郑操1, 蔡鹭1, 张中强1, 王立华2, 戴余军1, 都萃颖1
1. 湖北工程学院生命科学技术学院, 湖北省植物功能成分利用工程技术研究中心, 湖北 孝感 432000;
2. 湖北工程学院特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室, 湖北 孝感 432000
收稿日期：2018-10-31；修回日期：2019-01-16；网络出版日期：2019-03-19
基金项目：湖北省教育厅科学技术研究计划青年人才项目（Q20182705）；国家自然科学基金（31700069）；湖北省技术创新专项（重大项目）（2018ABA098）
*通信作者：都萃颖, Tel:+86-712-2345490, E-mail:ducuiying.123@webmail.hzau.edu.cn.
摘要：[目的] 以芽胞杆菌（Bacillus）为筛选对象，分离土壤中可编码乌头酸异构酶（aconitate isomerase，AI）的革兰氏阳性（Gram positive，G+）菌株，以丰富对AI分布的科学认识，为其生物学功能研究奠定理论与材料基础。[方法] 采用土样高温预处理法、含反式乌头酸（trans-aconitic acid，TAA）唯一碳源的ACO固体平板培养法，结合16S rDNA基因序列同源性分析，筛选能够编码AI的芽胞杆菌目的菌株。[结果] 共分离得到22株能够利用TAA碳源的细菌菌株，成功鉴定了其中的16株，分别为巨大芽胞杆菌（Bacillus megaterium）2株，阿氏芽胞杆菌（Bacillus aryabhattai）7株，短小芽胞杆菌（Bacillus pumilus）1株，未鉴定到种的芽胞杆菌（Bacillussp.）6株；且它们所含AI编码基因与已知AI基因在序列上存在差异。[结论] 首次证明可编码AI的芽胞杆菌细菌种类具有多样性，暗示G+细菌广泛编码AI的可能性，更新了AI几乎只在G-细菌中分布的观点，为后续深入挖掘AI基因及其生物学功能研究提供更多可用微生物资源。
关键词：乌头酸异构酶芽胞杆菌分离鉴定乌头酸顺反异构体
Isolation and identification of soil Bacillus strains that encode aconitate isomerase
Cao Zheng1, Lu Cai1, Zhongqiang Zhang1, Lihua Wang2, Yujun Dai1, Cuiying Du1
1. College of Life Science and Technology, Hubei Province Research Center of Engineering Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients, Hubei Engineering University, Xiaogan 432000, Hubei Province, China;
2. Hubei Key Laboratory of Quality Control of Characteristic Fruits and Vegetables, Hubei Engineering University, Xiaogan 432000, Hubei Province, China
*Corresponding author: Cuiying Du, Tel:+86-712-2345490, E-mail:ducuiying.123@webmail.hzau.edu.cn.
Foundation item: Supported by the Research Project of Hubei Provincial Department of Education (Q20182705), by the National Natural Science Foundation of China (31700069) and by the Major Science and Technology Special Project of Hubei Province (2018ABA098)
Abstract: [Objective] Purpose of this work was to specifically screen the Gram positive (G+) bacteria of Bacillus that could encode the aconitate isomerase (AI) enzyme, to enrich our understanding of the distribution of AI and to provide theoretical and material basis for further research. [Methods] Through heat pretreatment of soil sample, plate cultivation by using ACO solid medium containing trans-aconitic acid (TAA) as the sole carbon source and the 16S rDNA sequences homologous analysis, the Bacillus target strains that encode AI can be isolated. [Results] We totally isolated 22 bacterial strains that could utilize TAA carbon from the ACO plate, and 16 of which were successfully classified as:2 strains of Bacillus megaterium, 7 strains of Bacillus aryabhattai, one Bacillus pumilus strain, and 6 undetermined Bacillus sp. strains; besides, we found that the AI-coding genes of these 16 Bacillus isolates were different from the already cloned ones in DNA sequence. [Conclusion] The species diversity of Bacillus bacteria encoding AI enzyme is rich, indicating the encoding ability in more G+ bacteria and updating the old opinion that considered AI distribution mainly in G- hosts. Our research provided available microbial resource for further studies on the identification of AI gene as well as its biological significance.
