张芷睿, 陈晨, 韩彩静, 高云娜, 刘春雷, 闵伟红
吉林农业大学食品科学与工程学院, 小麦和玉米深加工国家工程实验室, 吉林 长春 130118
收稿日期：2017-06-23；修回日期：2017-07-29；网络出版日期：2017-09-27
基金项目：吉林省玉米生物高效转化及精深加工创新团队（20150519012JH）
*通信作者：闵伟红, Tel:+86-431-84533329;E-mail:minwh2000@vip.163.com
摘要：[目的]对北京棒杆菌（Corynebacterium pekinense）天冬氨酸激酶（Aspartate kinase，AK）进行改造，期望获得具有较高酶活力且酶活性质改善的高产天冬氨酸族氨基酸的优良突变株，并削弱甚至解除Thr对AK的反馈抑制作用。[方法]利用定点突变技术对Gln（Q）316位点进行突变，高通量筛选获得活力提高明显的突变体，并将其在大肠杆菌BL21中高效表达，对野生型（Wild type，WT）和突变体Q316P AK用镍柱纯化，进行酶动力学及酶学性质研究。[结果]获得突变体Q316P，并在大肠杆菌BL21中成功表达。与野生型相比，突变体Q316P的Vmax提高8.53倍，n值由2.15降低为1.29，正协同性减弱；最适温度由25 ℃升高至30 ℃；最适pH由8.0降低至7.5，半衰期由3.8 h延长至5.0 h；且在实验范围浓度内，底物抑制剂苏氨酸对突变体Q316P表现出激活作用；Q316P AK对金属离子K+和有机溶剂甲醇表现出良好抗性。[结论]获得酶活力提高、酶学性质改善的突变体，并一定程度上解除苏氨酸对AK的反馈抑制，为构建高产天冬氨酸族氨基酸工程菌提供参考。
关键词： 北京棒杆菌 天冬氨酸激酶 定点突变 动力学 酶学性质
Characterization of Q316P mutant of aspartate kinase from Corynebacterium pekinense
Zhirui Zhang, Chen Chen, Caijing Han, Yunna Gao, Chunlei Liu, Weihong Min
National Engineering Laboratory on Wheat and Corn Further Processing, College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, Jilin Province, China
Received 23 June 2017; Revised 29 July 2017; Published online 27 September 2017
*Corresponding author: Weihong Min, Tel: +86-431-84533329; E-mail: minwh2000@vip.163.com
Supported by the Effieient Transformation of Corn and Intensive Processing Innovation Team of Jilin Province (20150519012JH)
Abstract: [Objective]To obtain a new aspartate kinase (AK) with higher activity and better properties of highly produced aspartic acid family from Corynebacterium pekinense by spatial structure transformation, and attenuate or release the feedback inhibition of AK.[Methods]The Gln(Q)316 of AK was mutated by site-directed mutagenesis, and mutant strain with the highest activity was selected by high throughput screening. The mutant was expressed in Escherichia coli BL21. AK of the wild type and mutant strain was purified by Ni2+-NTA column and then the characterized.[Results]The mutant Q316P was constructed, and successfully expressed in E. coli BL21. Compared with the wild type, Vmax of Q316P was increased by 8.53 times, and the n values was decreased from 2.15 to 1.29. The optimum temperature was increased from 25 ℃ to 30 ℃, the optimum pH was decreased from 8.0 to 7.5 and the half-time period was increased from 3.8 h to 5.0 h. The inhibition of the substrate inhibitor threonine was not only relieved but also threonine had an active effect on the activity of Q316P. Q316P had better resistance to methanol and K+.[Conclusion]Our findings provided a reference for the construction of high-yield aspartic acid family engineering strain.
