阮楚晋1,4, 郑小伟1, 王丽1, 王铱1, 朱雅新1, 王剑1, 贠娟莉1, 董志扬1, 陆祖军4, 黄英1, 杜文斌1,3, 黄力1,2, 戴欣1,2
1. 中国科学院微生物研究所, 微生物资源前期开发国家重点实验室, 北京 100101;
2. 中国科学院大学生命科学院, 北京 100049;
3. 中国科学院大学存济医学院, 北京 100049;
4. 广西师范大学生命科学学院, 广西 桂林 541006
收稿日期：2020-07-15；修回日期：2020-10-17；网络出版日期：2021-01-15
基金项目：国家自然科学基金(91951105)；中国大洋矿产资源研究开发协会十三五项目(DY135-B-02)；“科学”号高端用户项目(KEXUE2019GZ05)
作者简介：戴欣, 中国科学院微生物研究所副研究员, 硕士生导师。长期从事深海、深部地下、热泉、瘤胃等极端环境微生物分子生态学研究。通过元基因组学、元转录组学和单细胞基因组学以及特殊分离培养技术解析极端环境微生物多样性及其互作, 发掘重要功能微生物菌种资源及基因资源。先后主持多个国家自然科学基金项目, 并作为骨干人员参加"国家重点基础研究发展计划"以及大洋"十一五"、"十二五"和"十三五"等课题研究。在Geobiology、Environmental Microbiology、Applied and Environmental Microbiology、Frontiers in Microbiology、International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology(IJSEM)等期刊发表论文30余篇.
*通信作者：戴欣。Tel/Fax: +86-10-64807418;E-mail: daixin@im.ac.cn.
摘要：[目的] 建立适用于海洋微生物的流式细胞分选与高通量单细胞培养的方法，通过该方法从印度洋深海样品中分离微生物纯培养菌株。[方法] 利用流式细胞仪单细胞分选功能，以前向角(FSC)和侧向角(SSC)散射光信号代替荧光信号作为分选逻辑，对深海水体和沉积物样品中微生物进行单细胞高通量分选和培养。[结果] 确定了流式细胞分选的区域和条件，发现所建立方法适于分离海洋水体微生物，而不是沉积物微生物。从印度洋深海水体样品中获得61个潜在新菌株，分属于6个新属种，占分离菌株总数的26.29%，其16S rRNA基因序列与已培养的模式菌株相似性为89.79%-95.37%。[结论] 本研究所建立的方法有助于提高发现海洋微生物新物种的效率，获得更多新的海洋微生物资源。
关键词：微生物培养单细胞流式细胞仪深海
Isolation of deep-sea microorganisms by flow cytometry-based high-throughput cell sorting and single cell cultivation
Chujin Ruan1,4, Xiaowei Zheng1, Li Wang1, Yi Wang1, Yaxin Zhu1, Jian Wang1, Juanli Yun1, Zhiyang Dong1, Zujun Lu4, Ying Huang1, Wenbin Du1,3, Li Huang1,2, Xin Dai1,2
1. State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China;
2. College of Life Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
4. College of Life Sciences, Guangxi Normal University, Guilin 541006, Guangxi Province, China
Received: 15 July 2020; Revised: 17 October 2020; Published online: 15 January 2021
*Corresponding author: Xin Dai. Tel/Fax: +86-10-64807418; E-mail: daixin@im.ac.cn.
Foundation item: Supported by the National Natural Science Foundation of China (91951105), by the China Ocean Mineral Resources R & D Association (DY135-B-02) and by the Senior User Project of RV KEXUE (KEXUE2019GZ05)
Abstract: [Objective] To test a single cell cultivation method involving flow cytometry-based high-throughput cell sorting and single cell cultivation in the isolation of microorganisms from deep-sea samples. [Methods] The flow cytometer sorted to microbial cells of interest based on the size and complexity of the particles using forward versus side scatter gating (SSC vs. FSC) without the need for fluorescence labeling. Then, the single cells were cultivated in 96-well plates and further transferred to agar plate for scale-up cultivation and taxonomic identification. The performance of this method to cultivate microorganisms from deep-sea water and sediment samples was evaluated. [Results] An optimal sort region was chosen to sort microbial cells from the deep-sea samples, following by high-throughput single-cell broth cultivation. A total of 61 potential novel microbial strains, which belong to 6 novel genus or species, were obtained from deep-sea samples from the Indian Ocean. The novel strains accounted for 26.29% of the total isolates and shared 89.79%-95.37% similarity at the 16S rRNA gene sequence level. [Conclusion] The FCM-based high-throughput cell sorting and single-cell cultivation method is more suitable for sorting and cultivating of sea-water microorganisms. This methed may help increase the efficiency of identifying novel species from deep seas.
