合前人对灵菌红素生物合成的研究，就产灵菌红素菌株的选育、发酵及提取工艺的优化、灵菌红素生物合成途径及相关基因的表达调控等方面进行综述，以促进微生物发酵法生产灵菌红素的研究进程。
1 产灵菌红素微生物的发现与改造1.1 产灵菌红素的天然微生物自然界中能合成天然色素的微生物很多，但是产灵菌红素的微生物种类并不多，主要包括沙雷氏菌属Serratia[17]、河氏菌属Hahella[18]、假单胞菌属Pseudomonas[19]、弧菌属Vibrio[20]等。其中研究最广泛的是粘质沙雷氏菌Serratia marcescens，该菌又名灵杆菌，是一种常见的革兰氏阴性杆菌，灵菌红素最早于1902年从该菌中发现[21]。笔者实验室从土壤中筛选到1株 S. marcescens jx1，经培养条件优化后其灵菌红素产量可达5.1 g/L[22]。表 1中列举了其他多种S. marcescens及其产灵菌红素的水平。除 S. marcescens外，还有多种海洋微生物也具有产灵菌红素的能力，例如，Kim等从海洋中筛选到1株河氏菌Hahella chejuensis KCTC 2396，该菌经培养可得到0.028 g/L的灵菌红素[18]。从表 1中可以看出，海洋微生物的灵菌红素产量普遍低于S. marcescens，因此，S. marcescens将是发酵法生产灵菌红素的首选微生物。
表 1 灵菌红素产生菌Table 1 Strains for prodigiosin production
| Sources | Strains | Prodigiosin yield (g/L) | References |
| Salt marsh | Serratia sp. ATCC 39006 | NR | [17] |
| Mandarin fish intestine | Serratia marcescens HFUT 1301 | 3.22 | [23] |
| Soil | Serratia marcescens | 0.535 | [24] |
| Pangola grass compost | Serratia marcescens CFFSUR-B2 | 0.06 | [25] |
| Spoiled coconut | Serratia rubidaea | <0.01 | [26] |
| Sea | Hahella chejuensis KCTC 2396 | 0.028 | [18] |
| Sea | Pseudomonas sp. | ≈0.07 | [19] |
| Sea | Vibrio ruber sp. | NR | [20] |
| Sea | Zooshikella rubidus S1-1 | 0.048 | [27] |
| NR: not reported. | |||
表选项
1.2 高产菌株的选育野生型菌株的灵菌红素产量较低，不具备大规模生产的能力，从而很难走出实验室，若要真正利用灵菌红素，必须在高产菌株的选育上有所突破，表 2列举了部分灵菌红素产生菌的诱变育种效果。紫外诱变是一种传统而经典的物理诱变方法，该方法操作简便，成本低，常用于微生物菌种的改良。Tao等将S. marcescens的细胞悬液在紫外下照射20 s，经培养、筛选得到1株灵菌红素产量提高2.8倍的突变株[28]。相对于紫外诱变而言，微波诱变是一种较新的且具有显著成效的物理诱变技术，笔者实验室利用微波诱变技术对S. marcescens jx1进行了诱变处理，使该菌的灵菌红素产量从3.1 g/L提高至6.5 g/L[12]。
表 2 灵菌红素产生菌的诱变育种Table 2 Mutation breeding of prodigiosin production strains
| Strains | Mutagenic agents | Change of prodigiosin yield | References |
| S. marcescens | UV | Increased to 2.8-fold | [28] |
