1. 中国药科大学生命科学与技术学院，江苏 南京 210009
2. 中国人民解放军军事医学科学院 生物工程研究所，北京 100071
摘要：目前常用的基因修饰方法是在Red同源重组介导下，电转线性PCR片段替换染色体上指定序列。因PCR过程错误掺入，该方法常常会在同源序列部位产生一些突变。为了避免此类突变，我们建立了一种新的无痕删除方法。首先将含有抗性标记 (两侧带有I-Sec I识别位点) 的线性DNA电转到Red重组感受态细胞内，用抗性基因替换基因组上指定序列；然后，将携带融合同源臂 (两侧带有I-Sec I位点) 的供体质粒导入上述细胞，诱导表达I-Sec I内切酶切割供体质粒释放同源片段，同时切除染色体上抗性基因产生双链断裂，通过分子间同源重组实现无痕删除。我们应用该方法连续删除了大肠杆菌DH1基因组上11个非必需区，使基因组减小10.59%。PCR测序证明所有删减区域同源臂未发生突变，基因组重测序证明指定区域被删除。删减菌的生长变化不大，但耐酸能力有所改变，并对番茄红素合成有不同影响。
关键词： 大肠杆菌DH1Red同源重组无痕删除
Markerless DNA deletion based on Red recombination and in vivo I-Sec I endonuclease cleavage in Escherichia coli chromosome
Meiqin Zhu1, 2, Jian Yu1, 2, Changlin Zhou1, Hongqing Fang2
1. Institute of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, Jiangsu, China
2. Institute of Biotechnology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071, China
Received: February 10, 2015; March 24, 2015
Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2011CBA00800), National Natural Science Foundation of China (No. 81373286).
Corresponding authors: Hongqing Fang. Tel: +86-10-66948827; E-mail: fanghongqing@vip.sina.com
Abstract: Red-based recombineering has been widely used in Escherichia coli genome modification through electroporating PCR fragments into electrocompetent cells to replace target sequences. Some mutations in the PCR fragments may be brought into the homologous regions near the target. To solve this problem in markeless gene deletion we developed a novel method characterized with two-step recombination and a donor plasmid. First, generated by PCR a linear DNA cassette which comprises a I-Sec I site-containing marker gene and homologous arms was electroporated into cells for marker-substitution deletion of the target sequence. Second, after a donor plasmid carrying the I-Sec I site-containing fusion homologous arm was chemically transformed into the marker-containing cells, the fusion arms and the marker was simultaneously cleaved by I-Sec I endonuclease and the marker-free deletion was stimulated by double-strand break-mediated intermolecular recombination. Eleven nonessential regions in E. coli DH1 genome were sequentially deleted by our method, resulting in a 10.59% reduced genome size. These precise deletions were also verified by PCR sequencing and genome resequencing. Though no change in the growth rate on the minimal medium, we found the genome-reduced strains have some alteration in the acid resistance and for the synthesis of lycopene.