Key words: Corynebacterium pekinense aspartate kinase site-directed mutagenesis kinetics characterization
天冬氨酸激酶(Aspartate kinase，AK)是天冬氨酸族氨基酸合成途径的首个关键酶[1]，对天冬氨酸族氨基酸生产具有重要意义，该途径合成人体必需氨基酸，如苏氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸以及异亮氨酸[2-3]。由天冬氨酸代谢途径[4-5]可知，AK受到Thr和Lys的协同反馈抑制作用，限制了天冬氨酸族氨基酸的积累。因此解除对AK的反馈抑制，对提高其酶活力，改善其酶学性质具有重要意义。
北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)最初由我国鉴定并用于生产L-谷氨酸[6]，其天冬氨酸族氨基酸的生产潜力有待进一步挖掘。2011年，汪一名[7]对北京棒杆菌天冬氨酸激酶(CpAK)进行基因克隆，并与其他已知棒杆菌中天冬氨酸激酶序列比对分析，结果表明，CpAK与谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶(AK from Corynebacterium glutamicum，CgAK)氨基酸同源性高达99.58%，且反馈抑制机制相似。Yoshida[8]通过对CgAK抑制机制分析表明，Gln298的氮原子与抑制剂Thr的羟基端以离子键直接相连。通过序列分析可知，CgAK中Gln298对应于CpAK中Gln(Q)316，我们推测，破坏Gln298与抑制剂Thr之间的作用力有利于削弱甚至解除Thr对AK的反馈作用。因此本研究采用定点突变技术，通过高通量筛选，获得重要突变体，研究其酶动力学及酶学性质，期望获得发酵能力较强、性质改善并稳定遗传的突变菌株，为构建高产天冬氨酸族氨基酸工程菌提供理论依据。
1 材料和方法 1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒: 北京棒杆菌C. pekinense E31，由中国科学院微生物研究所提供；重组质粒pET-28a-AK[7]，由吉林农业大学发酵工程实验室提供；表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
1.1.2 培养基: LB培养基[9]，本研究中除特殊说明外，均含50 μg/mL卡那霉素。
1.1.3 试剂: 引物合成和菌液测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；质粒抽提试剂盒、PCR试剂盒、电泳Marker，购于大连TaKaRa公司；SDS-PAGE凝胶试剂盒，购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司；卡那霉素、IPTG购于Genview公司；非变性镍柱柱料，购于GE公司。
1.2 引物设计及饱和定点突变 用Primer Premier 5引物设计软件对CpAK中Q316位点进行设计，并送生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成，引物设计如下，上游引物5′-CAACATTGACATGGTTCTGNNNAACGTCTCCTC-3′，下游引物5′-CTTCCACAGAGGAGACGTTNNNCAGAACCATG-3′。其中划线部分为突变位点。利用合成的引物，以重组质粒pET-28a-AK为模板，进行突变PCR扩增，反应体系及条件见参考文献[10]。将PCR产物经0.1%琼脂糖凝胶电泳验证。成功扩增的PCR产物用Dpn Ⅰ酶消化，以去除甲基化模板，消化后产物可直接用于转化实验。
1.3 消化质粒转化 取1.2 μL消化产物转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴10 min，42 ℃热激90 s，再冰浴2 min，后加入900 μL不含卡那霉素的LB培养基，37 ℃、160 r/min培养1 h，8000 r/min离心1 min，吸取800 μL上清液，弃去，在剩余上清液中将菌体重悬，涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基上，37 ℃过夜培养，对照组为不含卡那霉素的空感受态。
1.4 突变株高通量筛选及AK基因验证 将转化成功的单菌落接种至含有200 μL LB液体培养基的96孔板中，于37 ℃、180 r/min过夜培养。吸取10 μL菌液接种至新的96孔板中，37 ℃、200 r/min培养4.5 h，加入IPTG诱导剂(终浓度为1 mmol/L)，30 ℃、130 r/min诱导8 h。诱导后3500 r/min离心45 min，弃上清，收集菌体。加入100 μL PBS重悬菌体，于-80 ℃、30 min与30 ℃、30 min反复冻融3-5次。用酶标仪在波长540 nm下测其吸光度。选择酶活力提高明显的突变株转入10 mL LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min过夜培养。在克隆引物作用下，以活化菌体为模板进行PCR扩增。PCR反应体系及条件见参考文献[10]。将PCR产物进行0.1%琼脂糖凝胶电泳验证。将成功验证的菌株送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序，确定突变型。
