孙创1, 王金燕1,2, 张钰琳1, 张蕴慧1, 朱晓雨1, 陈朝晖3,4, 张晓华1,2,3
1. 中国海洋大学海洋生命学院, 山东 青岛 266003;
2. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室, 海洋生态与环境科学功能实验室, 山东 青岛 266071;
3. 中国海洋大学深海圈层与地球系统前沿科学中心, 山东 青岛 266100;
4. 中国海洋大学物理海洋教育部重点实验室, 山东 青岛 266100
收稿日期：2020-11-06；修回日期：2021-01-28；网络出版日期：2021-02-14
基金项目：中央高校基本科研业务费专项(202072003);国家重点研发计划(2018YFE0124100, 2016YFA0601303);山东省重大科技创新工程专项(2018SDKJ0105-1)
作者简介：张晓华, 中国海洋大学教授, 博士生导师, 主要从事微生物海洋学研究(包括海洋微生物的生物地球化学作用、海洋细菌的密度感应及密度感应淬灭、海洋微生物的分离鉴定及资源开发等)。主持国家自然科学基金重点项目、国家重点研发计划项目、科技部国际合作重点项目等多项项目。以通讯作者在Nature Microbiology、Nature Communications、The ISME Journal、Microbiome、Environmental Microbiology、Applied and Environmental Microbiology等权威期刊发表多篇SCI论文。主编《海洋微生物学》(2016年第2版, 科学出版社).
*通信作者：张晓华。Tel: +86-532-82032767;E-mail: xhzhang@ouc.edu.cn.
摘要：[目的] 西太平洋复杂的海洋生态环境孕育了其独特的生物群落，蕴含着种类丰富的海洋微生物资源。本研究基于分离培养技术探究了西太平洋海域不同水深细菌的多样性，并尝试通过改良培养基提高海洋细菌可培养性。[方法] 采用改良的2216E固体培养基（IMA）、R2A固体培养基（R2A）、MBM固体培养基（MBM）、TCBS固体培养基（TCBS）和改良的2216E液体富集培养基（IMB）5种不同培养基进行微生物培养，通过菌株分离纯化、16S rRNA基因序列鉴定，分析西太平洋表层至6000 m水深可培养细菌的多样性以及不同培养基在分离培养异养细菌方面的优势。[结果] 本研究共获得1293株异养细菌，分属于4门7纲14目26科52属119种，其中变形菌门（Proteobacteria）为主导类群。纲水平上，γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）和放线菌纲（Actinobacteria_c）为优势菌群。5种培养基所获得的最优势门都为变形菌门，最优势纲都为γ-变形菌纲，除TCBS培养基优势目是弧菌目（Vibrionales），最优势目都为交替单胞菌目（Alteromonadales）。此外，5种培养基在各分类水平上均体现出不同的选择性。5种培养基在种水平上可培养细菌多样性由高到低依次为R2A、IMA、MBM、TCBS以及IMB。分离自R2A的特有属数目最多，可达10个。随水深增加，可培养异养微生物属的数量呈减少趋势。分得菌株中共有68株为潜在新菌，新菌率在IMA、R2A和MBM中相对较高。[结论] 本研究用5种不同培养基从西太平洋海水中获得大量可培养细菌，具有较高的多样性，同时揭示了不同培养基对可培养海洋细菌的选择性。本研究为进一步的生态学研究和分子生物学研究等提供了宝贵的种质资源，也为未来利用改良培养基分离难培养海洋微生物带来启发。
关键词：西太平洋细菌多样性16S rRNA基因改良培养基
Exploring the diversity of cultivated bacteria in the Western Pacific waters through improved culture media
Sun Chuang1, Wang Jinyan1,2, Zhang Yulin1, Zhang Yunhui1, Zhu Xiaoyu1, Chen Zhaohui3,4, Zhang Xiaohua1,2,3
1. College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, Shandong Province, China;
2. Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Qingdao 266071, Shandong Province, China;
3. Center for Advanced Science of Deep-Sea Spheres and Earth Systems, Ocean University of China, Qingdao 266100, Shandong Province, China;
4. MOE Key Laboratory of Physical Oceanography, Ocean University of China, Qingdao 266100, Shandong Province, China
Received: 6 November 2020; Revised: 28 January 2021; Published online: 14 February 2021
*Corresponding author: Xiaohua Zhang, Tel: +86-532-82032767; E-mail: xhzhang@ouc.edu.cn.