| S. marcescens RZ21 | UV | Increased to 1.25-fold | [32] |
| S. marcescens | UV | Increased to 3.15-fold | [33] |
| S. marcescens jx1 | Microwaves | Increased to 2.1-fold | [12] |
| S. marcescens | EMS | Increased to 7.44-fold | [33] |
| H. chejuensis KCTC 2396 | EMS | Increased to 2.5-fold | [29] |
| V. gazogenes | Methyl nitrosoguanidine | Increased to 1.81-fold | [30] |
| Serratia sp.W0206 | UV-LiCl | Increased to 3-fold | [31] |
表选项
烷化剂是一类高效的化学诱变剂，它可引起DNA分子的部分烷化，使DNA在复制过程中发生错配而产生突变，常见的烷化剂有甲基磺酸乙酯 (EMS)、亚硝基胍 (NTG) 和硫酸二乙酯 (DES) 等。Kim等以EMS为诱变剂，对灵菌红素产生菌H. chejuensis KCTC 2396进行了处理，经平板筛选、液体培养发现其灵菌红素产量从0.658 g/L提高至1.628 g/L[29]。Alihosseini等利用1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍对Vibrio gazogenes进行诱变育种，使其灵菌红素产量提高了81%[30]。
此外，多种诱变剂的复合使用也是提高突变率的有效方法，陶金莉等通过UV-LiCl复合处理S. marcescens，并利用高浓度的葡萄糖定向筛选抗葡萄糖分解代谢物阻遏的高产株，最终获得1株产量提高了3倍的突变株[31]。综上所述，从自然界筛选新菌种、菌种诱变育种是提高灵菌红素产量的重要方法，结合新兴的微生物育种技术 (如基因工程育种等) 进一步选育出高产菌株是今后育种的重要方向。
2 灵菌红素的发酵及提取工艺 众所周知，微生物发酵产品的生产除了良好的菌种外，优良的发酵工艺也是必不可少的。为了进一步提高灵菌红素的产量，有必要对发酵过程进行优化和控制研究，包括培养基组分、培养过程参数和培养模式等。同时，发酵过程结束后，灵菌红素的分离纯化过程是影响其质量的关键因素，也是决定其生产成本的最主要因素。因此，国内外研究者在灵菌红素发酵和提取工艺方面做了大量研究工作。
2.1 培养基组分的优化培养基为微生物的生长和代谢产物的合成提供足够的营养和能量。对于灵菌红素的发酵生产，不同菌种对培养基组分的需求也不尽相同，研究人员常采用基于统计分析的方法设计理想的培养基配方，以获得最大的灵菌红素产量。例如：Su等利用响应面法对S. marcescens的培养基组分进行了优化，结果表明，该菌的最优培养基组分为：0.5%蔗糖、0.454%蛋白胨、0.5%甘氨酸和1 626.3 ppm KH2PO4，在最佳培养条件下，该菌的灵菌红素产量达2.423 g/L，比其初始产量提高了8.42倍[34]。Kim等利用Plackett-Burman设计和Box-Behnken设计优化了H. chejuensis KCTC 2396的培养基，最终使其灵菌红素产量提高了3倍[35]。
在培养基组分优化过程中，研究人员发现某些特殊物质的添加可以增加灵菌红素的产量。如：含脂肪酸类的物质在灵菌红素发酵生产中发挥着重要的作用，其中作用最为明显的是花生粉。Giri等以花生粉培养基代替营养肉汤培养基时，S. marcescens产灵菌红素的水平从0.52 g/L迅速上升至38.75 g/L，该产量提升的关键因素是花生粉中含有大量的饱和脂肪酸，而饱和脂肪酸有助于S. marcescens合成灵菌红 素[36]。有研究表明，脯氨酸、色氨酸和组氨酸等含有吡咯结构的氨基酸可以作为前体物质加入培养基中，有利于促进灵菌红素的合成。Siva等的研究显示，脯氨酸单独或与甲硫氨酸组合使用，可以让S. rubidaea的灵菌红素产量提高数倍[26]。此外，笔者实验室在优化S. marcescens发酵过程时发现当发酵培养基中添加0.1 g/L的二甲基亚砜时，灵菌红素的产量可以提高近1倍，分析其原因可能是二甲基亚砜增加了细胞膜的通透性，使其从细胞内分泌至细胞外，减少了灵菌红素在细胞内积累，从而解除了反馈调节，提高了灵菌红素的产量[37]。