Keywords: Escherichia coli DH1Red homologous recombinationmarkerless deletion
大肠杆菌是工业上应用最广泛的宿主之一，如生产重组蛋白[1]和生物基产品[2]等。1997年大肠杆菌MG1655的基因组完整序列公布以来[3]，已经有一系列大肠杆菌基因组序列被测定，促进了大肠杆菌基因组功能研究。尽管大肠杆菌是人们最了解的模式生物，但其基因组中还有很多基因序列的功能未知[4]，增加了其代谢网络设计及调控的复杂性。为此，人们希望将一些不影响细胞生长的基因删除，构建一个所有基因功能确定的最小细胞底盘[5]。
最常见的基因无痕删除方法分为两类。一是通过一次电转将PCR扩增的带有Cm-IS序列 (带有I-Sec I切割位点的Cm抗性基因) 的打靶片段导入细胞内[6]，在Red重组酶帮助下，借助50 bp左右的同源臂，与染色体对应区域发生同源重组，使Cm-IS替换染色体上序列，然后再诱导表达I-Sec I内切酶，在Cm-IS处产生双链断裂，再次发生同源重组，实现染色体上基因无痕删除。第二种方法，通过两次电转导入打靶片段[5]。第一次导入的打靶片段中含有正负筛选标记，通过正筛选获得重组子。第二次导入的打靶片段不含筛选标记，通过负筛选标记筛选获得重组子，从而实现无痕删除。对基因组上DNA序列进行无痕删除操作，不仅可以获得特定DNA序列的功能信息，而且通过连续删减操作可以精简微生物基因组，构建合成生物学底盘细胞。2006年，Pósfai等[7]通过删除大肠杆菌MG1655中的非必需序列，获得了基因组减少了15%的大肠杆菌MDS42，菌株的生长特性没有发生改变，同时基因组稳定性和电转效率得到提高，并可表达一些毒素蛋白。2008年，Mizoquchi等[8]对大肠杆菌W3110基因组进行删减，获得了基因组减小22%的大肠杆菌MFG-01，菌株的生长特性并没有发生改变，细胞密度提高了1.5倍，苏氨酸的产量提高了2.4倍。最近Hirokawa等[9]将W3110基因组减小至2.98 Mbp，删减菌保持正常生长，但测序结果发现，删减区域同源臂发生一些碱基突变，可能是PCR扩增重组片段时碱基错误掺入引起。
为了避免在删除区域两侧同源区引入突变，我们建立了一种新的无痕删除方法。首先通过电转将PCR扩增的含有Cm-IS序列的打靶片段导入到基因组上，再导入一个带有融合同源臂LR-IS (融合同源臂LR的两侧含有I-Sec I切割位点) 的供体质粒，然后表达I-Sec I内切酶切割供体质粒释放融合同源臂与染色体发生重组实现无痕删除。只要供体质粒上的同源臂测序确证，就不会在染色体上对应区域引入突变。我们应用基因组比对方法从大肠杆菌DH1基因组中筛选出了64个非必需区[10]。利用本文方法对大肠杆菌DH1基因组进行了无痕删减，连续删除11个非必需区 (6、12、13、27、29、41、47、50、51、53和55等区[10])，获得了基因组减小了10.59%的删减菌DH11。相比原始菌株DH1，基因组删减菌的生长变化不大，但耐酸能力有所改变，并对番茄红素的合成有不同影响。
1 材料与方法 1.1 菌株、质粒及引物 菌株及质粒见表1，本实验室保存或本研究中构建。涉及的引物序列详见表2，由北京中科希林生物技术公司或上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
表1 本实验中所用的菌株及质粒Table 1 Strains and plasmids used in this study
| Strains and plasmids | Relevant characteristics | Source |
| E. coli strains | ||
| DH5α | supE44 lacZΔM15 hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 | This lab |
| DH1 | ATCC 33849. The genomic sequence is listed in Accession No. CP001637 | This lab |
| BL21 (AI) | F- ompT hsdSB ( rB- mB- ) gal dcm araB::T7RNAP-tetA | This lab |
| MG1655T7 | Derivative of wild type MG1655[7] , araB::T7RNAP-tetA | This study |
| MDS42T7 | Derivative of MDS42[7], a minimized MG1655, araB::T7RNAP-tetA | This study |