Foundation item: Supported by the Fundamental Research Funds for the Central Universities (202072003), by the National Key Research and Development Program of China (2018YFE0124100, 2016YFA0601303) and by the Innovation Project of Science and Technology of Shandong Province (2018SDKJ0105-1)
Abstract: [Objective] The complex marine environment of the Western Pacific has unique ecosystems and biological communities, and contains abundant marine microbial resources. The community structure of bacteria in different water depths in the Western Pacific was studied based on isolation culture technique. We tried to improve the capturability of marine bacteria by modifying the culture medium. [Methods] We used five different culture media in this study: improved 2216E agar medium (IMA), R2A agar medium (R2A), MBM agar medium (MBM), thiosulfate citrate bile salts sucrose agar medium (TCBS) and improved 2216E liquid enriched medium (IMB). Through strain isolation and 16S rRNA gene sequence identification, the community structure and diversity of culturable bacteria from the surface layer to 6000 meters water depth of the Western Pacific were analyzed. We compared the similarities and differences of bacterial diversity in different culture media. [Results] In this study, we isolated and identified 1293 strains in total, which affiliated to four phyla, seven classes, 14 orders, 26 families, 52 genera and 119 species. Proteobacteria were the dominant group recovered from the seawaters. At the class level, γ-Proteobacteria, α-Proteobacteria, and Actinobacteria_c were the dominant microflora. The most dominant phyla obtained from the five cultures were all Proteobacteria, and the most dominant class was γ-Proteobacteria. Except for the TCBS in which the dominant order was Vibrionales, the most dominant order in other four media was Alteromonadales. In addition, the five media exhibited different selectivity at each taxonomic level. The diversity of the cultivable bacteria in the five culture media from high to low was R2A, IMA, MBM, TCBS and IMB. The most unique genera (up to 10) were isolated from R2A. With the increase of water depth, the number of cultivable heterotrophic microorganisms showed a decreasing trend. A total of 68 strains were potential new bacteria among all the isolates, and the rates of new bacteria were relatively high among IMA, R2A and MBM. [Conclusion] In this study, cultivable bacteria from the seawater of the Western Pacific were studied by using five different culture media, showing a high diversity and revealing the selectivity of different media for cultivable marine bacteria. This research has provided valuable microbial resources for other ecological and molecular studies, and it has also brought more inspiration for using improved culture medium to isolate uncultured marine microorganisms in the future.