Keywords: microbial cultivationsingle cellflow cytometrydeep sea
海洋占地球面积的70%，而海洋面积的75%以上是水深大于1000 m的深海。长期生活在高压、低温(或高温)、无光环境的深海微生物，具有适应该环境的独特代谢途径及防御机制[1]。破解深海微生物及其遗传机制和代谢特点，揭示它们在海洋生态环境中的作用及机制，有助于加深对生命过程特别是极端生命和低能量生命过程的认识。另外，深海微生物丰富的多样性和独特的代谢能力，使其成为解决气候、能源、环境、医药等问题不可或缺的资源宝库。研究表明，环境中(包括海洋)绝大多数微生物仍未可培养[2]，尽管基于元基因组、元转录组学的研究工作有助于揭示海洋微生物在物种、代谢潜力以及生态功能等方面存在的巨大多样性[3-4]，但由于缺乏可培养的菌株，使人们证实这些微生物的生理代谢特点并验证基于它们基因组分析形成的假说，也限制了对其利用价值的深入研究和发掘[5]。
在过去的20多年里，人们先后尝试了一系列的海洋微生物分离培养策略及技术，如稀释培养(dilution culture)[6]、极限稀释(dilution-to-extinction)的高通量培养(high-throughput culturing，HTC)[7]，微胶囊包埋培养(microencapsulation cultivation)[8]、扩散盒培养(diffusion chamber)[9]、微生物分离芯片(isolation chip)[10]培养等，这些方法提高了海洋微生物的可培养率[5]，使人们获得了诸多新微生物纯培养类群。事实上，微生物的分离培养不再是一种过时的工作，而是微生物学家今天面临的主要挑战，也是一个快速发展的研究领域[11]。
分离是获得纯培养物过程中最关键的一步[12]。常见的微生物单细胞分离分选方法有传统的涂布或划线(spreading或streaking)分离[12]、基于显微操作的光镊(optical tweezers)分离[13]、液体连续梯度稀释(liquid serial dilution)分离以及结合液滴微流控(droplet-based microfluidics) (包括结合拉曼等检测技术的微流控分离培养)[14-15]和流式细胞术(flow cytometry)[16]等高通量微体积的分选和分离方法。其中，流式细胞技术是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术[17]，该技术主要用于细胞特别是哺乳动物细胞的遗传代谢和表达差异分析，近年也有用于微生物细胞检测的报道[18-20]，以流式细胞仪与荧光激活的细胞分选(fluorescence-activated cell sorting，FACS)为主，从而提高单细胞分选的速度和效率。2001-2002年，Manome和Zengler的实验室[21-22]率先将流式细胞术与凝胶微滴(gel microdroplet，GMD)结合进行环境样品微生物单细胞分选和培养。由于自然环境中大部分微生物本身并不含有荧光色素或分子，而与微生物细胞组分(如DNA或蛋白质)特异结合的荧光染料往往会抑制后续的细胞培养，因此无标记的流式细胞分选(label-free flow cytometric cell sorting)技术成为环境样品微生物单细胞高通量分离和培养的首选[23]。目前这一技术主要集中应用在对活性污泥等样品中特定类群微生物菌株，特别是一些具有明显形态特征的菌株进行分选与培养[24-27]。Huys和Raes (2018)认为，该技术可以扩展到从各种环境样品中分离缺乏典型形态(atypical morphology)的微生物细胞，从而实现对未培养或未知微生物的高通量分选和培养[23]。
本研究主要探索和建立适用于海洋微生物的结合流式细胞分选与高通量单细胞培养方法，通过确定深海微生物细胞在流式细胞仪中产生前向角(FSC)散射光和侧向角(SSC)散射光信号位置，从印度洋深海样品中分离微生物，并对分选获得的单细胞培养物进行16S rRNA基因的多样性分析，与常规平板分离获得菌株的多样性和新颖性进行比较，并揭示基于流式细胞术用于深海微生物单细胞高通量分选和培养的特点和适用性。
1 材料和方法 1.1 样品来源 本研究所用样品，由中国大洋第28航次(2013年)和第39航次(2016年)采集自西南印度洋，其站位信息见表 1。深海水体分别采用电视多管(TVM)和温盐深仪(CTD)采集，沉积物由电视抓斗(Deposit-Grab with TV)采集，样品密封分别放入无菌50 mL离心管和样品杯中，4 ℃冷藏备用。
表 1. 样品站位信息 Table 1. Information of the sampling sites