1.5 AK诱导表达及蛋白纯化 取2 mL菌液转入100 mL LB液体培养基中扩大培养，加IPTG诱导蛋白表达，诱导发酵8 h，4 ℃、8000 r/min离心10 min，后弃掉上清液，收集菌体。参照朱运明[11]实验方法将粗酶液经非变性镍柱纯化，所得即为AK纯化液。将粗酶液和纯化液进行SDS-PAGE和Western blotting验证，方法见参考文献[12]。
1.6 AK酶活力测定 以L-天冬氨酸为底物，对天冬氨酸激酶进行酶活力测定。酶活力表示为U=1000×A540nm，以每分钟每毫克蛋白质(考马斯亮蓝法)生成稳定的异羟肟酸微摩尔数为比活力[13]。酶活测定体系为：800 mmol/L KCl、10 mmol/L L-Asp、100 mmol/L Tris-HCl、800 mmol/L NH4OH、10 mmol/L β-巯基乙醇、10.4 mmol/L ATP、1.6 mmol/L MgSO4，每孔加入10 μL酶液，28 ℃、130 r/min反应30 min[13-15]。反应后加入等体积的三氯化铁终止试剂混匀，于波长540 nm下测其吸光度。
1.7 AK酶动力学研究 酶活力测定方法为反应体系中其他条件不变的情况下，改变底物浓度(分别为0.5、1、3、5、7、9、10、12、14、16 mmol/L)，测定AK的活力。以Hill方程V=Vmax(Sn)/(Kn+Sn)进行线性拟合。
1.8 AK酶学性质研究
1.8.1 最适pH研究: 反应体系其他条件不变，改变Tris-HCl的pH (从6.0-10.0，每组间隔0.5)，设置10组实验，测定AK最适pH。以最高酶活定义为100%。
1.8.2 最适温度研究: 反应体系不变，在不同温度下(15、20、25、26、28、30、35、40、45、50 ℃)测定AK最适温度，以最高酶活定义为100%。
1.8.3 稳定性研究: 在最适pH和最适温度下，相同反应体系，每隔1 h测定1次酶活。以0 h相对酶活定义为100%。
1.8.4 底物抑制剂对AK活力的影响: 向反应体系中添加不同浓度(0.2、1.0、5.0、10.0 mmol/L)的底物抑制剂，分别为Thr、Lys、Met、Thr+Lys、Thr+Met、Lys+Met、Thr+Lys+Met，测定其对AK活力的影响，以不添加底物抑制剂的对照组相对酶活定义为100%。
1.8.5 金属离子对AK活力的影响: 反应体系其他条件不变，分别测定在不同浓度(0.2、1.0、5.0、10.0 mmol/L)的金属离子(Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Ni2+、Fe3+)存在的条件下，对AK活力的影响，以不添加金属离子的对照组相对酶活定义为100%。
1.8.6 有机溶剂对AK活力的影响: 向反应体系中添加不同浓度(0.2、1.0、5.0、10.0 mmol/L)的有机溶剂，分别为甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、乙腈、二甲基亚砜、甘油，测定其对AK活力的影响，以不添加有机溶剂的对照组相对酶活定义为100%。
1.9 数据分析 每组实验重复3次，实验结果以x±s表示。采用SPSS 19.0进行统计学分析。采用软件Origin Pro 8.5作图。
2 结果和分析 2.1 天冬氨酸激酶突变体Q316P重组菌的构建 以pET-28a-AK提取的质粒为模板，在引物的作用下，选择54、56、58 ℃ 3个退火温度，进行突变PCR。将突变PCR产物在1%琼脂糖核酸电泳下进行验证，验证结果如图 1-A显示，突变PCR产物在7000 bp处具有明亮条带，这与pET-28a-AK质粒长度6822 bp (pET-28a 5369 bp，CpAK 1453 bp)相符，证明质粒在引物作用下实现了大量的复制。
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| 图 1 PCR产物的1%琼脂糖核酸电泳验证 Figure 1 1% agarose electrophoresis of PCR products. A: the result of PCR mutant products. M: 10000 bp DNA marker; lane 1: annealing temperature 54 ℃; lane 2: annealing temperature 56 ℃; lane 3: annealing temperature 58 ℃. B: verification of the AK gene; M: 2000 bp DNA marker; lane 1: WTAK; lane 2: mutant. |