Keywords: Western Pacificbacterial diversity16S rRNA geneimproved culture
西太平洋海洋环境复杂，有独特的沟弧盆构造和弧后盆地热液系统，存在着海底板块运动的遗迹和众多海山生态系统，更是“大洋传送带”冷暖水系的转换区[1]，因此，这一特殊区域可能存在着丰富的海洋微生物类群。目前对西太平洋可培养细菌的群落结构及功能研究较少，其潜在的种质资源仍有待发掘。
海洋微生物在地球能量流动和物质循环中扮演了重要角色，有物质和能量储存者的作用，更是新型生物活性物质的潜在载体[2-3]。开展海洋微生物多样性的研究将有助于了解微生物的生态功能，开发和利用微生物资源。近年来，宏基因组学、扩增子、单细胞测序等测序技术的快速发展，使得我们能够对环境中不可培养微生物进行基因水平上的物种分类和代谢功能分析。尽管这些方法从环境中发现了很多新的微生物类群，但这些方法无法获取这些新型微生物的活体细胞，致使无法准确了解其外在形态、生理代谢特性、生态功能等。且如果缺乏基本的生理学实验数据支撑，分子生物学方法产生的数据仍难以解释。
纯培养技术一直是研究微生物的有力手段，对我们研究微生物的生物生理学，正确理解它们的生态作用至关重要。然而迄今为止，依靠传统纯培养方法海洋环境中微生物的可培养率仅为0.001%–0.100%[4]。可培养率低的主要原因包括实验室纯培养破坏了微生物间的互作关系、原位海洋环境难以复现[5]、培养基质富营养化[6]以及生长过缓的细菌易被忽视等[7]。此外，绝大多数微生物细胞当受到外界环境胁迫时会进入休眠状态，即活的非可培养状态(viable but nonculturable state，VBNC)[8]，从而无法被分离得到。因此，改进传统培养基或设计新型培养基是突破现纯培养技术局限性的迫切需求。
近年来，许多****通过改变培养基营养配方以及改进细胞培养方式，显著提高了环境中可培养微生物的多样性，并获得了更多微生物新类群。岳秀娟等[9]在培养基中加入甜菜碱、丙酮酸钠或过氧化氢酶等化合物，使从土壤中分离到的微生物种类及菌落总数明显增加。Nikki等[10]将改良后的厌氧培养基进行稀释，从反刍动物的胃里分离培养出14个潜在新属27株细菌。Nichols等[11]通过在普通培养基中添加五氨基酸的短肽LQPEV从海洋砂坪中分离得到了MSC33类型的未培养细菌。Connon等[12]采用高通量培养法对贫营养细菌进行培养和计数，使微生物可培养性较常规培养法高出1.4–120.0倍，并从海水分离到多株未培养的浮游细菌。近期有研究发现，改变培养基灭菌方式也会影响细菌分离效果，刘阳等[13]通过过滤除菌培养基分离获得的细菌的多样性、均匀性和新颖性均高于使用高压灭菌培养基。这些研究为今后合理设计培养条件以丰富环境可培养细菌的多样性提供了方法借鉴。此外，向普通培养基中添加特定底物有助于分离具有特殊代谢功能的细菌类群，例如为了获得在硫循环及气候调节过程中的扮演重要角色的二甲基巯基丙酸内盐(dimethylsulfoniopropionate，DMSP)合成细菌，Williams等[14]将DMSP合成途径的中间产物加入到MBM基础培养基中，从而增加了盐沼沉积物中DMSP的产量并实现富集DMSP合成细菌类群的目的。
为获得更多可培养微生物，取得高效的培养结果，本研究采用5种不同营养成分的培养基，分析了不同培养基条件下西太平洋可培养微生物的多样性。这一结果将为充分利用各培养基的优势，通过优化多培养基组合提高环境微生物的可培养性提供参考依据。
1 材料和方法 1.1 西太平洋海水样品采集 本研究的海水样品于2019年11月搭乘中国海洋大学“东方红3”综合科学考察船采集自西北太平洋黑潮延伸体海区。采用Niskin瓶对P1-19-1、P1-19-5、P1-19-9、P1-19-13、P1-19-21和P1-19-25，6个站位进行全水深(5–6050 m)采样(图 1)。
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| 图 1 西太平洋采样站位分布 Figure 1 Distribution of sampling stations in the Western Pacific. |
| 图选项 |
1.2 海水样品处理与培养基 在船上获得各水层海水样品后，现场立即将样品分别接种于五种培养基中，即改良的2216E固体培养基(Improved MA，简称IMA)[15]、R2A固体培养基(简称R2A)[16]、MBM固体培养基(简称MBM)[14]、TCBS固体培养基(硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基，简称TCBS)[16]和改良的2216E液体富集培养基(Improved MB，简称IMB)[15]。各培养基配方详情如下。