| Sample | Longitude | Latitude | Depth/m | Type |
| 28II-S030-TVMC01 | E 69°20′31.56" | N 4°0′10.08″ | 4213.00 | Water |
| 39V-IB-S007CTD02 | E 78°53′22.16″ | S 24°22′12.98″ | 4349.55 | Water |
| 39IV-SWIR-S011TVG07 | E 54°12′51.48″ | S 34°58′1.45″ | 3269.63 | Sediment |
表选项
1.2 参比菌株特性及培养基 大肠杆菌(Escherichia coli K12)：1.0 μm×2.0 μm杆状，鞭毛细菌；由中国普通菌种保藏中心提供，培养基为Luria-Bertani (LB)培养基[28]。
硫化叶菌(Sulfolobus sp. A20)：0.8-1.0 μm不规则球状古菌，为本实验室分离自哥斯达黎加热泉[29]；培养基为Zillig培养基[30]。
海杆菌(Marinobacter sp. IM-B4)和亚硫酸盐杆菌(Sulfitobacter sp. DY-297)，分别为0.6 μm× 2.0 μm和0.9 μm×1.3 μm，均为本实验室分离自深海沉积物的海洋细菌；培养基为ZoBell 2216E培养基(Difco，Bection Dickinson)[31]。
分离自深海样品的微生物，采用改良的海洋M13培养基[32]进行培养。
1.3 微生物单细胞分选和培养
1.3.1 分选区域: 单细胞分选设备为超速流式细胞仪(MoFlo XDP，美国Beckman Coulter公司)。
(1) 参比菌株样品制备：活化后的大肠杆菌K12于LB液体培养基中37 ℃、180 r/min摇床培养4 h；活化后的海杆菌IM-B4和亚硫酸盐杆菌DY297于2216E液体培养基中30 ℃、180 r/min摇床培养24 h；硫化叶菌A20于Zillig培养基中75 ℃、150 r/min摇床培养72 h。上述细胞(处于对数生长期)用荧光染料SYBR Ggreen于4 ℃染色20 min。
(2) 参比菌株分布区域的确定：使用流式细胞仪的分选功能，根据细胞产生前向角(FSC)散射光和侧向角(SSC)散射光信号以确定其主要分布区域。分选前，先按照流式细胞仪光路校准说明校准仪器光路；根据流式细胞仪Dropdelay分选程序校准分选通路；按照Cyclone使用程序调整96孔板的位置，并建立单细胞分选程序。参比菌株上样后，采用流式细胞仪信号分析软件Summit 5.2分析荧光信号区域细胞的FSC和SSC信号(散射光信号取Log height值)。
(3) 分选过程污染的防止：所有单细胞分选工作均在中国科学院微生物研究所单细胞分析平台万级洁净室中完成。分选样品更换前，用次氯酸钠进样5 min，取出样品管，反冲进样管1 min，再使用无菌水上样，确保机器处于无菌环境且无次氯酸钠溶液残留。
1.3.2 分选细胞可培养性的确定: 确定FSC和SSC信号细胞分选区域后，将该区域无荧光染色的大肠杆菌K12单细胞分选至含有100 μL/孔LB培养基的96孔板中，其中96孔板的第12列(8个孔)作为空白对照组只加入100 μL/孔LB培养基而无分选细胞。37 ℃培养12 h，记录生长情况。
1.3.3 深海水体和沉积物样品的洗脱和分选: 深海水体样品直接上样分选。深海沉积物样品微生物的洗脱：将5-10 g样品加至100 mL灭菌人工海水中(3%，Sigma Aldrich)，16 ℃摇床振荡洗脱8 h。静置待大颗粒自然沉降后取10 mL上层液体于600 r/min低速离心10 min，取4 mL上清液4 ℃备用上样。清洗上样管线后，根据利用参比菌株所确定的FSC和SSC信号细胞分选区域及分选程序，将单细胞逐个分选至96孔板，每孔含100 μL改良的海洋M13培养基。96孔板中，第1-11列(88个孔)作为实验组分选单细胞，第12列(8个孔)只加入100 μL/孔LB培养基作为空白对照组不分选细胞。分选后的单细胞置于25 ℃培养。
1.4 平板涂布法分离培养 取深海水体样品100 μL，涂布于改良的海洋M13固体培养基上，25 ℃培养。取沉积物样品2-5 g，人工海水悬浮，16 ℃摇床振荡洗脱8 h，梯度稀释后取100 μL涂布于改良的海洋M13固体培养基上，25 ℃培养。待长出可辨认的菌落后，挑选菌落于改良的M13固体培养基上，平板划线法纯化。