为了进一步降低生产成本，有效利用各类资源，研究人员还不断致力于寻找更廉价高效的培养基。de Araujo等考察了木薯废水和玉米浸出液对S. marcescens UCP 1549产灵菌红素的影响，结果发现利用6%木薯废水和2%甘露醇为培养基时，该菌的灵菌红素产量可达49.5 g/L，这是目前文献报道中灵菌红素的最高产量[38]。Sumathi等从以制革厂产生的废肉为食的鱼类肠道中筛选到1株S. marcescens，该菌可以在制革废肉培养基中生长并合成灵菌红素，在最佳培养条件下，其灵菌红素的产量可达约48 g/L[39]。笔者实验室也探索了利用硫酸软骨素生产过程中产生的废蛋白代替蛋白胨来培养S. marcescens，在适当浓度下有利于灵菌红素产量的提高 (结果待发表)。由此可以看出，利用工农业废弃物作为培养基原料发酵生产灵菌红素是有效降低成本、合理利用资源的理想途径。
2.2 发酵参数与发酵模式的优化发酵参数 (如温度、pH等) 对微生物合成灵菌红素有着重要的影响，其中温度对沙雷氏菌属产灵菌红素的影响最为显著。该菌属产灵菌红素的过程属于温度敏感型，当温度低于30 ℃时，其产灵菌红素的能力较强，温度高于37 ℃，其基本不产色素。多数研究表明，S. marcescens产灵菌红素的最佳温度为28 ℃[26, 36, 38]。为了探究温度对灵菌红素合成的影响机理，徐虹等分析了S. marcescens JNB5-1在不同温度下的蛋白表达差异，结果发现在高温 (37 ℃)培养下，参与灵菌红素合成的相关蛋白 (酶) 表达量显著下降，从而降低了灵菌红素的产量[40]。还有研究指出，S. marcescens TKU011 PG的最适生长温度和最适产色素温度有一定差别，作者将菌体生长温度设为30 ℃，灵菌红素合成温度设为25 ℃，其灵菌红素产量比恒定30 ℃条件下有明显提高[41]。该研究还考察了溶氧对灵菌红素发酵的影响，当采用含挡板的锥形瓶代替普通锥形瓶进行发酵时，灵菌红素的产量从0.84 g/L提高至2.48 g/L[41]，由此可以看出，在其他条件确定的情况下，适当提高溶氧可以增加灵菌红素的产量。因此对氧传递的进一步研究对灵菌红素的发酵具有促进作用，特别是在发酵规模放大过程中对溶氧的控制具有指导意义。
液体分批培养是微生物发酵最常用的培养策略之一，也是实验室发酵灵菌红素所采用的基本培养模式。但是，灵菌红素的生产也可采用固体发酵的模式，如：Miao等比较了Serratia proteamacula 657的液体培养和固体培养过程，发现两者的灵菌红素产量分别为0.07 g/L和0.18 g/L[42]。此外，在微生物次级代谢产物生产过程中，分批补料发酵策略也常用于提高产物的产量。Tao等将该策略应用于灵菌红素的发酵，使菌体的生长和色素的合成分成两个阶段：第一阶段，以葡萄糖为主要碳源，有利于细胞的生长；第二阶段，通过补料的方式向培养基中添加甘油，促进灵菌红素的合成。在该策略的作用下，灵菌红素的产量比初始产量提高了7.8倍[28]。另外还有一些不同的细胞培养模式用于灵菌红素的发酵，例如：固定化细胞培养等。Chen等首先将S. marcescens C3在液体培养基中培养至OD600=10，离心收集菌体后包埋于海藻酸钙凝胶小球中继续发酵，最终色素的产量比对照组提高了近2倍，达15.6 g/L[43]。Bae等开发了一套新的一体式生物反应器，该反应器不仅提高了灵菌红素的产量，而且还简化了色素的分离步骤。其主要特点是：反应器内部包含1个由不锈钢滤网制成的平台，平台内填充聚合树脂用于吸附发酵过程中产生的色素，结果该反应器中灵菌红素的产量达13.1 g/L，比普通反应器提高了2.6倍[44]。