2216E培养基配方为：蛋白胨5 g，酵母提取物1 g，FePO4·4H2O 0.01 g，海水1 L，pH调至7.6。IMA/IMB培养基配方为：NH4Cl 1.0 g，CH3COONa 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，酵母提取物0.2 g，蛋白胨0.2 g，EDTA-Na2 1.0 g，C3H3NaO3 1.1 g，海水1 L，10 mL 2% (W/V) KH2PO4，10 mL 10% (W/V) NaHCO3，pH调至7.5，若配制固体培养基，则再加入20 g琼脂。R2A配方为：葡萄糖0.5 g，R2A专用蛋白胨0.5 g，可溶性淀粉0.5 g，酵母提取物0.5 g，丙酮酸钠0.3 g，酸水解酪素0.5 g，海水750 mL，蒸馏水250 mL，pH调至7.5，若配制固体培养基则加入琼脂20 g。MBM配方为：MBM Basal溶液① 250 mL，海盐35 g，1 mol/L NH4Cl贮存液10 mL，50 mg/mL FeEDTA贮存液50 mL，蒸馏水680 mL，琼脂20 g，1 mL混合维生素贮存液②，10 mL混合碳源贮存液③，最后加入L-甲硫氨酸(用于DMSP合成菌筛选)或终浓度为0.5 mmol/L DMSP (DMSP降解菌筛选)终浓度为1 mmol/L。其中①②③的主要成分及贮存方法如下：① MBM Basal溶液主要成分为：1 mol/L Tris-HCl (pH 7.5) 150 mL，K2HPO4 87 mg，375 mL蒸馏水，配置成525 mL MBM Basal溶液贮存液，121 ℃高温高压灭菌20 min后，室温贮存。②混合维生素贮存液：生物素20 mg，叶酸20 mg，盐酸吡哆醇100 mg，二水合盐酸硫胺素50 mg，核黄素50 mg，烟酸50 mg，D-泛酸钙50 mg，氰钴胺素1 mg，对氨基苯甲酸50 mg，硫辛酸50 mg，溶于1 L蒸馏水，0.22 μm滤膜过滤除菌并分装，4 ℃贮存。③混合碳源贮存液：六水合琥珀酸钠54 g，葡萄糖36.3 g，蔗糖68.4 g，丙酮酸钠22 g，丙三醇14.6 mL，985.4 mL蒸馏水，调节pH至7.5，0.22 μm滤膜过滤除菌并分装，4 ℃贮存。TCBS配方为：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，硫代硫酸钠10 g，柠檬酸钠10 g，牛胆汁盐8 g，蔗糖20 g，氯化钠10 g，柠檬酸铁1 g，溴麝香草酚兰0.04 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，pH调至8.6。
其中，IMA、R2A、MBM和TCBS培养基的海水涂布量为200 μL；而IMB培养基则按海水: 培养基=1:100的比例进行接种。每个深度用到的培养基各设置2个平行。所有培养基均置于10 ℃恒温培养箱进行培养。
在所选择的5种培养基中，R2A是广泛应用于异养微生物培养的寡营养培养基，其中可溶性淀粉能够吸附细菌有毒的代谢副产物，丙酮酸钠的抗氧化作用，有利于受损微生物的修复。MBM是一种基础性海洋细菌培养基，各营养物质成分较为明确，本次研究为富集DMSP合成和降解菌株，分别向MBM基础培养基中添加一定浓度L-甲硫氨酸和DMSP。TCBS是一种专门用来分离培养弧菌的培养基，其高浓度的氯化钠可刺激弧菌的生长，而胆酸钠、牛胆粉、硫代硫酸钠和柠檬酸钠及较高的pH可抑制革兰氏阳性菌和大肠杆菌等的生长。IMA和IMB是将分离培养海洋细菌常用的2216E培养基中的主要营养物质，酵母提取物和蛋白胨分别稀释了5倍和25倍，同时添加丙酮酸钠和乙酸钠等细菌复苏诱导因子。
1.3 菌株的分离纯化 由于本研究中各培养基分离得到的菌株均来源于海水样品，为了简化实验过程，对于在IMA、R2A、MBM和TCBS培养基平板上生长的细菌，挑取不同形态单菌落后，于最常用的海洋微生物培养基2216E平板上进行划线分离纯化。对于IMB培养基样品，将1 mL初步富集的样品与9 mL IMB培养基加入15 mL离心管中，28 ℃摇床中恒温培养。每隔一周左右转接1 mL至新的9 mL IMB培养基中。对于经过多轮转接的样品，使用灭菌生理盐水，将样品梯度稀释至10–5倍，涂布于IMA培养基平板上。待生长出菌落后，从培养基上挑取不同形态单菌落，于2216E培养基平板上进行划线分离纯化。所有纯化的菌株均用15%甘油保藏液于–80 ℃保藏。
1.4 菌株的物种鉴定 对于纯化获得的菌株的物种鉴定。以菌株DNA为模板对16S rRNA基因序列进行体外扩增。PCR引物使用细菌16S rRNA基因序列的通用引物B8F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和B1510R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反应条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，30个循环；72 ℃ 10 min。采用Chromas软件对单端测序所获得的菌株的16S rRNA基因序列进行分析，去除质量不佳的测序碱基后，将获得的有效序列(约650 bp)提交至EzBioCloud (https://www.ezbiocloud.net/)和NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行在线BLAST比对，比对结果若相似度大于98.65%，则认为该菌株与其最相近菌株是同种；若相似度小于等于98.65%，则认为该菌株为疑似新菌[17]。