1.5 16S rRNA基因PCR扩增、测序及序列比对 取0.5 mL纯菌液至1.5 mL离心管中，煮沸15 min后液氮速冻，重复3次。悬浮液12000 r/min离心5 min，取1 μL上清液作为DNA模板；以27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[33]为引物扩增16S rRNA基因；PCR扩增程序为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 45 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。将所获得的16S rRNA基因序列通过Clustal软件进行排序(Alignment)和相似性比对，相似性低于97%作为不同的种，即可操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)。取不同OTU代表性菌株的序列与GenBank数据库的核苷酸序列数据库通过Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/)进行序列比对分析。
2 结果和分析 2.1 流式细胞分选区域的确定 为了区分海洋样品中颗粒物和菌体细胞，提高分选效率，首先通过参比菌株确定分选区域。除典型细菌大肠杆菌外，还选用了细胞偏小且形状为不规则球状古菌硫化叶菌以及海洋常见的海杆菌和亚硫酸盐杆菌作为参比菌株。分别对荧光染色的大肠杆菌K12、硫化叶菌A20、海杆菌IM-B4和亚硫酸盐杆菌DY297进行流式单细胞分选，结果显示细胞信号收集范围为FSC信号值10-105和SSC值10-104，集中出现于FSC值102-103和SSC值10-103 (图 1)，因此，将流式细胞仪分选逻辑区域框选为FSC值10-105和SSC值10-104，进行海洋样品细胞分选。
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| 图 1 参比菌株细胞分布区域 Figure 1 Dot plots obtained via cell sorting of the reference cells. |
| 图选项 |
确定细胞分选区域后，分选未标记大肠杆菌K12单细胞至含有LB培养基(100 μL/孔)的96孔板中，共分选3块(88个单细胞/块，共264个单细胞)。37 ℃培养12 h后，3块板分别有66个、72个、80个培养孔出现混浊，单细胞可培养率为75%-90%。已证实流式细胞仪本身会对生物细胞具有一定的损伤，如包裹微生物的液滴高速喷出，造成对细胞的机械损伤，偏转电极产生的电荷对细胞活性的影响，以及液滴在高速撞击液体培养基表面导致的细胞破裂等[34-35]，都会导致分选后的单细胞失活。我们对大肠杆菌的培养实验也证实了这一点，但整体看大部分(超过75%)的单细胞微生物经过流式分选后可以正常生长。周利艳等[36]采用流式细胞对隐球菌进行分析发现，Cryptococcus neoformans H99经过流式细胞分选后可培养率为80%-89%，较高的可培养率表明，流式细胞仪分选处理对细胞的损伤影响较小。此外流式细胞分选所具有的通量高、分选准确等优势，一定程度上弥补了由于细胞损伤造成的影响。因此，利用流式细胞分选技术在该分选区域对环境样品微生物进行分离是可行的。
2.2 流式分选及高通量单细胞培养
2.2.1 深海微生物的单细胞培养效率: 确定细胞分选区域后，将2个海水样品和1个沉积物洗脱样品进行流式细胞分选，3个样品分别分选3块96孔板(每个96孔板分选88个单细胞)，共792个单细胞。792个单细胞经过60 d培养，共产生了232个单细胞培养物，可培养率为29.29%。其中海水样品222株，沉积物样品10株。两个海水样品中，96孔板培养后孔内浑浊的发生率分别为65.90%和18.18%；沉积物样品中96孔板培养后孔内浑浊发生率仅为3.79%。根据浑浊发生率，从沉积物洗脱样品获得单细胞培养比从水体样品更为困难。
2.2.2 深海微生物单细胞培养菌株的多样性: 以相似性大于97%作为OTU界定阈值，对通过单细胞培养获得的232株深海微生物菌株的16S rRNA基因进行扩增、测序和相似性分析，发现它们分属于27个不同的OTUs。从2个水样分别获得了16个OTUs和10个OTUs，而从沉积物样品仅获得3个OTUs。将代表这些OTUs的菌株的16S rRNA基因序列与已发表的模式菌株(type strain)序列进行相似性比对，结果显示，与232株细菌16S rRNA基因最相似的微生物分属于3个门，即变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)中的27个属，相似性为89.79%-100% (表 2)。其中，从2个水体样品中获得的与Thalassospira属(alpha-变形菌)和Alcanivorax属(gamma-变形菌)相似的菌株数最多，分别为53株和40株，相似性为99.85%-100% (表 2，图 2)，分离自沉积物的10株菌分别与Shimia、Sulfitobacter和Stenotrophomonas的3个属种相似，相似性为97.48%-99.70%。