| 图选项 |
将挑取的单克隆菌落，在液体LB培养基中活化后，以其为模板进行PCR扩增，经1%琼脂糖核酸电泳验证，验证结果如图 1-B显示，在1000-2000 bp之间有明亮条带，突变体与野生型一致，符合AK长度1453 bp，证明AK基因已成功导入大肠杆菌BL21感受态中。将验证成功的突变株测序，结果显示突变株为Q316P，即由极性不带电荷的氨基酸谷氨酰胺(Gln)突变为非极性氨基酸脯氨酸(Pro)。
2.2 野生型和突变体Q316P蛋白表达与纯化 野生型和突变体Q316P经非变性镍柱纯化后，SDS-PAGE和Western blotting验证结果如图 2，野生型粗酶液、纯化液和突变体Q316P纯化液在48 kDa左右处均存在明亮条带，这与Kalinowski等[16]所报道的结果相符。Western blotting结果显示，在同一位置处野生型和突变体Q316P具有目的条带，表明AK蛋白表达成功。
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| 图 2 12% SDS-PAGE和Western blotting验证结果 Figure 2 Results of 12% SDS-PAGE and Western blotting. M: protein marker; lane 1: the purification of WTAK; lane 2: the mixing of WTAK; lane 3: the purification of Q316P AK; lane 4: the Q316P AK result of Western blotting; lane 5: the WTAK result of Western blotting. |
| 图选项 |
2.3 野生型和突变体Q316P的动力学结果 以L-天冬氨酸为底物，利用紫外可见分光光度计分别对野生型和突变体Q316P中AK活力进行测定。测定结果用OriginPro8.5软件进行动力学曲线拟合，结果如图 3所示。突变体Q316P AK的最大反应速率Vmax为30.62 U/(mg·min)，较野生型[Vmax为3.59 U/(mg·min)]提高了8.53倍。野生型AK的动力学参数Km为4.15，突变体Q316P AK的Km值为5.69，表明突变后酶与底物的亲和力有所降低。结果显示，野生型AK的希尔系数n值为2.15，属于别构酶，突变体Q316P AK的n值为1.29，突变后AK的正协同性降低，趋于米氏酶，表明突变后不利于与抑制剂相结合，这可能是由于Gln316为极性不带电氨基酸，突变后Pro316为非极性脂肪族氨基酸(图 3-B)，且突变后与抑制剂Thr间离子键断裂，氨基酸侧链缩短，R基远离抑制剂Thr，使抑制剂Thr稳定性降低。
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| 图 3 野生型和突变体Q316P动力学结果 Figure 3 Dynamics result of WT and mutant Q316P. A: dynamics curves of WT and mutant Q316P; B: position change diagram of mutant and WT. |
| 图选项 |
2.4 野生型和突变体Q316P酶学性质表征
2.4.1 最适温度和pH值: 由图 4-A可知，突变体Q316P最适温度为30 ℃，比野生型AK提高了5 ℃。突变体Q316P在15-30 ℃范围内，酶活力随温度升高而增高，在30-50 ℃范围内酶活力随之升高而降低，与野生型相比，突变体Q316P表现出良好的耐热性。由图 4-B可知，突变体Q316P最适pH为7.5，比野生型AK降低了0.5，pH小于7.5时，酶活力随pH升高而增高，表现出良好的耐酸性，当pH大于7.5时，酶活力急剧下降，pH为10时，酶活力已不足10%。
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| 图 4 野生型和突变体Q316P最适温度(A)和最适pH值(B) Figure 4 The effect of optimum temperature (A) and pH (B) to WT and mutant Q316P. Results are means±SD of three parallel measurements. |
| 图选项 |
2.4.2 热稳定性: 图 5为在最适温度30 ℃和最适pH为7.5的条件下，野生型和突变体Q316P相对酶活力与时间变化的关系，当相对酶活力下降至最初状态的一半时的时间即为酶的半衰期。由图 5可知，野生型的半衰期为3.8 h，突变体Q316P的半衰期较野生型提高了1.2 h，在5.0 h时相对酶活力达到50%。突变后半衰期升高可能是由于突变是从亲水性氨基酸Q316变为疏水性氨基酸P316，增加了蛋白质的堆叠，从而提高稳定性[17-18]。