1.5 菌株的系统发育分析 基于上一步EzBioCloud和NCBI数据库比对结果，下载数据库中与分离菌株最相似的标准菌16S rRNA序列，将所有分离菌株及其最相近标准菌的16S rRNA序列整合到一个fasta文件中用于后续的进化分析。建树流程：首先使用MAFFT在线服务(https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/) 进行多序列比对[18]，再者，对比对后的序列用Gblocks在线服务(http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks_server.html)截齐[19]，最后通过IQtree (http://iqtree.cibiv.univie.ac.at/)构建最大似然法(Maximum Likelihood)系统进化树[20]。
1.6 菌株核苷酸序列登录号 在分得的1293株异养细菌中，将选取非重复的118株细菌的16S rRNA基因序列保存在GenBank数据库中，登录号为MW198071– MW198188。
2 结果和分析 2.1 西太平洋可培养异养细菌的多样性 本研究共分离纯化可培养细菌1293株，其中181株分离自IMA，354株分离自R2A，398株分离自MBM，159株分离自TCBS，201株分离自IMB。经16S rRNA基因测序鉴定以及系统发育分析，这1293株菌分属于4门7纲14目26科52属119种。门水平上(图 2-A)，变形菌门(Proteobacteria)为主导类群(1177株)，其次是放线菌门(Actinobacteria) (46株)、厚壁菌门(Firmicutes) (43株)和拟杆菌门(Bacteroidetes) (27株)。纲水平上(图 2-B)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、放线菌纲(Actinobacteria)、芽孢杆菌纲(Bacilli)和黄杆菌纲(Flavobacteriia)是丰度最高的5个纲，分别为941、232、44、43和27株，分别占总分菌的72.8%、17.9%、3.4%、3.3%和2.1%。而其他两个纲Actinomycetia和β变形菌纲(Betaproteobacteria)丰度较低，仅获得2–4株。同时，α-变形菌纲共包含21个属，γ-变形菌纲包含14个属，放线菌纲包含5个属，芽孢杆菌纲包含7个属，黄杆菌纲包含4个属，而其他的两个纲仅包含1个属。
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| 图 2 西太平洋可培养细菌群落组成 Figure 2 The Community composition of culturable bacteria from the Western Pacific at phylum level (A), class level (B) and genus level (C) (Top 19 dominant genera). |
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属水平上(图 2-C)，属于γ-变形菌纲的假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)为主导优势属，共计282株，分属于9个种，占总分菌数量的21.9%；γ-变形菌纲的交替单胞菌(Alteromonas)为第二优势属，共计271株，分属于9个种，占总分菌的20.9%；而弧菌属(Vibrio)、海杆菌属(Marinobacter)和赤杆菌属(Erythrobacter)也具有较高丰度，分别包括136、62株和74株，分属于10个种、6个种和5个种。而有部分属，如德沃斯氏菌属(Devosia)、微杆菌属(Microbacterium)、默里特氏菌属(Microcella)、诺卡氏菌属(Nocardioides)、鲁杰氏菌属(Ruegeria)、Chachezhania、Exiguobacterium、Henriciella、Hyphomonas、Gramella、Muricauda、Paralkalibacillus、Salinicoccus等属，仅分离获得1株。以上结果表明，西太平洋可培养微生物具有丰富的多样性(图 3，4)。
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| 图 3 基于16S rRNA基因序列构建西太平洋可培养微生物系统发育树 Figure 3 Neighbor-joining phylogenetic tree of representative cultivated bacteria isolated from the Western Pacific based on 16S rRNA gene sequences and the effective sequence length was 524 bp; the numbers inside brackets represents the amount of strains within the same species; bar, number of substitutions per site. |
| 图选项 |
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| 图 4 变形菌门之间系统发育树 Figure 4 Neighbor-joining phylogenetic tree of members of Proteobacteria. The effective sequence length was 526 bp; bar, number of substitutions per site. |