Keywords: aconitate isomeraseBacillusisolation and identificationcis-trans aconitate isomers
乌头酸异构酶(aconitate isomerase，AI；EC 5.3.3.7)是介导三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)循环中间产物顺式乌头酸(cis-aconitic acid，CAA)与其异构体反式乌头酸(trans-aconitic acid，TAA)之间相互转化的酶(图 1)[1]。1961年，Rao和Altekar以细菌为材料首次提出AI的存在。原因是他们发现一些荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)可以利用ACO培养基中唯一的碳源组分TAA生长；将这种细菌的无细胞提取液在体外与TAA孵育，能检测到柠檬酸的产生，与CAA孵育则能检测到TAA产生[2]。鉴于此种既能够催化CAA生成TAA，也能够将外源TAA经由CAA掺入TCA循环的双向功能(图 2)，Rao和Altekar将荧光假单胞菌中含有的这种新酶命名为“乌头酸异构酶”[2]。此后，能否利用TAA唯一碳源生长被视为判断微生物是否能够编码AI的科学标准[3-4]。虽然由AI介导的乌头酸异构生化反应是细胞重要TCA循环的支路途径，但它却是代谢非必需的[4]。而这也可能是导致迄今为止仅有极少数AI基因被关注和克隆的原因。
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| 图 1 乌头酸异构酶介导CAA与TAA之间的相互转化反应 Figure 1 The interconversion reaction mediated by aconitate isomerase between CAA and TAA. |
| 图选项 |
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| 图 2 乌头酸异构酶在编码细菌中介导的特异生理功能 Figure 2 The specific physiological functions of aconitate isomerase in bacteria. |
| 图选项 |
代谢层面的非必需性暗示了AI支路途径在编码细胞中重要的生理功能[3-5]。最近一项针对线虫病原细菌——苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)[6-8]的研究揭示了生物体内首条AI基因(tbrA)。其编码的TbrA蛋白在体内专一性地行使杀线虫毒素TAA的生物合成功能(图 2)，是Bt致病机制的重要组成部分[1, 9-10]，但TbrA并不赋予Bt代谢TAA碳源的能力[4]。TbrA蛋白的生物学功能虽然与AI催化异构平衡更易朝生成TAA的正反应方向进行这一体外酶学特征相吻合[1, 5, 11]，但人们发现，还有许多细菌能够编码AI，且更多地被用于执行TAA利用的生理功能(图 2)[3-4]，即在体内专一性地介导异构逆反应，而非Bt案例中介导TAA合成的正反应。这说明除了合成毒素，AI还具有其他未知且更普遍的重要生物学功能在等待探索。
细菌TAA利用能力最初在革兰氏阴性(Gram negative，G–)的荧光假单胞菌中发现。后续研究进一步表明，绝大多数能够代谢TAA碳源的细菌也为G–类型。例如，在Watanabe等检测的55株G–细菌和19株G+细菌中，能够利用TAA的个体比例分别为83.6%和21.0%[3]。显著的数值差异究竟是因所调查G+菌株数偏少，还是因G+细菌类型本不倾向编码催化乌头酸异构逆反应的AI，即不倾向具有逆反应所赋予的相应生物学功能？要弄清这一科学问题，有必要检测更多G+细菌利用TAA碳源的能力，这也有利于更加深入地认识与理解目前仍知之甚少的AI生物学意义，为其功能研究做好充分的前期准备工作。
芽胞杆菌是一类广泛存在于自然界中的G+细菌，也是一类广泛应用于农业、工业、医学等领域的重要微生物资源，种类丰富[6, 12]。截至2016年6月，全世界发现并鉴定的芽胞杆菌已达到813种[13]，且它也是目前唯一被报道能够编码AI的G+细菌种类[1]。以芽胞杆菌为对象开展TAA代谢能力的调查研究有利于真实反映G+细菌中的AI分布情况，具备很好的科学代表性与可行性。本文以土壤为实验材料，通过从其中分离并鉴定具有AI编码能力的芽胞杆菌菌株，以期为后期全面揭示AI生物学功能提供更多可用微生物资源。