表 2. 通过单细胞分离及高通量培养获得的菌株16S rRNA基因序列相似性比对结果 Table 2. Sequence analysis of the 16S rRNA genes of strains obtained by high-throughput single-cell isolation
| Sample | Strain No. | The closest type strain (accession number) | No. | Length/bp | Identity/% |
| 28II-S030-TVMC01 | 2ED5* | Hyphobacterium vulgare WM6T (KR611720) | 6 | 1422 | 95.37 |
| 2CG4* | Halovulum dunhuangense YYQ-30T (NR137232) | 1 | 1420 | 94.94 | |
| 2QD8 | Rhodophyticola porphyridii MA-7-27T (KX268607) | 1 | 1249 | 97.60 | |
| 2OG3 | Nocardioides salarius CL-Z59T (NR043786) | 1 | 695 | 98.71 | |
| 2BA1 | Shimia abyssi JAMH043T (NR148628) | 7 | 674 | 97.48 | |
| 2GB5 | Marinobacter alkaliphilus ODP1200D-1.5T (NR112223) | 3 | 713 | 100.00 | |
| 2PG2 | Herminiimonas saxobsidens NS11T (NR042610) | 1 | 713 | 100.00 | |
| 2HD2 | Loktanella variabilis J-MR2-YT (NR134071) | 7 | 674 | 100.00 | |
| 2TH1 | Maricaulis parjimensis MCS 25T (NR025323) | 1 | 674 | 99.55 | |
| 20F1 | Thalassospira xiamenensis M-5T (CP004388) | 1 | 674 | 100.00 | |
| 2RC10 | Erythrobacter nanhaisediminis T30T (NR116764) | 1 | 674 | 100.00 | |
| D107 | Thalassospira permensis NBRC 106175T (NR116841) | 52 | 674 | 99.85 | |
| D77 | Alcanivorax xenomutans JC109T (NR133958) | 40 | 713 | 100 | |
| D1 | Marinicaulis flavus SY-3-19T (KY861741) | 6 | 1435 | 94.84 | |
| D3 | Yonghaparkia alkaliphila KSL-113T (NR043675) | 2 | 694 | 99.57 | |
| D14 | Chelativorans intermedius CC-MHSW-5T (EU564843) | 36 | 1476 | 92.75 | |
| D6 | Wenzhouxiangella marina Ma-11T (NR136878) | 8 | 1521 | 91.85 | |
| 39V-IB-S007CTD02 | 3NB11 | Vicingus serpentipes ANORD5T (NR159281) | 4 | 1489 | 89.79 |
| 3KC3 | Hyphomonas pacifica MCCC 1A04387T (KF863109) | 2 | 674 | 99.70 | |
| 3EH8 | Muricauda ruestringensis DSM 13258T (NR074562) | 8 | 711 | 99.30 | |
| 3FD2 | Pelagibacterium halotolerans B2T (NR102924) | 16 | 674 | 100.00 | |