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2.2 西太平洋不同水深可培养微生物的群落组成 在所有水层中，γ-变形菌纲和α-变形菌纲是均是占主导优势的纲(图 5-A)，各水层的相对丰度分别能够达到55.5%–100%和0%–26.8%。芽孢杆菌纲在浅层深层水体均有分布，在5500 m相对丰度最高(33.3%)，黄杆菌纲分布在5–5000 m深度，且在55 m和215 m相对丰度较高(7.3%和7.9%)。在属水平上(图 5-B)，假交替单胞菌属几乎分布于整个水柱，且在各水层分布差异较小，在4000 m处具有最高相对丰度(41.8%)。第二优势属为交替单胞菌属，在215 m深处相对丰度最高(52.6%)。弧菌属为第三优势属，在25 m和5750 m水深相对丰度最高。赤杆菌属相对丰度在4000 m以浅水层中比5000 m以深水层高，而海杆菌属则与其相反，相对丰度在5000–6050 m更高。
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| 图 5 不同水层可培养微生物多样性 Figure 5 The diversity of cultivable bacteria isolated from different water layers at class level (A) and genus level (B) (Top 20 dominant genera). |
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我们将水体按海洋上层/真光层(从海面到水下200 m)、海洋中层(水层深度为水下200–1000 m)、海洋深层(水深1000–4000 m)和深渊层(水深4000–6000 m)划分，以进一步比较不同水深细菌在属水平上的差异(图 6)。结果表明，全水深共有的属有17个，大部分属于变形菌门，占32.7%。真光层特有的属数量最多，为8个，其中芽单胞菌属(Blastomonas)为光异养细菌。值得一提的是，在深渊层，特有属有7个，数量仅次于真光层。就整体而言，随水深增加可培养异养微生物多样性呈现降低趋势，由真光层的41个属递减到深渊层的28个属。
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| 图 6 不同水层分离获得的属的数量(左边柱状图)和不同水深特有及共有的属的数量(右边Upset图) Figure 6 The number of genera separated in different water depths (bar chart on the left) and the number of genera unique to and shared in different water depths (graph on the right). |
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2.3 不同培养基分离到的微生物多样性比较 本研究所使用的5种培养基所获得的最优势门都为变形菌门，最优势纲都为γ-变形菌纲，除TCBS优势目是弧菌目(Vibrionales)以外，其他4种培养基最优势目都为交替单胞菌目(Alteromonadales)。在门水平和纲水平上，IMB对厚壁菌门和芽孢杆菌纲呈现更好选择性，TCBS对放线菌门和放线菌纲呈现更好选择性，而拟杆菌门中的黄杆菌纲主要分离自寡营养的MBM。此外β-变形菌纲仅从TCBS上分离得到4株。IMA与R2A分得的细菌多样性在门水平和纲水平上呈现较为一致的趋势(图 7-A、B)。
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| 图 7 不同培养基分离可培养细菌群落结构及在不同分类水平上的多样性 Figure 7 The community composition of cultivable bacteria on different culture media at phylum level (A), class level (B) and the diversity of bacteria cultured in different media at different taxonomic levels (C). |
| 图选项 |
在种水平上，5种培养基分得的细菌多样性由高到低依次为R2A (56个种)、IMA (45个种)、MBM (42个种)、TCBS (31个种)、IMB (28个种) (图 7-C)。
通过比较不同培养基中的可培养细菌多样性，我们发现IMB与TCBS分得的属的多样性明显不同其他3种，且分到的属的数量较少，分别为17和15个属(图 8-A)。IMB分得最多的是海杆菌属(20.3%)和弧菌属(19.9%)。同时，海杆菌属、弧菌属、附小杆菌属(Epibacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)和芽孢杆菌属(Halobacillus)在IMB中的相对丰度与这些属在其他4种培养基中的相对丰度存在7%以上的差异。TCBS分得的弧菌属细菌最多，分属于8个种。其次是盐单胞菌属，分属于2个种。其余3种培养基分得的前三大优势属较为一致，分别是假单胞菌属、交替单胞菌属和赤杆菌属。
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| 图 8 不同培养基分离可培养微生物属水平群落结构(A)及属水平数目韦恩图(B) Figure 8 The community composition of cultivable bacteria (A) and Venn diagram of the number of bacterial genera (B) on different culture media. |
| 图选项 |