1 材料和方法 1.1 土壤样品采集 四份土壤样品均采集自湖北省孝感市湖北工程学院生科楼附近，采样深度5–10 cm，采集后装入无菌塑料袋中4 ℃保存备用。其基本理化性质和采集生境如下：1号土壤采自大楼北侧草地，颜色均一，呈棕色，质地紧实，黏度适中，水浸液pH呈弱酸性(pH=6.49)；2号土壤采自大楼东侧菜地，呈均一深棕色，松软，黏度大，碱性(pH=7.84)；3号土壤采自大楼北侧荒地，黄棕色，质地紧实，干燥，碱性(pH=7.87)；4号土壤采自大楼西侧石楠树根系附近，棕色，质地紧实，湿润，弱碱性(pH=7.30)。
1.2 引物 本研究采用扩增细菌16S rDNA基因的通用引物鉴定分离得到的芽胞杆菌菌株[14-15]。引物名称及序列为27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3′，1541R：5′-AAGGAGGTGATCCACCC-3′[16]。用于扩增芽胞杆菌tbrA基因ORF的引物名称及序列为tbrA-1：5′-ATGAAAATACCTTGTTTTGTT-3′，tbrA-2：5′-AGGTATTATTAATTCGCCTTT-3′[1]。用于扩增假单胞菌ais基因不含信号肽部分的ORF的引物名称及序列为ais-1：5′-GCGCAACCCGTC ACCAC-3′，ais-2：5′-CGGCTGGGCGGGAACC-3′[5]。设置上述所有PCR反应的退火温度为52 ℃，35个循环，延伸时间依据产物长度设置为1.0–1.5 min。
1.3 培养基配方 LB培养基(1 L配方)：NaCl，10 g；酵母提取物，5 g；蛋白胨，10 g；调节pH至7.0–7.5，定容。121 ℃高温高压灭菌30 min。固体培养基需添加1.6%–1.8%的琼脂粉。
ACO培养基(含TAA唯一碳源)(1 L配方)[3]：TAA，7.5 g (用NaOH调节pH至7.0，过滤除菌，单独添加)；(NH4)2SO4，2 g；K2HPO4，1 g；MgSO4，0.5 g；FeCl3·6H2O，0.1 g；调节pH至6.5，定容。121 ℃高温高压灭菌30 min。相应固体培养基需添加1.6%–1.8%的琼脂粉。
1.4 试剂与耗材 PrimeSTAR? GXL DNA Polymerase，DNA Ladder Marker购自宝日医生物技术(北京)有限公司；细菌基因组DNA抽提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自Bioteke公司。
常用化学药品购自国药集团化学试剂有限公司，TAA标准品购自Sigma公司。引物合成与DNA测序由北京擎科新业生物技术有限公司完成。
1.5 ACO平板法筛选能够编码乌头酸异构酶的芽胞杆菌 碾磨土壤样品至细粉状，置于80 ℃烘箱中10 min以杀死不产芽胞的细菌；称取1 g粉末状土壤，接种至20 mL液体LB培养基中，置于28 ℃恒温摇床复苏培养2 h；将离心后的培养液涂布ACO固体平板，置于28 ℃恒温培养箱倒置培养2–3 d；将长出的形态上疑似芽胞杆菌的单菌落挑出，在LB固体培养基上复壮；最后将菌落转接至ACO固体平板，以复证其TAA利用能力，并保存于–80 ℃、终浓度为20%的甘油中。对四份实验土壤均施用上述相同操作。
1.6 分离菌株的分子生物学鉴定 分离得到的菌株基因组DNA (gDNA)的提取操作参照细菌总DNA抽提试剂盒说明书。以gDNA为模板特异性扩增16S rDNA基因片段，回收扩增产物并测序，将获得序列在GenBank数据库中利用BLAST在线比对工具获取分离菌株的种属信息。
2 结果和分析 2.1 从土壤样品中分离可编码乌头酸异构酶的芽胞杆菌菌株 芽胞杆菌在自然环境中一般以抗逆性强的芽胞形式存在[6]。这一特性使得可以通过对土壤高温预处理以杀死对热敏感的无芽胞细菌，而大比例分离到具有潜在AI编码能力的芽胞杆菌目的菌株。作者前期发现，如果待检测细菌处于休眠的芽胞期，即使基因组编码AI也不能使菌体表现出TAA利用能力。这说明ACO培养基无法促使芽胞萌发，因此，在丰富营养条件下的复苏培养环节十分必要。结果表明，从1–4号土壤样品中分别筛选到16株、1株、2株、3株，共22个形态疑似芽胞杆菌的单菌落，其中以来自草地生态环境的1号土壤样品含有的目标菌落数最多。随后，将22个单菌落复点在ACO平板上进行TAA利用能力复证(图 3)，相应菌落形态观察结果及与土壤样品编号的对应关系见表 1。
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| 图 3 ACO平板法复证筛得土样菌株的TAA利用能力 Figure 3 Verification of TAA utilizing ability of the soil bacterial isolates by second-round ACO plate test. Strains B1–B16, B17, B18–B19 and B20–B22 were isolated from 1#–4# soil samples, respectively. |