| 3DG7 | Pseudooceanicola nanhaiensis SS011B1-20T (NR043797) | 4 | 674 | 100.00 | |
| 3ED3 | Martelella mediterranea DSM 17316T (CP020330) | 3 | 674 | 100.00 | |
| 3MD1 | Alcanivorax venustensis ISO4T (NR025145) | 1 | 713 | 99.86 | |
| 3GG7 | Comamonas testosteroni KS 0043T (NR029161) | 2 | 757 | 100.00 | |
| CJ16 | Citreicella marina CK-I3-6T (NR116507) | 6 | 674 | 100.00 | |
| CJ19 | Brevundimonas mediterranea V4.BO.10T (NR037108) | 2 | 674 | 99.85 | |
| 39IV-SWIR-S011TVG07 | 4AE3 | Shimia abyssi JAMH043T (NR148628) | 3 | 674 | 97.48 |
| 4BC11 | Sulfitobacter dubius LMG20555T (NR115917) | 3 | 671 | 99.70 | |
| 4DH4 | Stenotrophomonas maltophilia NCTC10257T (LT906480) | 4 | 691 | 98.26 | |
| *: published. | |||||
表选项
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| 图 2 流式分选高通量单细胞培养法与稀释平板法分离深海微生物效果之比较 Figure 2 Comparison between the high throughput single-cell cultivation method and the streaking plate method in the isolation of deep-sea microorganisms. The numbers of isolates are indicated in parentheses. Strains obtained by using the high-throughput single cell cultivation method and the plate culture method are shown to the left and the right of the genus name, respectively. Numbers of strains isolated from 28II-S030-TVMC01, 39IV-SWir-S011TVG07 and 39V-IB-S007CTD02 are shown in red, blue and green, respectively. |
| 图选项 |
2.2.3 通过单细胞培养获得的深海微生物新属种: 按照国际微生物分类标准，以97%作为新分类单元指标，通过流式分选及高通量单细胞培养获得的菌株中，分属6个OTUs的61个菌株的16S rRNA基因序列与已知属种的模式菌株序列的相似性小于97% (89.79%-95.37%)。这些菌株均来自水体样品，占分离株总数的26.29% (表 3)。这6个OTUs分别以菌株2ED5、2CG4、D1、D14、D6、3NB11为代表。其中，菌株2ED5和菌株2CG4分别归属于变形菌门alpha-变形菌纲红细菌目(Rhodobacterales)生丝单胞菌科(Hyphomonadaceae)的Hyphobacterium vulgare WM6T和红杆菌科(Rhodobacteraceae)的Halovulum dunhuangense YYQ-30T，相似性分别为95.37%和94.94%。经进一步鉴定，这两个菌株分别确定为Hyphobacterium属和Halovulum属的新种，定名为Hyphobacterium indicum[32]和Halovulum marinum[37]。
表 3. 平板分离培养菌株16S rRNA基因序列相似性比对结果 Table 3. Sequence analysis of the16S rRNA gene sequences of isolates obtained by streaking on solid plates