| DH06T7 | Derivative of DH06 (Table 3), araB::T7RNAP-tetA | This study |
| DH11T7 | Derivative of DH11 (Table 3), araB::T7RNAP-tetA | This study |
| Other DHx series | See in the Table 3 | This study |
| Plasmids | ||
| pUCIS | Derivative of pUC19 including Cmr with I-Sec I recognition site (IS) in its both sides | This lab |
| pBRIS | Derivative of pBR322 has a cloning site which containing IS site, Apa I site and Mlu I site | This lab |
| pAAGBE | Derivative of pKOBEG[11]with Cmr replaced by Ampr. A temperature-sensitive helper plasmid expresses Red recombinase by adding L-arabinose | This lab |
| pKAISGBE | A temperature-sensitive helper plasmid expresses I-Sec I endonuclease and Red recombinase by adding L-arabinose, Kanr | This lab |
| pAOC-GPS-CrtIB | The p15A ori plasmid including gps (multifunctional GGPP synthase), crtB and crtI expressing under control of T7 promoter, Cmr | This lab |
| pBRIS-XLR series | Derivatives of pBRIS, containing IS site, XL arm and XR arm. Also see in Table 3 | This study |
表选项
表2 本实验中所用引物Table 2 Primers used in this study
| Primer name | Primer sequence (5¢-3¢) | Primer name | Primer sequence (5¢-3¢) |
| BC5 | GTAGCACACGAGGTCTCT | 50L1# | CGGGGCCCAATCACCTCCAGCCTGAATAA |
| BC3 | TACGACTCACTATAGGGAGA | 50L2 | CTGACGTCCGGCGAAAGT |
| ISF | ACGATGAGCGCATTGTTAG | 50R1$ | ACTTTCGCCGGACGTCAGCAGCGCAACCAAACTCCA |
| ISR | GAGTTGGTAGCTCTTGATC | 50R2## | CGACGCGTCGCAGTGACCGTGAGAAG |
| 51L5 | TATTCGACCAAGTTCGCCTC | 50-0 | TTCTCGGCGGTCTGATTG |
| 51L3 | AGAGACCTCGTGTGCTACGTAATACGAGAGTGGACGGT | 50-1 | CCAGAGTCGCGTCGTTGT |
| 51R5** | TCTCCCTATAGTGAGTCGTAAGTGAGCGAAGCCC TATC | 53L5 | CGGGTTTCGCCTGTCTGA |
| 51R3 | CTCCGATGCGATCCTGAC | 53L3 | AGAGACCTCGTGTGCTACTTCCATATAACGGCCCTGTA |
| 51L1# | CGGGGCCCTATTCGACCAAGTTCGCCTC | 53R5** | TCTCCCTATAGTGAGTCGTACCACCGCTGCAAACAAAGT |
| 51L2 | GTAATACGAGAGTGGACGGT | 53R3 | ACTGGGCGTACCGAAAGAT |
| 51R1$ | ACCGTCCACTCTCGTATTACAGTGAGCGAAGCCCTATC | 53L1# | CGGGGCCCCGGGTTTCGCCTGTCTGA |
| 51R2## | CGACGCGTCTCCGATGCGATCCTGAC | 53L2 | TTCCATATAACGGCCCTGTA |
| 51-0 | TGGACGCT GCGGGATTTA | 53R1$ | TACAGGGCCGTTATATGGAACCACCGCTGCAAACAAAGT |
| 51-1 | GCTGTTAAAGCCGAAGAGTA | 53R2## | CGACGCGTACTGGGCGTACCGAAAGAT |
| 13L5 | TCATTGATCT GTAACGCACT | 53-0 | GTGGTCGTCGTGATGTAATG |