在5种培养基中均可以分得的有3个属，分别为附小杆菌属、假单胞菌属和弧菌属，均属于变形菌门，占所有属的5%。不同培养基体现出对某些特殊类群细菌的选择性，每种培养基均能分得其他培养基培养不出的特殊菌(图 8-B)。其中仅能在R2A分得的属数量最多，为10个，占总属数量的19.2%。仅在MBM里分得的属有6个，占总属的11.3%。仅在TCBS及IMB分得的属各有4个。仅在IMA分得的属有2个(表 1)。
表 1. 可培养细菌在不同培养基中特有的属 Table 1. Particular genera of culturable bacteria in different media
| Medium type | The unique genus isolated from each medium |
| R2A | Chachezhania, Marinibacterium, Primorskyibacter, Devosia, Microcella, Pelagibacterium, Nocardioides, Blastomonas, Enterovibrio, Gramella |
| IMA | Exiguobacterium, Salinicoccus |
| IMB | Halobacillus, Hyphomonas, Shewanella, Muricauda |
| TCBS | Paralkalibacillus, Brevundimonas, Burkholderia, Photobacterium |
| MBM | Gramella, Henriciella, Litorisediminivivens, Loktanella, Zunongwangia, Citreicella, Rhizobium |
表选项
2.4 添加不同底物的MBM对DMSP合成及降解菌的富集 本研究在MBM培养基分得398株菌，分属于9目13科23属42种。其中柠檬胞菌属(Citreicella)、鲁杰氏菌属、Thalassobius属、Rhizobiales目和交替单胞菌科(Alteromonadaceae)中有菌株已被报道有DMSP合成能力[14]。盐单胞菌、不动杆菌属(Acinetobacter)、鲁杰氏菌属(Ruegeria)、根瘤菌属(Rhizobium)和亚硫酸盐杆菌属(Sulfitobacter)中分别有菌株被报道有DMSP降解能力[21]，并已鉴定得到其相关功能的关键基因。此外，盐单胞菌属、短杆菌属(Brevibacterium)、微球菌属(Micrococcus)和赤杆菌属的一些菌株在先前研究中发现有不同程度的DMSP合成或降解能力，但未在其中检测到已知的被验证功能的合成或降解基因的同源序列[22]，因此，此次获得的纯培养菌株将是进一步探究其是否具有新型DMSP合成或降解基因的得力资源。
添加了不同底物的2种MBM培养基，在门和纲水平2种培养基都具有几乎相同的选择能力，在属水平上，两种培养基共有的属有16个，添加了DMSP底物的MBM特有的属有5个，其中鲁杰氏菌属中的Ruegeria pomeroyi DSS-3菌株和根瘤菌属中的Rhizobium sp. NGR234菌株已被报道有DMSP降解能力，其余则可能为潜在的新型DMSP降解菌。添加L-甲硫氨酸底物的MBM分得特有属2个(Henriciella和Thalassobius)，其中Thalassobius属的菌株已被报道具有DMSP合成能力[14]。鉴于参与DMSP分解代谢细菌的物种和遗传多样性均较高，这些菌株的DMSP合成及降解能力有待进一步验证。
2.5 西太平洋可培养细菌中的潜在新菌 本文所得1293株细菌中68株菌与其最相似物种的16S rRNA基因相似度低于98.65%，为潜在新菌，占总分菌5.26%，分属于22个潜在新种。根据16S rRNA基因比对结果，初步确定此68个潜在新菌分类地位。包括黄杆菌纲1株，α-变形菌纲41株，γ-变形菌纲16株，放线菌纲8株，芽孢杆菌纲1株，Actinomycetia纲1株(图 9-A)。
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| 图 9 不同培养条件下所分得潜在疑似新菌的系统发育树(A)、不同培养基新菌率(B)和不同水层新菌率(C) Figure 9 The phylogenetic tree (A), novel strain rate of different media (B) and different water layer (C) of potential novel bacterial strains under different culture conditions. The effective sequence length was 519 bp; top-hit taxon of potential novel strains named with the genus name; bar, the number of substitutions per site. |
| 图选项 |
从水层分布来看，此68株潜在新菌中16株分离自海洋上层/真光层；19株分离自海洋中层；23株分离自海洋深层；10株分离自海洋深渊层。在海洋深层、深渊层海水中分得潜在新菌概率高，新菌率达到6.4%；中层海水深次之，新菌率5.40%；真光层潜在新菌分得概率明显低于深层海水(图 9-C)。
此外，在培养基水平，68株潜在新菌中有23株分离自R2A，分属于13个潜在物种；7株分离自TCBS，分属于5个潜在新种；12株分离自IMA，分属于6个潜在新种，2株分离自IMB，分属于2个潜在物种，24株分离自MBM，分属于13个潜在物种。新菌率最高的是IMA (6.63%)，其次是R2A (6.50%)，MBM新菌率为6.03%，TCBS为4.40%，最低的为IMB (1.00%) (图 9-B)。