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| 图 5 野生型和突变体Q316P的热稳定性 Figure 5 Thermostability curves of WT and mutant Q316P. Results are means±SD of three parallel measurements. |
| 图选项 |
2.4.3 底物抑制剂对AK活力的影响: 由表 1可知，野生型中AK受到Thr和Lys以及二者协同抑制，受Met影响较小。对于突变体Q316P，Thr存在下，AK活力极显著提高(P＜0.01)，尤以Thr单独存在时酶活力提高明显，且不同浓度均表现出激活作用。低浓度的Thr+Met对酶活力表现出激活作用，高浓度下虽轻微抑制，但酶活力较野生型相比仍有明显提高。结果显示，Lys对突变体Q316P仍起到抑制作用，Met对其影响较野生型相差不大。因此，只有Thr存在下，对其产生激活作用，这与本研究目的相符。
表 1. 底物抑制剂对野生型和突变体Q316P中AK活力的影响 Table 1. The influence of substrate inhibitors on the enzyme activity (%) of WT and Q316P
| Substrate inhibitor | WT | Q316P | |||||||
| 0.2 mmol/L | 1.0 mmol/L | 5.0 mmol/L | 10.0 mmol/L | 0.2 mmol/L | 1.0 mmol/L | 5.0 mmol/L | 10.0 mmol/L | ||
| Control | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | |
| Thr | 90.28±0.40 | 83.97±1.20 | 60.36±1.30 | 51.33±0.80 | 156.23±1.80** | 135.69±2.40** | 114.78±1.40** | 106.23±1.00** | |
| Lys | 83.86±1.80 | 65.61±1.30 | 58.92±2.10 | 38.55±3.60 | 85.25±1.10 | 72.36±0.90 | 64.95±1.50 | 54.36±2.70* | |
| Met | 97.63±1.90 | 94.34±0.80 | 89.89±2.30 | 86.34±3.30 | 88.23±3.10* | 90.67±1.50 | 85.28±1.90 | 80.85±1.60 | |
| Thr+Lys | 77.22±1.60 | 54.76±3.70 | 25.26±1.10 | 20.36±1.50 | 108.23±1.60** | 95.35±2.30** | 71.58±1.00** | 69.22±1.80** | |
| Thr+Met | 86.34±2.90 | 76.51±1.40 | 51.89±0.70 | 42.67±0.90 | 136.58±0.80** | 116.13±0.40** | 98.69±2.60** | 88.16±0.90** | |
| Lys+ Met | 85.47±2.00 | 58.44±0.50 | 48.26±1.40 | 36.34±1.20 | 91.51±1.20* | 69.26±0.40* | 45.49±1.30 | 38.44±1.50 | |
| Thr+Lys+Met | 59.76±1.50 | 40.51±0.90 | 20.13±1.70 | 15.23±1.60 | 86.63±0.70* | 85.39±1.30* | 41.66±1.60* | 35.48±1.70* | |
| Q316P compared to WT at the same substrate inhibitor and concentration; **means the difference is significant at the 0.01 level; *means the difference is significant at the 0.05 level; Results are means±SD of three parallel measurements. | |||||||||
表选项