2.3 灵菌红素的分离纯化在微生物发酵过程中灵菌红素主要存在于细胞内，特别是附着在细胞膜上，因此需要经过一系列的分离纯化过程才能得到高质量的产品。目前，灵菌红素的分离方法主要包括有机溶剂提取法和树脂吸附法。有机溶剂提取法常用的试剂包括甲醇、丙酮、乙酸乙酯和氯仿等。Chen等将发酵液与甲醇混合振荡，离心收集上清，浓缩后经氯仿萃取得到灵菌红素粗品[43]。如此直接抽提发酵液会使液体的处理量增大，Juang等开发了一种以截留分子量为1 kDa的再生纤维素膜为材料，对甲醇抽提液进行超滤浓缩的方法，该方法可以使抽提液浓缩4倍，回收率为81%[45]。为了减少液体处理量，也可将发酵液离心后直接从细胞中抽提灵菌红素。笔者实验室对利用超声辅助提取S. marcescens jx1细胞中灵菌红素的条件进行了研究，结果发现以酸性丙酮为溶剂 (用量为27.2 mL/g细胞)，在23.4 ℃条件下提取17.5 min可以获得最好的提取效果[13]。
树脂吸附法主要利用树脂对灵菌红素的物理吸附作用，从发酵液中分离灵菌红素。但灵菌红素的水溶性差，在树脂吸附过程中仍需有机溶剂或表面活性剂的参与。Juang等利用明矾和甲醇对S. marcescens SMDR的发酵液进行预处理，去除菌体后的清液用大孔树脂HP-20进行吸附，最后用含90%甲醇和10% 0.2 mol/L HCl的混合液进行洗脱得到灵菌红素样品，该研究还发现树脂HP-20对灵菌红素的吸附过程是自发的放热过程 (?H=-1.78 kJ/mol)，仅受疏水作用的影响[46]。Wang等利用树脂X-5建立了灵菌红素发酵与分离相耦联的系统，该系统主要由发酵罐、泵和吸附柱组成，当发酵进行20 h后，发酵液经泵在吸附柱和发酵罐间循环，直至发酵结束，从吸附柱上洗脱得到灵菌红素，该耦联系统不仅免去了细胞分离的步骤，而且直接获得一定纯度的灵菌红素，该过程的总收率达83%[47]。
3 灵菌红素的合成途径及基因调控 关于灵菌红素在微生物细胞内的合成途径、相关基因及代谢调控一直是科研人员努力研究的方向，以期为灵菌红素的工业生产提供足够的理论依据。目前普遍认为灵菌红素的合成主要是由pig基因簇控制，通过两个分支途径共同完成，这两个分支途径分别合成灵菌红素的两个前体物质 (2-甲基-3-戊基吡咯(MAP) 和4-甲氧基-2,2-二吡咯-5-羧甲基乙醛 (MBC))，两者再经一步缩合反应生成灵菌红素[17]。下面将对灵菌红素的合成基因簇、合成途径及相关基因调控机制进行详细讨论。
3.1 合成基因簇到目前为止，已有多个微生物的灵菌红素合成基因簇被克隆、表达并测序，包括Serratia sp. ATCC 39006 (S39006)、S. marcescens ATCC 274 (Sma274)、H. chejuensis KCTC 2396 (Hch2396) 和詹森杆菌Janthinobacterium lividum strain BR01 (JliBR01) 等[17, 48-49]。其中Hch2396的基因簇命名为hap基因簇，其他3种微生物的基因簇均命名为pig基因簇。此外，S. marcescens FS14和S. marcescens WW4的pig基因簇也被测序鉴定，其结构与Sma274的pig基因簇非常相似[50]。hap基因簇和pig基因簇均包含13-15个与灵菌红素合成密切相关的基因 (如S39006的pigA-pigO)，如图 1所示。通过对这些基因的序列比对发现，尽管来自不同的微生物，但它们之间仍保持一定的序列相似性，其中，S39006和Sma274的pig基因簇相似性高达56.0%，相似性最低的是S39006和Hch2396的基因簇，仅为28.4%，其余的相似性均在30%-40%之间。
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| 图 1 灵菌红素合成基因簇[17, 48-49] Figure 1 Comparison of the gene clusters for prodigiosin biosynthesis[17, 48-49]. Genes that encode proteins required for the biosynthesis of MBC are showed in blue. Genes that encode proteins required for the biosynthesis of MAP are showed in green. Red block arrows show genes encoding the condensing enzyme. |