| 图选项 |
表 1. 筛得土样菌株的菌落形态观察与样品来源 Table 1. Colony morphology observation and sample source of the soil bacterial isolates
| Strain number | Soil source | Colony color | Transparency | Glossiness | Humidity |
| B1 | 1# (grassland, north) | white | Low | Low | Low |
| B2 | 1# (grassland, north) | slight yellow | Low | Low | Low |
| B3 | 1# (grassland, north) | white | Low | Low | Low |
| B4 | 1# (grassland, north) | slight yellow | Low | Low | Low |
| B5 | 1# (grassland, north) | slight yellow | Low | Low | Low |
| B6 | 1# (grassland, north) | slight yellow | Low | Low | Low |
| B7 | 1# (grassland, north) | slight yellow | Low | Low | Low |
| B8 | 1# (grassland, north) | slight yellow | Low | Low | Low |
| B9 | 1# (grassland, north) | slight yellow | Low | Low | Low |
| B10 | 1# (grassland, north) | slight yellow | Low | Low | Low |
| B11 | 1# (grassland, north) | slight yellow | Low | Low | Low |
| B12 | 1# (grassland, north) | slight yellow | Low | Low | Low |
| B13 | 1# (grassland, north) | white | Low | Low | Low |
| B14 | 1# (grassland, north) | orange | Low | High | High |
| B15 | 1# (grassland, north) | slight yellow | Low | Low | Low |
| B16 | 1# (grassland, north) | slight white | Low | Low | Low |
| B17 | 2# (vegetable field, east) | slight yellow | Low | Low | Low |
| B18 | 3# (wasteland, north) | slight yellow | Low | Low | Low |
| B19 | 3# (wasteland, north) | yellow | Low | Low | Low |
| B20 | 4# (Photinia serrulata rhizosphere, west) | slight white | Low | Low | Low |
| B21 | 4# (Photinia serrulata rhizosphere, west) | yellow | Low | Low | Low |
| B22 | 4# (Photinia serrulata rhizosphere, west) | yellow | Low | Low | Low |
表选项
2.2 目的菌株的鉴定 分别抽提上述22株目的菌株的总DNA并用作PCR反应模板，利用通用引物对27F/1541R进行16S rDNA基因扩增。琼脂糖凝胶电泳结果显示，除了B9和B20菌株的总DNA模板未获得扩增产物，其余20株细菌均成功扩增，DNA产物大小约1.5 kb。依次纯化20个16S rDNA基因扩增产物，交付北京擎科新业生物技术有限公司进行DNA序列测定。结果显示，B3、B10、B12、B16菌株测序失败。
将测序成功的16株细菌的16S rDNA序列在GenBank数据库中经BLAST比对分析显示，16株细菌均隶属于芽胞杆菌属(Bacillus genus) (表 2)。其中B14菌株能够产生明显的橘黄色色素，与之最为相近的种是Bacillus sp. BZ69，这一结果与已报道的Bacillus sp. BZ-SZ-XJ18菌株同样产生橘黄色色素的性状相一致[17]。具体鉴定结果见表 2。