3 讨论 3.1 西太平洋可培养异养微生物具有丰富的多样性 微生物群落结构是其整体功能的基础，在海洋环境中有着重要的意义，一直是微生物生态学研究的重点问题[23]。近年来非培养方法推动微生物多样性研究不断发展，但仍需以纯培养为基础进行微生物生理特性及功能研究。本研究采用纯培养方式对西太平洋6个站位全水深(0–6050 m)环境微生物多样性进行研究，共使用5种培养基，完成1293株菌的16S rRNA基因测序及分析(属于52个属119个种，包括68个潜在的新菌)，分离规模及获得的可培养细菌多样性远高于单独使用一种培养基。其中变形菌门中γ-变形菌纲是最主要的微生物类群，α-变形菌纲也占有很大比例，放线菌门、厚壁菌门、拟杆菌门则占比例较低。先前研究表明，γ-变形菌纲细菌在世界范围各种海洋环境中常作为高丰度主导菌出现，如大西洋中脊、南大西洋[24]、中国东海、南海[25]等。除γ-变形菌纲以外，α-变形菌纲、放线菌纲、芽孢杆菌纲和黄杆菌纲占本论文所得可培养微生物的大多数。这5个纲也是通过分子生物学手段研究西太平洋海域深海微生物群落时的优势纲[12, 26-28]，所以本论文结果在一定程度上反映着西北太平洋的总微生物群落构成。
我们还发现，随水深加深，分得新菌的概率增高。这可能是因为西太平洋海底独特的地质构造格局，越接近海底，潜在的深海新型细菌资源可能越丰富。一直以来，由于采样条件限制、实验室培养难以复现深海原位环境等原因，能被培养出来的深海微生物多样性始终不及表层海水高。因此，深海环境中可能存在大量未被发现的细菌类群，需要我们利用多种培养基、探索不同培养条件，从而获得更多新型可培养的深海细菌。
3.2 培养基多样化可获得种类更多的异养微生物 与自然海洋环境接近的寡营养培养条件及改良微生物培养基组成皆有助于改善未培养微生物的可培养性。本研究所用的R2A、IMA、MBM、IMB与2216E比，不同程度地降低了营养物质浓度。IMA、IMB又通过改良培养基组分，添加了细胞复苏因子、解毒物质，微量元素、信号分子，电子受体和供体等。MBM通过特异性地添加甲硫氨酸和DMSP从海水体系中分离筛选目标微生物。
海洋环境是典型的寡营养环境，在微生物培养过程中，个别种类的微生物由于数量占优势或生长速度较快等原因，在培养初期大量生长，“淹没”了数量较少，生长速度较慢的物种，高浓度的营养物质对一些微生物反而是一种毒性，样品稀释或培养基营养成分稀释是解决这些问题的有效方法[29]。R2A与2216E相比是一种寡营养的培养基，常用于陆生环境，特别是淡水系统细菌的分离培养。而本次分菌用的2种改良培养基(IMA与IMB)将2216E中的主要营养物质酵母提取物、蛋白胨分别稀释了5倍、25倍。从本次研究结果看，寡营养的R2A和IMA的确获得了较其他3种培养基更高的物种多样性和新菌率，可见寡营养条件对于获得较高的可培养多样性十分重要，以往利用普通2216E培养基这种单一的培养条件可能会使海洋可培养细菌的多样性被大大低估。
微生物的VBNC状态是可复苏的，但其复苏机制的研究主要集中于医学和流行病学领域，甚少关注潜在环境功能菌群的VBNC状态[30]。在常规实验室环境中，将海洋环境中众多的休眠状态的细菌进行诱导复苏，分离出传统培养基无法分离的VBNC状态细菌是当前挖掘新菌资源重要途径之一。不同的研究表明，通过改良经典方法，培养基配方的变化，包括使用非传统电子供体，电子受体和碳源，已被证明可以有效地恢复未培养的类群[31-32]，本次实验在稀释2216E培养基营养成分的基础上加入了氯化铵、乙酸钠、七水合硫酸镁、丙酮酸钠、乙二胺四乙酸二钠、磷酸二氢钾及碳酸氢钠[15]。丙酮酸钠和乙酸钠有助于降低培养过程中优势菌种代谢所产生的过氧化物、自由基和一些拮抗物质的毒害作用，诱导细菌从VBNC状态复苏[8, 33-34]。此次仅在IMB分得的物种有特氏盐芽孢杆菌(Halobacillus trueperi)、Muricauda ruestringensis、海动物肠希瓦氏菌(Shewanella marinintestina)、Hyphomonas pacifica；仅在IMA分得的物种有Salinicoccus halodurans以及墨西哥微小杆菌(Exiguobacterium mexicanum)，这些物种中绝大多数以往未在西太平洋海域分离得到过，有可能是被复苏的VBNC菌。其中个别种属的菌株甚至是沙漠干旱地带土壤样品中的优势菌[35]，由此可见，添加复苏因子能够有效分离出常规培养方法无法获得的细菌类群。
海洋异养细菌不仅能够合成DMSP，同时也是DMSP的最主要分解者。其相关关键酶及编码基因陆续被发掘验证[14, 21]。DMSP合成及降解细菌物种和关键基因的多样性研究也在个别细菌基因组和环境宏基因组数据开展[36]。本研究通过向MBM添加特定底物，富集并分离DMSP相关代谢功能的细菌类群，为获得更多DMSP合成或降解菌株提供了新思路。这也启发我们在今后的研究中可针对特殊的研究目的添加特定底物，提高相关细菌类群的分离效率。
本研究为通过改良或创新培养基的方法复苏海洋“微生物暗物质”[37-38]提供了思路和素材。但除培养基层面的差异，本实验未设置其他更多的差异培养条件，后续细菌分离将考虑采用更多种类的改良培养基、不同温度梯度等条件以获得更多菌种资源。由于纯培养方法相比非培养方法在多样性方面本身存在的局限性，本研究结果仅能展现自然环境现有微生物多样性的一小部分。在未来的研究中，免培养的分子技术与传统的纯培养方法相结合，才能更加准确地评价海洋环境微生物多样性情况。同时，非培养分析结果可指导和改进纯培养的方法和技术，在提高微生物的可培养性的基础上，设计针对性的分离方案，富集培养策略和检测技术，形成一系列模型化的增菌培养方法，形成多类型的“增菌培养基”[39]，帮助我们获得多样性更高的可培养海洋微生物，为深入研究微生物多样性、起源和演化[40]、生理生态学、地球化学等提供新视角和新机遇。
致谢
感谢中国海洋大学“东方红3”船全体科学家和船员在航次中协助采集海水样品。
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