| 图选项 |
在基因的构成上，各个基因簇存在一定的差异，S39006的pig基因簇在3′端比其他基因簇多一个pigO基因，而且在其他基因簇中未发现同源基因，Harris等研究发现，pigO并不直接参与灵菌红素的合成，而是起到一定的调控作用[17]。此外，S39006 pig基因簇两端的基因orfY和orfZ也是该基因簇独有的，其中orfY编码的蛋白包含吡啶核苷酸二硫键氧化还原酶结构域，它与NADH氧化酶有较高的序列相似性，而orfZ的功能仍然未知[17]。Sma274的pig基因簇两端则是cueR和copA基因，Williamson等研究发现，cueR和copA与细胞内铜稳态平衡有关，当copA发生突变时，突变菌株对铜离子更加敏感，而且灵菌红素的产量得到提升，因此可以看出copA对灵菌红素的合成具有调节作用[51]。在Hch2396的hap基因簇的3′末端存在两个转录方向与hap基因簇相反的基因 (orf9和orf10)，它们与Vibrio vulnificus的组氨酸激酶和应答调控子具有较高的同源性，因此，认为这两个基因可以调控Hch2396合成灵菌红素[48]。JliBR01的pig基因簇与其他基因簇最大的区别是，pigB与pigC及pigJ与pigK以融合基因的形式存在，且在该基因簇中缺少pigN基因[49]。
在获得灵菌红素合成基因簇序列的基础上，研究人员对基因簇中各基因所编码的蛋白质进行了序列分析及功能研究。Williamson等对S39006 pig基因簇中各基因进行基因敲除或片段插入以构建相应的突变体，再通过液质联用 (LC-MS)、营养共生 (Cross-feeding) 及遗传互补 (Genetic complementation) 的方法分析各突变体发酵过程中产生的中间产物，从而确定各基因编码的蛋白在灵菌红素合成过程中的作用，结果发现PigB、PigD和PigE参与了MAP的合成，PigA、PigF、PigG、PigH、PigI、PigJ、PigM和PigN参与了MBC的合成，而MBC和MAP的缩合反应则由PigC催化实现，其中各蛋白的功能见表 3[52]。在上述蛋白中不包括PigK和PigL，因为两者并未直接参与灵菌红素的合成，其中PigK的作用是充当分子伴侣，协助一种或多种参与合成MBC的Pig蛋白进行正确折叠；PigL的序列同源性分析显示该蛋白是一种4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，而在MBC合成过程中存在磷酸泛酰巯基乙胺基的转移，在MAP合成时则不存在该转移过程，因此将PigK和PigL归属于MBC的合成途径[52]。Sma274、Hch2396和JliBR01的基因簇所编码的蛋白与S39006的相应Pig蛋白相比，其序列的一致性远远高于核酸序列的一致性 (表 3)，因此，它们与S39006的Pig蛋白具有较高的同源性，在蛋白的功能上也与S39006的Pig蛋白保持一致[17, 48-49]。
表 3 灵菌红素合成基因簇编码蛋白的功能Table 3 Functions and homologues of the gene products from the gene clusters for prodigiosin biosynthesis
| Protein | Function | Pathway | Comparison of homologous proteins (identity %)** | ||
| Pig (Sma274) | Hap (Hch2396) | Pig (JliBR01) | |||
| PigA | L-prolyl-PCP dehydrogenase | MBC | 79.0 | 50.3 | 51.0 |