2.4.4 金属离子对AK活力的影响: 天冬氨酸激酶是金属酶，因而其活性受金属离子的影响。本研究探讨了部分金属离子对野生型和突变体Q316P中AK酶活力的影响，研究结果见表 2。对于野生型，一价金属离子Na+和K+对酶并未产生明显的抑制或激活作用；二价金属离子中，除了Zn2+和Ni2+以及低浓度的Mg2+起到激活作用外，其他金属离子均对酶有不同程度的抑制作用；三价金属离子Fe3+也起到抑制作用，且随着浓度的升高抑制作用增强。对于突变体Q316P，一价Na+随着浓度升高相对酶活力极显著降低(P＜0.01)，在高浓度的K+存在下相对酶活力极显著提高(P＜0.01)，且起到激活作用，二价金属离子Ca2+在低浓度下对酶活力有极显著提高(P＜0.01)，Zn2+激活作用较野生型略有下降，三价金属离子Fe3+对Q316P相对酶活力有极显著提高(P＜0.01)，低浓度时由抑制作用变为激活作用。其他金属离子较野生型均无极显著变化。
表 2. 金属离子对野生型和突变体Q316P中AK活力的影响 Table 2. The influence of metalions on the enzyme activity of WT and Q316P
| Metalion | WT | Q316P | |||||||
| 0.2 mmol/L | 1.0 mmol/L | 5.0 mmol/L | 10.0 mmol/L | 0.2 mmol/L | 1.0 mmol/L | 5.0 mmol/L | 10.0 mmol/L | ||
| Control | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | |
| Na+ | 81.53±0.30 | 90.24±1.40 | 97.42±1.30 | 93.72±1.60 | 78.28±1.60 | 71.17±1.30** | 66.00±2.30** | 58.94±1.40** | |
| K+ | 89.34±1.50 | 87.97±2.00 | 91.65±0.70 | 95.69±0.80 | 91.94±0.50 | 90.44±0.60 | 132.45±1.90** | 126.56±1.50** | |
| Ca2+ | 50.68±3.20 | 65.47±1.10 | 79.54±2.20 | 86.23±3.10 | 79.06±1.40** | 77.94±2.40** | 77.56±1.70 | 80.00±0.80 | |
| Mg2+ | 127.83±0.80 | 115.36±0.50 | 75.26±0.80 | 69.47±2.20 | 122.22±2.50 | 119.22±3.20 | 84.56±1.90* | 63.72±1.30 | |
| Zn2+ | 105.23±1.90 | 115.13±3.10 | 132.66±1.90 | 159.65±1.50 | 90.44±1.50** | 102.89±1.60** | 112.94±0.30** | 126.50±0.60** | |
| Mn2+ | 74.58±1.80 | 72.46±0.90 | 54.65±0.20 | 58.46±1.00 | 88.22±2.60* | 56.72±1.80* | 49.00±1.80 | 52.72±1.70 | |
| Cu2+ | 77.29±0.70 | 69.47±0.60 | 51.54±0.60 | 44.23±1.50 | 82.83±1.70 | 70.21±0.60 | 53.83±1.30 | 47.06±1.10 | |
| Ni2+ | 132.35±0.40 | 119.22±1.50 | 102.58±0.80 | 98.67±0.90 | 133.11±1.30 | 107.33±1.40* | 106.22±0.90 | 89.56±2.40* | |
| Fe3+ | 76.54±2.50 | 73.33±1.30 | 64.59±1.70 | 40.04±1.60 | 105.23±0.80** | 102.39±1.10** | 85.17±1.20** | 78.50±2.60** | |
| Q316P compared to WT at the same metalion and concentration; **means the difference is significant at the 0.01 level; *means the difference is significant at the 0.05 level; Results are means±SD of three parallel measurements. | |||||||||
表选项
2.4.5 有机溶剂对AK活力的影响: 由表 3可知，所有有机溶剂对野生型AK均表现出抑制作用，对于突变体Q316P，不同浓度的甲醇对AK活力均有极显著提高(P＜0.01)，尤以浓度为1%时表现出激活作用。其他有机溶剂如乙醇、异丙醇对AK活力有显著提高(P＜0.05)，且在低浓度时有极显著提高(P＜0.01)，在高浓度的甘油存在下，对突变体Q316P中AK的活力提高显著(P＜0.05)。综上分析，突变体Q316P较野生型相比对有机溶剂表现出良好抗性。
表 3. 有机溶剂对野生型和突变体Q316P中AK活力的影响 Table 3. The influence of organic solvent on the enzyme activity of WT and Q316P