| Sample | Strain No. | The closest type strain (accession number) | No. | Length/bp | Identity/% |
| 28II-S030-TVMC01 | C-28-1 | Stenotrophomonas maltophilia IAM 12423T (MN240936) | 1 | 634 | 99.53 |
| C-28-2 | Thalassospira indica PB8BTT (CP031555) | 5 | 674 | 100.00 | |
| C-28-5 | Marinobacter adhaerens HP15T (NR074765) | 1 | 713 | 100.00 | |
| C-28-6 | Halomonas hamiltonii W1025T (NR115089) | 1 | 707 | 99.86 | |
| C-28-7 | Alteromonas australica H 17T (CP008849) | 1 | 707 | 100.00 | |
| C-28-8 | Psychrobacter pacificensis NBRC 103191T (NR114238) | 1 | 713 | 99.44 | |
| C-28-9 | Alcanivorax xenomutans JC109T (NR133958) | 3 | 713 | 100.00 | |
| 39V-IB-S007CTD02 | C-39-4300-1 | Martelella mediterranea DSM 17316T (CP020330) | 1 | 663 | 100.00 |
| C-39-4300-2 | Muricauda ruestringensis DSM 13258T (NR074562) | 2 | 711 | 99.30 | |
| C-39-4300-3 | Pseudooceanicola nanhaiensis SS011B1-20T (NR043797) | 2 | 674 | 100.00 | |
| 39IV-SWIR-S011TVG07 | C-TVG07-1 | Kocuria assamensis S9-65T (KT989850) | 1 | 697 | 100.00 |
| C-TVG07-2 | Microbacterium paraoxydans CF36T (MH281749) | 1 | 696 | 100.00 | |
| C-TVG07-3 | Pseudomonas koreensis Ps 9-14T (KU041145) | 1 | 713 | 98.60 | |
| C-TVG07-4 | Bacillus siamensis KCTC 13613T (MN176482) | 1 | 724 | 100.00 | |
| C-TVG07-5 | Henriciella pelagia LA220T (NR157792) | 2 | 675 | 100.00 | |
| C-TVG07-6 | Erythrobacter lutimaris S-5T (NR134028) | 2 | 674 | 99.55 | |
| C-TVG07-7 | Yonghaparkia alkaliphila KSL-113T (NR043675) | 4 | 695 | 99.57 | |
| C-TVG07-8 | Halomonas sulfidaeris Esulfide1T (NR027185) | 8 | 707 | 99.58 | |
| C-TVG07-9 | Fictibacillus halophilus AS8T (NR149289) | 2 | 723 | 99.59 |
表选项
16S rRNA基因序列的相似性分析显示，菌株D1、D14、D6、3NB11等与已知属种微生物的相似性均低于94.5%，即Yarza等[38]提出的微生物分类中“属”的界定标准，为潜在的新属。菌株D1和菌株D14均与变形菌门alpha-变形菌纲细菌相似，其中，菌株D1与短小盒菌目(Parvularculales)短小盒菌科(Parvularculaceae)的Hyphococcus flavus SY-3-19T相似性最高(94.84%)；菌株D14与根瘤菌目(Rhizobiales)红菌科(Rhodobiaceae)的Chelativorans intermedius CC-MHSW-5T相似性最高(92.75%)；菌株D6与变形菌门gamma-变形菌纲着色菌目(Chromatiales)的Wenzhouxiangella marina Ma-11T相似性最高(91.85%)；而菌株3NB11与拟杆菌门黄杆菌纲(Flavobacteriia)黄杆菌目(Flavobacteriales)Cryomorphaceae科的Vicingus serpentipes ANORD5T相似性最高(89.79%)。分析新属种及其代表菌株的培养特性后发现，它们均需要经过较长时间(基本均需超过一个月)才能够从单细胞形成培养物，菌株从单细胞培养物转接时，难以在平板上形成菌落，这些菌株液体培养时的生长速率明显高于平板培养，推测单细胞培养为这些菌株的生长提供了充分的空间和营养条件，缓解了由于固体培养时生长缓慢带来的困难。