| PigB | H2MAP oxidase/dehydrogenase | MAP | 71.3 | 39.3 | 41.0 |
| PigC | Condensing enzyme | Terminal step | 74.7 | 47.6 | 52.0 |
| PigD | 3-Acetyloctanal synthase | MAP | 82.8 | 50.3 | 52.9 |
| PigE | 3-Acetyloctanal aminotransferase | MAP | 85.2 | 58.2 | 60.7 |
| PigF | HBC O-methyl transferase | MBC | 82.8 | 58.7 | 58.2 |
| PigG | Peptidyl carrier protein (PCP) | MBC | 78.2 | 46.3 | 44.8 |
| PigH | HBM synthase (seryl transferase) | MBC | 77.0 | 53.4 | 55.6 |
| PigI | L-prolyl-AMP ligase | MBC | 67.1 | 41.1 | 39.5 |
| PigJ | Pyrrolyl-b-ketoacyl ACP synthase | MBC | 67.3 | 22.9 | 28.6 |
| PigK | Unknown | MBC | 71.2 | 45.2 | 45.3 |
| PigL | 4’-Phosphopantetheinyl transferase | MBC | 45.6 | 17.5 | 20.1 |
| PigM | HBM oxidase/dehydrogenase | MBC | 59.9 | 29.0 | 26.7 |
| PigN | Oxidoreductase* | MBC | 76.9 | 55.4 | / |
| PigO | Unknown | None | / | / | / |
| *It was putative function from sequence homology. **Percentage of identity was obtained by aligning the deduced amino acid sequences using CLUSTALW (http://www.genome.jp/tools/clustalw/). | |||||
表选项
除了对pig/hap基因簇所编码的蛋白进行系统性研究外，研究人员也对其中的某些蛋白进行了深入的研究。例如，PigC作为最终合成灵菌红素的关键酶，通过序列比对发现其包含ATP结合域和磷酸转移域，Chawrai等对Serratia 39006的PigC和H. chejuensis的HapC进行了克隆表达，并利用定点突变技术证实在PigC中，Glu-281、Arg295和His-840是该酶结合ATP及催化磷酸转移的关键氨基酸残基；底物特异性研究发现PigC除能够催化MAP和MBC的缩合反应外，还可以催化两者的结构类似物之间的缩合反应，最终生成灵菌红素结构类似物，为合成新的灵菌红素类色素提供了理论基础[53-54]。此外，包括PigE、PigF、PigI和HapK在内的多个蛋白的晶体结构得到解析[55-58]，从而能够更好地理解该蛋白在灵菌红素合成过程中的作用。
3.2.1 MAP的合成 MAP的合成途径如图 2所示。该途径以脂肪酸合成或不饱和脂肪酸自氧化过程中产生的2-辛烯醛为起始前体，在PigD的作用下与丙酮酸反应，其中，PigD与乙酰乳酸合成酶同源，可以催化丙酮酸脱羧，并将脱羧后的2C单元与2-辛烯醛结合生成3-Acetyloctanal；再由具有氨基转移活性的PigE催化合成氨基酮，氨基酮自环化形成环亚胺H2MAP；最后，H2MAP在PigB的催化下氧化脱氢形成MAP。