| 13L3 | AGAGACCTCGTGTGCTACAGTCGCTTCAAATATATGATGC | 53-1 | TGAACGTGCCGACGGTAAAT |
| 13R5** | TCTCCCTATAGTGAGTCGTACCACAGAGTTTCTTCTTTAG | 41L5 | AACAGGAGGATGCCAGAC |
| 13R3 | AAACGCTATTAGGCAGACCA | 41L3 | AGAGACCTCGTGTGCTACCGTTCACGGTCTGTCCAA |
| 13L1# | CGGGGCCCTCATTGATCT GTAACGCACT | 41R5** | TCTCCCTATAGTGAGTCGTAGCCAGCACCGCTTACAGT |
| 13L2 | AGTCGCTTCAAATATATGATGC | 41R3 | TACAACGCACGCCAGAGG |
| 13R1$ | GCATCATATATTTGAAGCGACTCCACAGAGTT TCTTCTTTAG | 41L1# | CGGGGCCCAACAGGAGGATGCCAGAC |
| 13R2## | CGACGCGTAAACGCTATTAGGCAGACCA | 41L2 | CGTTCACGGTCTGTCCAA |
| 13-0 | C ACCATCCACG GACTGAA | 41R1$ | TTGGACAGACCGTGAACGGCCAGCACCGCTTACAGT |
| 13-1 | AATATCAGCCTCGCCACACT | 41R2## | CGACGCGTTACAACGCACGCCAGAGG |
| 6L5 | CTT TCGGGATATT GAGTGC | 41-0 | TGCCTGTAGCTTGCTCAAA |
| 6L3 | AGAGACCTCGTGTGCTACCCACGTTGCGCTCCTCTT | 41-1 | CGGTAAGCCTCGCATCAA |
| 6R5** | TCTCCCTATAGTGAGTCGTAAGCGTGATGGTGACTCGTT | 55L5 | CAACATCGCCAGCTTCATC |
| 6R3 | GTTGCTGGTGGGTTTAGAAT | 55L3 | AGAGACCTCGTGTGCTACCATCATCATTACTCAAGGTGG |
| 6L1# | CGGGGCCCCTTTCGGGATATTGAGTGC | 55R5** | TCTCCCTATAGTGAGTCGTATAGATGTACGTTGATATCGGTT |
| 6L2 | CCACGTTGCGCTCCTCTT | 55R3 | GACAGATCGGAATGGCAGA |
| 6R1$ | AAGAGGAGCGCAACGTGGAGCGTGATGGTGACTCGT T | 55L1# | CGGGGCCCCAACATCGCCAGCTTCATC |
| 6R2## | CGACGCGTGTTGCTGGTGGGTTTAGAAT | 55L2 | CATCATCATTACTCAAGGTGG |
| 6-0 | CACCAGGCCGACA ATAGG | 55R1$ | CCACCTTGAGTAATGATGATGTAGATGTACGTTGATATCGGTT |
| 6-1 | CGGCCTTTCCCATCACTA | 55R2## | CGACGCGTGACAGATCGGAATGGCAGA |
| 29L5 | GT GCCGAAGGAG TGGGTT | 55-0 | AAACGGGTGAAGAACTACTG |
| 29L3 | AGAGACCTCGTGTGCTACCACGCACGCAGAAACTCC | 55-1 | TCCAGCCAATCCCGACAC |
| 29R5** | TCTCCCTATAGTGAGTCGTACCCCACTTATTCGCACCT | 12L5 | CCCGCACCATCGTTACCT |
| 29R3 | CCGCCATAATCAAACAACAG | 12L3 | AGAGACCTCGTGTGCTACATGCCAGAGCAAGCAATAAC |
| 29L1# | CGGGGCCCGTGCCGAAGGAGTGGGTT | 12R5** | TCTCCCTATAGTGAGTCGTAGGGGTAAAGTATCAGGAGA |
| 29L2 | CACGCACGCAGAAACTCC | 12R3 | TCGGTGATTAGTATCCCATTA |
| 29R1$ | GGAGTTTCTGCGTGCGTGCCCCACTTATTCGCACCT | 12L1# | CGGGGCCCCCCGCACCATCGTTACCT |
| 29R2## | CGACGCGTCCGCCATAATCAAACAACAG | 12L2 | ATGCCAGAGCAAGCAATAAC |
| 29-0 | GGCTTTGAGCAGTT GATG | 12R1$ | GTTATTGCTTGCTCTGGCATGGGGTAAAGTATCAGGAGA |
| 29-1 | CCCATTCCCACTTCGTTA | 12R2## | CGACGCGTTCGGTGATTAGTATCCCATTA |
| 47L5 | AGCTACGCCAACCTGTCT | 12-0 | GATTCTGCCGATCCTCTG |