表 2. 16株目的菌株的种属鉴定表 Table 2. Species identification of the 16 bacterial isolates
| Strain number | Identified species of isolated strains by BLAST | Coverage/% | Identity/% |
| B1 | Bacillus megaterium L24 | 97 | 99 |
| B2 | Bacillus aryabhattai isolate PSB56 | 98 | 99 |
| B4 | Bacillus aryabhattai strain L42 | 98 | 99 |
| B5 | Bacillus aryabhattai strain L21 | 99 | 99 |
| B6 | Bacillus aryabhattai strain L21 | 99 | 99 |
| B7 | Bacillus aryabhattai strain L21 | 99 | 99 |
| B8 | Bacillus sp. NBGD33 | 98 | 99 |
| B11 | Bacillus megaterium GC61 | 98 | 99 |
| B13 | Bacillus sp. SZ087 | 96 | 99 |
| B14 | Bacillus sp. BZ69 | 99 | 99 |
| B15 | Bacillus sp. SZ087 | 97 | 99 |
| B17 | Bacillus sp. ADJ17 | 99 | 99 |
| B18 | Bacillus sp. 7B-635 | 99 | 99 |
| B19 | Bacillus aryabhattai L21 | 99 | 99 |
| B21 | Bacillus aryabhattai IHB B 7132 | 99 | 99 |
| B22 | Bacillus pumilus GC43 | 99 | 99 |
表选项
2.3 目的菌株中所含乌头酸异构酶基因的初步分析 目前，tbrA是G+细菌中唯一已知的AI编码基因，克隆自Bt菌株CT-43[4]。为了验证上述鉴定株是否含有该基因，我们设计了覆盖tbrA ORF全长(1071 bp)的PCR扩增实验。如图 4-A所示，16株芽胞杆菌鉴定株对应的扩增结果均为阴性，说明它们含有的目的基因在序列上与tbrA存在差异。但由于可供参考的AI基因数量实在太少，我们无法进一步确定这种差异究竟是tbrA同源序列间的差异还是来自不同进化起源即新型AI基因间的差异，只能等待后续克隆得到更多AI基因并分析其序列特征后才能有所定论。此外，ais是G–细菌中唯一已知的AI编码基因，克隆自Pseudomonas sp. WU-0701菌株[5]。该AI蛋白全长261 aa，N端1–22 aa为G–细菌周质空间定位信号肽。利用覆盖23–261 aa区域的引物对16株芽胞杆菌鉴定株总DNA进行扩增，结果也均为阴性(图 4-B)。
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| 图 4 PCR验证16株芽胞杆菌鉴定株含有tbrA基因(A)和ais基因(B)的情况 Figure 4 PCR verification of the existence of tbrA (A) and ais (B) genes in 16 identified Bacillus strains. –: the negative control using ddH2O as template; +: the positive control using Bt CT-43 gDNA as template. |
| 图选项 |
虽然以上分析未能为所分离菌株中AI基因的后续解析提供明确的指导性信息，但它强烈地说明了需要加强细菌中AI基因鉴定工作力度的必要性。而本研究所获的这16株芽胞杆菌就为今后这项工作的开展提供了宝贵菌株材料。
3 讨论 本文从4份采集地理位置相对集中的土壤样品中均分离获得了可编码AI的芽胞杆菌菌株。这其中包含的3种芽胞杆菌(B. megaterium，B. aryabhattai，B. pumilus)，5株有可能隶属于其他种的芽胞杆菌(Bacillus sp. ADJ17，Bacillus sp. NBGD33，Bacillus sp. SZ087，Bacillus sp. BZ69，Bacillus sp. 7B-635)，再结合已明确报道能高效利用TAA的贝莱斯芽胞杆菌(B. velezensis)[4]，共同说明了芽胞杆菌属中可编码AI的细菌种类具有多样性。本研究结果与21年前由Watanabe等建立的只有极少数G+细菌如丁酸梭菌Clostridium butyricum才具有AI编码能力的观点[3]有所不同，扩展了能够编码AI的G+细菌范围；同时，此类G+细菌成员数量的增加也暗示了G+细菌有可能同G–细菌一样，出于某种未知的功能目的而广泛编码AI。本研究的发现能够极大促进人们对于AI分布及其所介导生物学功能的科学认识，也说明了选择芽胞杆菌作为筛选对象的科学性与可行性。