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| 图 2 灵菌红素的合成途径[10, 17, 48, 52] Figure 2 The biosynthetic pathway of prodigiosin[10, 17, 48, 52]. |
| 图选项 |
3.2.2 MBC的合成 MBC的合成以L-脯氨酸为起始底物，在PigI的作用下，L-脯氨酰基与PigG中的巯基结合形成复合物L-脯氨酰-S-PigG，再经PigA的催化下氧化脱氢得到吡咯-2-羧基-S-PigG，然后吡咯-2-羧基单元从PigG转移至PigJ活性中心的半胱氨酸得到吡咯-2-羧基-S-PigJ，同时PigH从一分子丙二酰辅酶A中夺取了丙二酰基，形成了复合物丙二酰基-S-PigH，该复合物脱羧后进攻吡咯-2-羧基-S-PigJ的硫酯键，生成了一种与PigH相连接的吡咯-β-酮基硫酯复合物，在PigH的作用下吡咯-β-酮基硫酯与丝氨酸反应生成4-羟基-2,2′-二吡咯-5-甲醇 (HBM)，HBM在PigM的催化下羟基被氧化成醛基得到4-羟基-2,2′-二吡咯-5-甲醛 (HBC)，最后，HBC的羟基在PigF和PigN的作用下被甲基化生成MBC，合成途径如图 2所示。
3.2.3 MAP与MBC的缩合 灵菌红素合成的最后一步即为MAP和MBC的缩合，催化该反应的酶是PigC，反应过程如图 2所示[10, 52]。Chawrai等对该过程的反应机理进行了解析：MBC和ATP首先与PigC相结合，分别进入该酶的催化中心及ATP结合域，然后PigC的磷酸转移域夺取ATP的磷酸基团，结合了磷酸基团的转移域进攻MBC的醛基，使醛基活化后，MAP进入催化中心与MBC发生缩合反应，最终生成灵菌红素并释放出磷酸基团[54]。
3.3 合成基因簇的转录调控灵菌红素合成基因簇的转录受多种因素联合调控，包括微生物本身的多个基因表达调控系统：群体感应系统和双组分系统，此外还包括多种调控蛋白。各调控系统和调控蛋白的作用及相互之间的联系如图 3所示。
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| 图 3 灵菌红素合成基因簇的转录调控 Figure 3 The transcriptional regulation of the prodigiosin biosynthetic gene cluster. The solid line arrows represent activation. The dotted line arrows represent suppression |
| 图选项 |
3.3.1 群体感应系统 群体感应 (Quorum sensing) 是细菌根据自身的细胞密度变化进行基因表达调控的系统，其基本原理是细菌通过感受自身在繁殖过程中分泌的某种信号分子，当该信号分子达到一定阈值时，细菌会启动某些基因的表达[59]。研究表明，S39006合成灵菌红素的过程受群体感应系统的调控，该系统主要由smaI和smaR两个基因组成，其中SmaI的作用是合成信号分子N-酰基-高丝氨酸内酯类 (AHLs) 化合物，当细胞密度较小时，AHLs浓度较低，SmaR与pig基因簇相结合，从而抑制该基因簇的转录；随着细胞的生长，AHLs的浓度不断增大，当AHLs浓度达到一定值时可以抑制SmaR结合DNA的活性，使pig基因簇得到转录表达，细胞开始合成灵菌红素[60-62]。在S. marcescens SS-1合成灵菌红素的过程中SpnI和SpnR构成了其群体感应系统[63]。
3.3.2 双组分系统 双组分系统 (Two-component regulatory systems) 是微生物为适应不同的环境变化而建立的基因表达调控体系，该系统主要由传感器激酶蛋白和应答调节蛋白组成[64]。研究发现，灵菌红素的合成至少受4个双组分系统的调控：PigQ/PigW、PhoB/PhoR、RssB/RssA和EepR/EepS。Fineran等研究表明，在PigQ/PigW双组分系统中，PigW作为传感器激酶蛋白，PigQ作为应答调节蛋白，当PigW感应到某一生理信号时促使PigQ磷酸化，磷酸化的PigQ促进pig基因簇的转录，从而促进灵菌红素的合成。