| 47L3 | AGAGACCTCGTGTGCTACAGTTAGCGCTTATGGGAGTA | 12-1 | ATGATCTTCGCCTGCTCG |
| 47R5** | TCTCCCTATAGTGAGTCGTAATCAGCTTGTCGTCGTGC | 27L5 | GTTGAAGCGGTGGCAGAA |
| 47R3 | TAGGTCGGGAAATTGTACTT | 27L3 | AGAGACCTCGTGTGCTACTGCATTGGTTTCATCCCTG |
| 47L1# | CGGGGCCCAGCTACGCCAACCTGTCT | 27R5** | TCTCCCTATAGTGAGTCGTACATTACCGCTTTATCCGCAA |
| 47L2 | AGTTAGCGCTTATGGGAGTA | 27R3 | CGCTGGGATGGTCGTAGTT |
| 47R1$ | TACTCCCATAAGCGCTAACTATCAGCTTGTCGTCGTGC | 27L1# | CGGGGCCCGTTGAAGCGGTGGCAGAA |
| 47R2## | CGACGCGTTAGGTCGGGAAATTGTACTT | 27L2 | TGCATTGGTTTCATCCCTG |
| 47-0 | ACTGCAACACGCTGGACG | 27R1$ | CAGGGATGAAACCAATGCACATTACCGCTTTATCCGCAA |
| 47-1 | ACAGGACGGGTTCGGAGA | 27R2## | CGACGCGTCGCTGGGATGGTCGTAGTT |
| 50L5 | AATCACCTCCAGCCTGAATAA | 27-0 | GGTGTTCAGCGATGTGCG |
| 50L3 | AGAGACCTCGTGTGCTACCTGACGTCCGGCGAAAGT | 27-1 | CGTCACCGTTTCTTTCATAC |
| 50R5** | TCTCCCTATAGTGAGTCGTACAGCGCAACCAAACTCCA | AT5 | ACTTTATCGCCATCGGTGAC |
| 50R3 | CGCAGTGACCGTGAGAAG | AT3 | GTAGTGATGAATCTCTCCTG |
表选项
1.2 主要试剂及仪器 质粒小量快速提取试剂盒、胶回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术公司。基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技公司。高保真Prime STARTM HS DNA聚合酶，限制性内切酶ApaⅠ、MluⅠ、15 000、250 bp DNA Ladder marker购自TaKaRa公司；T4 DNA连接酶、EasyTaq DNA聚合酶购自北京全式金生物技术公司；DpnⅠ购自NEB公司。番茄红素标准品购自Sigma公司。DNA Thermal Cycler T Personal购自Biometra公司；电转仪ECM399购自美国BTX公司；1 mm电击杯购自美国BIO-RAD公司。
1.3 基因无痕敲除 在进行基因无痕删除准备阶段，需要PCR扩增第一步的打靶片段，并构建第二步的供体质粒。
以DH1基因组为模板，分别以XL5&XL3、XR5&XR3为引物，用Prime STARTM HS DNA聚合酶PCR扩增获得约500 bp的同源臂XL53、XR53 (X为表3中不同非必需区编号)；以pUCIS质粒为模板，以BC5&BC3为引物，PCR扩增两侧含有I-Sec I位点Cm抗性片段BC，对BC片段进行Dpn I处理消除残余模板质粒；以XL、BC、XR为共同模板，以XL5&XR3为引物，重叠PCR扩增得到约2.5 kb的打靶片段XLRC (参见图1A和表3)。
表3 累积删除基因组中11个非必需区Table 3 The 11 nonessential sequences in the Escherichia coli DH1 genome and their cumulative deletion
| Deletion region/Length | PCR fragment in first recombination | The donor plasmid in second Recombination | Strains after cumulative deletion in order |
| 51 (3482313…3609066)/126 754 bp | 51LRC | pBRIS-51LR | DH01 |
| 13 (850854…897880)/47 027 bp | 13LRC | pBRIS-13LR | DH02 |
| 6 (246357…265152)/18 796 bp | 6LRC | pBRIS-6LR | DH03 |
| 29 (1797471…1811875)/14 405 bp | 29LRC | pBRIS-29LR | DH04 |
| 47 (3271785…3305875)/34 091 bp | 47LRC | pBRIS-47LR | DH05 |
| 50 (3466141…3481012)/14 872 bp | 50LRC | pBRIS-50LR | DH06 |