| Organic solvent | WT | Q316P | |||||||
| 0.2 mmol/L | 1.0 mmol/L | 5.0 mmol/L | 10.0 mmol/L | 0.2 mmol/L | 1.0 mmol/L | 5.0 mmol/L | 10.0 mmol/L | ||
| Control | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | |
| Methanol | 85.80±1.30 | 63.42±0.60 | 47.02±0.60 | 35.37±0.70 | 113.75±1.20** | 91.74±1.40** | 71.60±0.50** | 69.17±1.60** | |
| Ethanol | 73.84±1.60 | 54.54±0.80 | 46.12±0.50 | 34.03±0.60 | 99.28±1.60** | 89.17±1.30** | 64.93±0.40* | 48.13±1.40* | |
| Isopropyl alcohol | 67.37±1.20 | 47.73±1.00 | 48.77±1.10 | 48.03±1.30 | 91.25±1.80** | 69.93±1.60** | 58.75±0.80* | 48.01±1.10 | |
| N-butanol | 90.42±0.50 | 89.30±0.70 | 68.11±1.50 | 43.71±0.90 | 90.88±0.90 | 82.86±1.40* | 71.64±0.70 | 57.67±1.70* | |
| Acetonitrile | 79.71±1.20 | 45.56±0.80 | 45.99±1.20 | 35.59±1.10 | 63.75±1.30* | 52.40±0.70 | 42.08±0.70 | 33.63±1.10 | |
| Dimethyl sulfoxide | 93.93±1.10 | 82.09±1.70 | 63.36±0.70 | 66.51±0.80 | 95.76±1.40 | 72.43±0.30* | 69.58±0.50 | 55.83±1.50* | |
| Glycerin | 95.73±1.30 | 85.92±0.60 | 59.33±1.60 | 45.68±1.60 | 90.23±0.90 | 88.26±0.40 | 71.21±0.40* | 65.00±0.60* | |
| Q316P compared to WT at the same organic solvent and concentration; **means the difference is significant at the 0.01 level; *means the difference is significant at the 0.05 level; Results are means±SD of three parallel measurements. | |||||||||
表选项
3 讨论 本研究对北京棒杆菌天冬氨酸激酶中Q316位点进行定点突变，以达到解除抑制剂Thr对其的反馈抑制、提高酶活力并获得优良突变株的目的。通过软件Primer Premier 5进行突变引物设计，并以重组质粒pET-28a-AK为模板，成功构建突变体Q316P。将突变体Q316P成功在大肠杆菌BL21中表达，并由12% SDS-PAGE及Western blot得到验证。动力学结果显示，突变体Q316P的Vmax较野生型提高8.53倍，酶活力改善明显。并且突变后正协同性降低，可能不利于与抑制剂相结合。同时在底物抑制剂Thr存在时，对突变体Q316P表现出激活作用，表明突变后AK与抑制剂Thr结合的稳定性降低，这与动力学结果相符。
微生物在发酵过程中，由于本身代谢产热会导致环境温度升高，并随着目标产物氨基酸的积累，发酵液会趋于酸性。此外，在工业发酵生产中，热稳定性较高的酶具有较高的催化效率，可以降低微生物污染的风险。因此理想型突变株应耐高温、耐酸且具有稳定遗传性。本研究中对突变体Q316P酶学性质结果显示，与野生型相比最适温度升高5 ℃，最适pH降低0.5，半衰期延长至5 h，表明该突变株相比于野生型有较强适应能力，更有利于发酵生产。
综上所述，北京棒杆菌天冬氨酸激酶突变体Q316P能在大肠杆菌BL21中高效表达，并使酶活力提高，酶学性质改善，同时在抑制剂苏氨酸存在下，对其抑制作用有一定程度的解除，但由于酶的反馈抑制机制较为复杂，且本研究只针对Thr对北京棒杆菌天冬氨酸激酶的反馈抑制，所以对于整个天冬氨酸族氨基酸合成途径的反馈机制有待进一步探讨。由此，本研究为优化天冬氨酸激酶代谢途径以及天冬氨酸族氨基酸合成途径的调控系统提供参考，同时为构建高产天冬氨酸族氨基酸工程菌提供借鉴。
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