当pigQ和pigW发生突变时，pig基因簇的转录水平和灵菌红素的产量都有所下降，因此，认为PigQ/W双组分系统对灵菌红素的合成具有正调控作用[62]。PhoB/ PhoR是S39006合成灵菌红素的另一个正调控双组分系统，该系统与细胞内磷酸盐 (Pi) 含量有关[65]。EepR/EepS是最新发现的一个具有正调控作用的双组分系统，其中EepR可以促进pig基因簇的转录，但是EepR的表达受环腺苷酸受体蛋白 (cAMP receptor protein，CRP) 的抑制，因此，对灵菌红素合成基因簇而言，CRP是一种间接负调控蛋白[66]。在4个双组分系统中，RssB/RssA是唯一一个具有负调控作用的系统，其中的应答调节蛋白RssB磷酸化后会阻碍pig基因簇的转录[67]。
3.3.3 其他调控机制 除了上述的调控系统外，灵菌红素合成基因簇的转录还受到多种蛋白的调节，主要包括PigP、PigT、PigX、HexS、PigS、PigR和PigV等，其中PigP是1个多功能转录调控因子，它不仅直接调节灵菌红素合成基因簇的转录，还对其他多种调控蛋白的转录具有调节作用[62] (图 3)。PigT是一种GntR家族转录因子，可以促进pig基因簇的转录，但是当环境 (培养基) 中存在葡萄糖酸盐 (Gluconate) 时，PigT的DNA结合活力会被抑制，从而削弱其对pig基因簇转录的激活作用[68]。PigX是一种环二鸟苷酸 (c-di-GMP) 磷酸二酯酶，包含一个GGDEF/ EAL结构域，该结构域与细胞合成c-di-GMP有关。研究发现，当pigX发生突变时，细胞内PigA和PigF的表达水平显著提高，灵菌红素产量比野生型菌株提高350%，因此，PigX是一种灵菌红素合成基因簇转录抑制因子[69]。HexS是LysR家族转录因子，对pig基因簇的转录起负调控作用，其主要调控机理是与pigA上游序列相结合，抑制pig基因簇的转录[70]。PigS属于SmtB/ArsR家族的转录抑制因子，Gristwood等研究发现pigS基因两端含有两个独立的操纵子 (blhA-orfY和pmpABC)，该操纵子的表达产物会抑制灵菌红素的合成，而PigS可以抑制这两个操纵子的转录表达，因此，对于灵菌红素合成而言，PigS是一种间接正调控因子，同时，PigP对pigS的转录具有促进作用[71]。此外，还包括PigR和PigV两种调控蛋白对灵菌红素的合成具有调节作用，其中PigR是一种腺苷酸环化酶，PigV是一种内膜蛋白，两者都可以促进灵菌红素的合成，但其作用机制尚未得到解析[62]。
4 结论与展望 灵菌红素作为一种重要的天然色素，近年来随着灵菌红素的应用范围不断扩大，其巨大的市场潜力也不断显现，只有实现灵菌红素的大规模工业化生产才能满足人们对其的需求。目前灵菌红素的合成研究主要集中在微生物发酵方面，以上关于灵菌红素高产菌株选育、发酵及提取工艺优化和生物合成途径及基因表达调控机制解析等方面的研究为灵菌红素的工业化生产奠定了坚实的基础。然而，发酵法生产灵菌红素工业化进程的关键瓶颈在于较低的产量和产率，为进一步加快微生物发酵法生产灵菌红素的进程，今后的研究应该从以下几个方面展开：1) 继续选育高产菌株：目前灵菌红素的发酵研究主要集中在沙雷氏菌属，自然界这个微生物多样性巨大宝库尚未完全打开，从自然界中筛选稳定高产的灵菌红素产生菌仍然是提高灵菌红素产量的有效方法；2) 继续深入研究灵菌红素合成途径中的关键酶：灵菌红素的生物合成涉及10多个酶的催化，各个酶的催化机制及其在灵菌红素合成过程中的重要性并未完全揭示，利用基因工程技术提高关键酶的活性有利于灵菌红素的产量；3) 代谢工程改造：目前，代谢工程技术应用在微生物生产灵菌红素的研究鲜见报道，通过代谢工程改造可以增强灵菌红素合成基因簇及其正调控因子的转录表达，抑制或削弱负调控因子的表达，从而有效提高微生物的灵菌红素产量；4) 发酵和提取工艺优化：继续优化灵菌红素发酵条件，采用原位分离发酵技术提高灵菌红素的产率。
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