| 53 (3697930…3704311)/6 382 bp | 53LRC | pBRIS-53LR | DH07 |
| 41 (2782237…2839088)/56 852 bp | 41LRC | pBRIS-41LR | DH08 |
| 55 (3912835…4017200)/104 366 bp | 55LRC | pBRIS-55LR | DH09 |
| 12 (747456…773166)/25 711 bp | 12LRC | pBRIS-12LR | DH10 |
| 27 (1693213…1734787)/41 575 bp | 27LRC | pBRIS-27LR | DH11 |
表选项
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| 图1 打靶片段 (A) 和供体质粒 (B) 的构建 Fig.1 Construction of targeting PCR fragments (A) and plasmid PBRIS-XLR (B). |
| 图选项 |
供体质粒构建过程如图1B所示。以DH1基因组为模板，用Prime STARTM HS DNA聚合酶，分别以XL1&XL2、XR1&XR2为引物扩增L5ʹ端和R3ʹ端分别带有ApaⅠ和MluⅠ酶切位点的XL、XR片段，R的5ʹ端引入XL的反向互补序列。以同源臂XL和XR为共同模板，以XL1&XR2为引物，重叠PCR扩增约1.2 kb融合同源臂片段XLR，电泳胶回收。质粒pBRIS和融合同源臂片段XLR先经ApaⅠ和MluⅠ双酶切，再用T4 DNA连接酶连接，转化DH5α，涂布Tet (10 mg/L) 抗性LB平板筛选，以测序引物ISF&ISR进行菌落PCR验证，再送北京中科希林生物技术公司测序确证，测序正确的质粒命名为pBRIS-XLR (参见表3)。
基因无痕删减实验过程分为两步进行 (图2)。
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| 图2 基因组无痕敲除技术原理 Fig.2 The schematic diagram of gene knockout. |
| 图选项 |
第一步重组，含有辅助质粒pAAGBE的菌株接入含有100 mg/L Amp的LB液体培养基 (10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母抽提物，10 g/L NaCl)中，于30 ℃培养至OD600≈0.6，加入终浓度为0.2%的L-阿拉伯糖诱导1 h制备电转感受态[10]，电转导入打靶片段XLRC，在Red同源重组酶介导下，两端带有I-Sec I位点的Cm抗性基因筛选标记替换了基因组上左右同源臂XL和XR之间的区域序列，涂Cm (50 mg/L) 平板。用敲除区同源臂外侧引物X-0&X-1进行PCR鉴定，阳性条带约为2.3 kb。保存阳性菌株，命名为DH-XLRC。
第二步重组，将辅助质粒pKAISGBE和供体质粒pBRIS-XLR化转至DH-XLRC，涂Kan/Tet平板。挑取单菌落过夜培养。次日，转接至5 mL液体LB (含50 mg/L Kan) 中培养到OD600≈0.3时加入0.2% L-阿拉伯糖，继续培养4-5 h。诱导后菌液稀释到10-4或10-5，涂无抗性的LB平板。以X-0&X-1为引物进行PCR鉴定，阳性重组约为1.3 kb。阳性菌株转接至Cm液体LB和Tet液体LB中，验证Cm及Tet的敏感性。将PCR产物送北京中科希林生物技术公司测序，序列正确的菌株保存，根据删除顺序命名为DH01-DH11 (参见表3)。
1.4 基因组重测序 在连续删除11个区域后，将删减菌株DH08、DH11和出发菌株DH1接入LB培养基中培养至对数生长末期，收集菌液，用基因组提取试剂盒提取基因组DNA，送北京新基永康基因科技公司进行基因组重测序分析，以CP001637为参考序列。
1.5 菌株在M9培养基中的生长采用M9培养基 (1 g/L NH4Cl，6 g/L Na2HPO4，3 g/L KH2PO4，0.2407 g/L MgSO4，0.011 1 g/L CaCl2，4 g/L葡萄糖，5 mg/L维生素B1) 培养DH1菌株及其删减菌株DH1-06、DH1-11。将过夜培养菌液分别转至含30 mL M9培养基的150 mL三角瓶中，37 ℃、220 r/min培养。每2 h取一次样品测OD600。
1.6 菌株的耐酸性 转接过夜培养菌液至装有5 mL LB培养基的大试管中，于37 ℃、220 r/min培养3 h。用LB培养基稀释至OD600=0.3。取1 mL稀释后菌液，4 ℃离心5 min，去上清，菌体沉淀用1 mL 酸化LB培养基 (用1 mol/L盐酸将LB培养基调至pH 2.45) 重悬，移至试管中，于37 ℃、220 r/min培养30 min后，离心去上清。菌体沉淀再用1 mL LB培养基洗涤2次；最后菌体沉淀用4 mL LB培养基重悬移至大试管中，于37 ℃、220 r/min培养2 h后，测OD600。同时以未酸化处理的菌体为对照，以两者的比值表示菌株的耐酸能力[12]。以DH1菌株的耐酸能力为基准 (设为100)，计算各个删减菌株的相对耐酸能力值。值越小表示耐酸能力越弱。