既然身为代谢非必需的生化途径，AI蛋白究竟在编码菌中介导了何种生物学功能，使得众多G–、G+细菌都需要编码这种活性蛋白质？从Watanabe等的研究和本文中不难看出，绝大多数具有AI编码能力的细菌都是植物相关细菌(plant-associated bacteria)或是从植物生境中分离获得(表 1)，而TAA本身又是一种较广泛存在尤其是在草料中大量存在的分泌性植物碳源[18-23]。有理由推测，TAA利用能力很可能是这些编码细菌多元碳源同化机制中的一条新途径，用以满足自身在特定环境中生长时对碳源营养的需求。的确有研究表明，多元碳源利用能力有助于细菌在含有相应碳源的植物环境中获得明显的生长、定殖与竞争优势[24]。例如，葡萄病原菌——葡萄土壤杆菌(Agrobacterium vitis)由于携带了酒石酸代谢功能基因区段TARI、TARII和TARIII，而能够以葡萄宿主中丰富的酒石酸成分为碳源进行旺盛的生长繁殖[25-26]；细菌中草酸或鼠李糖单一成分利用能力的缺失可显著削弱其在植物根表单独定殖与混合定殖时的生物量[27-28]。因此，本研究认为AI蛋白很可能具有帮助编码细菌获取多元植物碳营养，用以强化自身宿主环境适应性的重要生物学功能，后期可以通过构建AI基因缺失突变株并测定其生长、定殖、竞争等适应性表型的变化进行验证。前述提到，在线虫病原芽胞杆菌中，AI并不介导碳源利用功能，而是特异性地催化异构正反应，即杀线虫毒素TAA的生物合成。这些结果共同描绘出了AI蛋白能够针对不同类型细菌产生灵活且特异的环境适应能力的功能轮廓，为其后续细致的生物学功能研究指明了方向。
AI虽为重要的功能性蛋白，但一直未收获足够的科学重视。目前，仅有两条AI基因被克隆，一条是G+细菌中用于介导TAA合成表型的tbrA，其所编码的TbrA蛋白含有357个氨基酸，属于PrpF异构酶超家族，定位于细胞质中[4]；另一条是2015年由日本****Yuhara等在G–型Pseudomonas sp. WU-0701细菌中分离得到的ais[5]，其编码蛋白既能催化细胞合成TAA也能够介导TAA利用表型，但保守结构域分析表明该序列不含任何已知的催化功能模块，暗示AI蛋白很可能存在新型的化学异构机制。同时，该蛋白属于type 2 periplasmic binding protein超家族，定位于细胞周质空间，并与假单胞菌P. psychrotolerans和白纹黄单胞菌(Xanthomonas albilineans)中一种负责富集环境中钼或钨等微量金属元素并泵入胞内的钼离子ABC转运子底物结合蛋白(molybdenum ABC transporter substrate-binding protein)分别具有90%和74%相似性，极强地暗示了AI介导环境营养利用的假定功能，与上述本研究所推测的AI功能方向相一致。前期利用tBLASTn比对，我们发现tbrA基因广泛分布在Bt、B. cereus等芽胞杆菌细菌中(coverage 100%，identity 100%)[1]，但不存在于本文的16株芽胞杆菌鉴定株中(图 4-A)，暗示新型AI序列存在的可能性；来源于G–细菌的ais基因序列则不存在于任何目前已测序的芽胞杆菌基因组中，因此容易理解PCR扩增未能获得相应产物条带的实验结果(图 4-B)。值得注意的是，TbrA与AI氨基酸序列之间相似度极低(coverage 18%，identity 50%)[4]，说明乌头酸异构酶基因在G+与G–细菌中也可能具有特异的起源方式，预示着新型AI的发现和鉴定仅仅通过序列比对可能很难有所进展。为了获得序列更加多元、催化活性更强的AI蛋白，以方便AI功能性应用及丰富对AI序列保守性或进化的科学认识，后续研究可扩大筛选范围，直接分离能利用TAA的土壤细菌或其他生态环境中的细菌甚至真菌，系统性地建立菌株与基因资源库。
综上所述，本研究以土壤为实验材料，通过以TAA为唯一碳源的营养筛选法成功分离和鉴定了16株能够编码AI的芽胞杆菌菌株，直观地丰富了人们对于AI在G+细菌中的分布认识。后续可通过蛋白质逐级分离纯化或序列比对等策略鉴定这些菌株中的AI蛋白。另一方面，也可通过LC-MS技术检测这些蛋白能否介导TAA毒素合成，从而有可能应用于现状窘迫的植物寄生线虫防治[29-33]。
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