2.3 流式分选高通量单细胞培养法与稀释平板法的比较 在通过流式分选高通量单细胞培养的同时，利用平板涂布法对2个海水和1个沉积物样品进行了常规的平板分离培养，培养基及培养温度等培养条件与单细胞培养一致。挑取平板上形态、大小等有差异的菌落进行划线纯化，共获得40株菌，其中18株来自水体样品，22株来自沉积物样品。基于菌株16S rRNA基因相似性的分析表明，40株菌分属于18个不同的OTUs，水体样品获得10个OTUs，沉积物样品获得9个OTUs。它们的代表菌株分别与变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的18个属种的模式菌株相似，16S rRNA基因相似性为98.6%-100% (表 3，图 2)，因此，采用传统平板分离方法，没有获得新属种。
对两种方法获得菌株的16S rRNA基因进行相似性比对，结果显示(图 2)，它们之间共有的OTUs共9个，分属于9个属，即Alcanivorax、Marinobacter、Thalassospira、Martelella、Muricauda、Erythrobacter、Pseudooceanicola、Stenotrophomonas、Yonghaparkia。具体看，流式分选高通量单细胞培养法分离的海水样品微生物多样性较高；相反，稀释平板培养法从沉积物样品获得的微生物多样性明显高于单细胞培养。
3 讨论和结论 在本研究中，通过流式分选高通量单细胞培养共获得232株菌，其中，绝大多数(222株)菌株来自水体样品，分离自沉积物样品的菌株较少且多样性不高。然而，已有研究显示海洋沉积物中微生物的生物量和多样性远高于水体[39]。我们推测，由于沉积物中孔隙较多，对微生物的吸附以及矿物-微生物的结合使微生物难以从样品中洗脱分离，导致分离培养的菌株数目较少。另外，与海水相比较，沉积物中存在比例更高、与细菌大小相似的胶体颗粒，由于在实验中流式细胞仪基于光侧散射而非荧光分选逻辑，胶体颗粒与未经染色处理的微生物细胞难以区分，导致沉积物样品采用流式分选高通量单细胞培养方法所获得的新微生物菌株和类群少于水体样品。因此，就沉积物样品中微生物的分离培养而言，本文所采用的流式分选高通量单细胞培养方法没有优势。
海洋水体样品中微生物的含量一般为103-105/mL，即每微升样品含1-100个微生物细胞，如果采用传统的平板涂布方法直接分离菌种，一般平板上只能涂布100-200 μL样品，加上培养基的选择作用，只有少数适合培养条件且生长速度较快的属种得以形成菌落，获得的微生物种类极为有限。采用流式细胞仪分选，可以根据颗粒大小相对地富集水体中的微生物细胞，随后的液体单细胞培养可为生长速率慢的微生物提供足够的空间和时间，因此流式分选结合单细胞高通量培养能够有效地提高从原始样品中获得的微生物种类。我们的研究结果显示，平板分离培养和流式分选高通量单细胞培养这两种方法所得到的微生物类群有较大的差异，在采用两种方法得到的36个属中，仅有9个属用两种方法分离得到。这就表明，两种方法各有优势，结合使用有助于分离获得更多的微生物。
流式分选高通量单细胞培养法在分离水体样品微生物时表现出明显优势。采用此法从水体样品分离获得的222株菌中，61株菌的16S rRNA基因序列与已知属种模式菌株的相似性低于97%，占总分离株的26.29%，它们是潜在的微生物新属种。在同样培养条件下，高通量微生物单细胞培养方法可提高海水中微生物的可培养率，获得更多微生物新属种。对分离获得的6个新属种的分析显示，这些新属种生长较慢，代时较长，适于在液体培养基中生长，而不易在平板上形成菌落，这可能是这些菌株难以通过平板培养获得的原因。单细胞培养方法可以提供给菌株独立的生存空间、较长的生长时间、充分的养分以及较少的菌株间竞争；此外，本方法还具有培养通量大、无需后续纯化的优势，因此，有助于提高微生物培养的效率。
综上所述，结合流式分选的非标记环境样品微生物单细胞分离培养有助于获取更多环境微生物新资源。
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