1.7 番茄红素的合成为了表达T7启动子控制番茄红素合成途径，首先将来自BL21 (AI) 基因组的T7RNA聚合酶表达元件，整合到DH1、DH06、DH11、MG1655和MDS42菌株的基因组上。以BL21 (AI)基因组为模板，以AT5&AT3为引物，用Prime STARTM HS DNA聚合酶进行PCR扩增，获得T7 RNA聚合酶表达元件与Tet元件融合片段。然后电转到Red重组感受态细胞中，通过Tet (10 mg/L) 抗性LB平板筛选，PCR验证，获得DH1-T7、DH06-T7、DH11-T7、MG1655T7和MDS42T7菌株。
绘制番茄红素标准曲线：用丙酮配制不同浓度的番茄红素标准品 (0.5、1、1.5、2、2.5 mg/L)，测样品OD474，绘制番茄红素浓度与OD474值的标准曲线。
将具有Cm抗性质粒pAOC-GPS-CrtIB分别转化至DH1-T7、06-T7、11-T7、MG1655T7和MDS42T7中，构建表达番茄红素的菌株。含质粒pAOC-GPS-CrtIB菌株接种到Cm抗性LB培养基中，于30 ℃、220 r/min培养过夜。将过夜菌液转接至FM2GA培养基 (15 g/L蛋白胨，12 g/L酵母抽提物，3 g/L NaH2PO4·2H2O，7 g/L K2HPO4·3H2O，2.5 g/L NaCl，0.5 g/L MgSO4，0.5%Tween 80，1.5%甘油，0.2%葡萄糖，0.2% L-阿拉伯糖) 中，调整接种量使起始OD600=0.2，于30 ℃、220 r/min培养12 h，测定OD600值，同时取3 mL菌液离心4 min，去上清，3 mL超纯水重悬去上清；加3 mL丙酮，充分重悬后55 ℃水浴避光孵育15 min，离心取上清测OD474数值[13]。根据标准曲线计算原菌液番茄红素浓度CL (mg/L)。计算单位番茄红素含量YSC (mg/g DCW)，计算公式如下：Ysc=CL/(0.37×OD600) (每个OD600每升菌液的细胞干重约为0.37 g)。
为了证明该方法可以避免在同源臂区域产生突变，在完成每一步无痕删除后，挑4个PCR阳性克隆，对PCR产物进行测序，发现删减后菌株基因组在同源臂区域序列均没有发生突变。
为了确证累积删减菌株DH11中11个敲除区的成功去除，用11对引物进行PCR鉴定电泳 (结果见图3)，各敲除区的鉴定都呈现阳性条带，约1.3 kb，对照菌DH1因该区域长度均在10 kb以上，所以在相同条件下的PCR扩增不出条带。其中47区同源臂外引物47-0&47-1鉴定DH1时出现条带，且条带大小大于阳性条带，可能是非特异性扩增导致。基因组重测序结果也证明DH08及DH11中47区均被删除。
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| 图3 PCR验证删减菌DH11 Fig.3 Verification of the minimized strain DH11 by PCR. 1-2: primers 51-0&51-1; 3-4: primers 13-0&13-1; 5-6: primers 6-0&6-1; 7-8: primers 29-0&29-1; 9-10: primers 47-0&47-1; 11-12: primers 50-0&50-1; 13-14: primers 53-0&53-1; 15-16: primers 41-0&41-1; 17-18: primers 55-0&55-1; 19-20: primers 12-0&12-1; 21-22: primers 27-0&27-1; M: DNA marker; 1,3,5,7,9,11,13,15,17,19 & 21: DH11; 2,4,6,8,10,12,14,16,18,20 & 22: DH1. |
| 图选项 |
基因组重测序分析结果表明，DH08和DH11中分别有8个和11个指定区域被删除 (图4)。与报道的大肠杆菌DH1基因组序列AP012030.1和 CP001637进行比对，发现本实验室保存的DH1菌株与CP001637相似度更高。
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| 图4 基因组重测序结果比较 Fig.4 The comparation of the genome resequencing results. (A) The reference sequence CP001637. (B) The genome-reduced strain DH08. (C) The genome-reduced strain DH11. (D) Lab strain DH1. |
| 图选项 |
2.2 基因敲除突变菌株在M9培养基中的生长 选择MY9培养基，是为了排除其他碳源对菌体生长的影响，比较准确地测定出发菌DH1和敲除菌DH1-06、DH1-11的生长特征。敲除菌DH1-06、DH1-11在MY9培养基中的生长曲线与出发菌DH1差别不大 (图5)，说明基因组敲除后，菌株在MY9培养基中的生长代谢特征与出发菌株相比，变化不大。
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| 图5 DH1、DH06、DH11在M9培养基中生长代谢图 Fig.5 Growth curves of DH1, DH06 and DH11 in the minimal medium M9. |
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| 图6 DH1及其基因组删减菌的相对耐酸能力 (DH1. * P<0.01; ** P<0.03; *** P<0.06) Fig.6 Relative acid resistance of DH1 and its reduced-genome strains. Comparing with DH1,* P<0.01; ** P<0.03; *** P<0.06. |
| 图选项 |
2.4 基因敲除对番茄红素合成的影响为了能够表达T7启动子控制下番茄红素合成途径 (pAOC-GPS-crtBI)，我们先应用Red重组技术将来自BL21 (AI) 基因组上阿拉伯糖诱导的T7 RNA聚合酶元件，移植到DH1、DH06、DH11、MG1655和MDS42基因组上，分别构建了DH1T7、DH06T7、DH11T7、MG1655T7和MDS42T7等菌株。在FM2GA自诱导培养基中培养，L-阿拉伯糖诱导表达基因组上的T7-RNA聚合酶基因，然后启动质粒上番茄红素合成途径表达，合成番茄红素。如图7所示，相比DH1，其删减菌DH06合成番茄红素的能力提升，DH11合成番茄红素的能力没有变化。而相比MG1655，其删减菌MDS42合成番茄红素的能力明显下降。
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| 图7 不同菌株合成番茄红素的能力 (与DH1-T7比较，* P<0.01；与MG1655T7比较，** P<0.01) Fig.7 Lycogene specific production in the different strains. Comparing with DH1-T7,* P<0.01; comparing with MG1655T7,** P<0.01. |
| 图选项 |
3 讨论 基因组无痕删减技术是研究微生物基因组功能的有效工具。Red同源重组技术目前已广泛用于基因删除、突变[14]以及基因整合[15]。应用Red同源重组技术进行基因无痕删除是大肠杆菌基因组删减的主要方法[16, 17, 18, 19]。文献中主要研究对象为大肠杆菌MG1655[6, 7]和W3110[5, 8]，分别采用了两种不同的策略。前者采用50 bp左右的同源臂及双链断裂促进同源重组；后者采用约1 kb的同源臂和正负筛选标记。
大肠杆菌DH1是实验室常用菌株之一。为了构建大肠杆菌DH1的基因组删减菌，我们对Red同源重组过程进行了优化。首先优化了大肠杆菌DH1的电转条件。开始按文献报道的电转条件进行电转，在抗性筛选平板上没有长出菌落。所以我们优化了电转感受态的制备条件，发现将OD600从0.3提高到0.6，同时将L-阿拉伯糖诱导时间从45 min延长至1 h，电转后可以得到阳性克隆。其次，采用500 bp左右的同源臂，提高第一步的重组效率。再次，在第二次同源重组中采用供体质粒引入融合同源臂，在双链断裂后与染色体进行同源重组，即提高重组效率，也可以消除PCR产生的突变。我们没有采用负筛选标记，第二步重组的阳性率仍然能够高于30%。采用这种策略，成功地连续敲除了DH1基因组上11个区域，总删除长度约0.49 Mbp，获得了基因组减小了10.59%的删减菌DH11。PCR产物测序以及基因组重测序结果表明，所有删除区域的同源臂没有发生突变，目标区域均被删除。经过基因组敲除减小的菌株DH06、DH11和出发菌DH 1相比，在M9培养基中，生长没有受到明显改变。
野生型大肠杆菌具有较好的耐酸能力。大肠杆菌的耐酸性机制非常复杂，受到很多调节子的递阶调控[20, 21, 22]。我们对不同基因组减小菌株的耐酸能力做了测定。与出发菌对比，在敲除50区后，所有敲除菌的耐酸能力有所下降，推测50区中存在调节耐酸能力的相关基因，可以作进一步的分析研究。目前我们已经连续删除了DH1基因组中56个非必需区，发现继续删除后，菌株的耐酸能力又得到恢复。说明大肠杆菌其耐酸能力的调节机制非常复杂[22]。
我们以番茄红素的合成能力来考察基因组删减菌对产物合成能力的影响。结果显示，相比DH1，DH06 (基因组减小了5.53%) 合成番茄红素的能力有较明显提高，但DH11 (基因组减小了10.59%) 合成番茄红素能力没有明显改变。而相比野生菌MG1655，其删减菌MDS42 (基因组减小了15%) 的番茄红素合成能力则明显下降。由此可见，不同程度的删减菌对产物合成能力的影响不同，其原因需要从代谢网络调控方面进行深入研究。基因组中很多基因序列的功能还不清楚，虽然对生长影响不大，但可能对产物合成有抑制作用或促进作用。目前正确地分析细胞代谢网络还有很多困难[23, 24]，构建一个代谢网络调控路径清晰的最小底盘细胞将会促进产物合成研究的发展[25]。
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