杨韦玲, 胡佳杰, 胡宝兰
浙江大学环境与资源学院环境生态研究所, 浙江 杭州 310058
收稿日期：2017-12-22；修回日期：2018-02-01；网络出版日期：2018-03-23
基金项目：国家自然科学基金（41773074，41641031，51478415）；哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室开放基金（QAK201714）；中央高校基本科研业务费专项资金（2017XZZX010-03）
*通信作者：胡宝兰, E-mail:blhu@zju.edu.cn
摘要：在氨氧化微生物的相关研究中经常使用各类抑制剂，包括针对硝化作用的抑制剂和针对微生物生长的抑制剂。自发现氨氧化古菌以来，人们在氨氧化细菌抑制剂的基础上重新筛选和使用不同的抑制剂来满足氨氧化微生物研究的需求。抑制剂既可以加速氨氧化古菌的富集，也可以帮助研究者区分古菌与细菌对硝化作用的贡献以及它们自身合成代谢能力的差别。本文综述了各类抑制剂的使用浓度和抑制效果，包括双氰胺（DCD）、3，4-二甲基吡啶磷酸盐（DMPP）、丙烯基硫脲（ATU）等传统抑制剂，乙炔和辛炔等炔烃类抑制剂，一氧化氮清除剂以及抗生素等对氨氧化微生物的活性和生长有特异性或通用抑制能力的抑制剂。通过对氨氧化微生物抑制剂的归纳总结，可为氨氧化微生物研究过程中抑制剂的选择提供参考。
关键词： 硝化抑制剂 氨氧化细菌 氨氧化古菌 DCD 乙炔 PTIO
Application of inhibitors in research of ammonia oxidizing microorganisms
Weiling Yang, Jiajie Hu, Baolan Hu
College of Environmental & Resource Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, Zhejiang Province, China
Received 22 December 2017; Revised 1 February 2018; Published online 23 March 2018
*Corresponding author: Hu Baolan, E-mail:blhu@zju.edu.cn
Supported by the National Natural Science Foundation of China (41773074, 41641031, 51478415), by the Open Project of State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment, by the Harbin Institute of Technology (QAK201714) and by the Fundamental Research Funds for the Central Universities (2017XZZX010-03)
Abstract: A variety of inhibitors are commonly used in related research on ammonia-oxidizing microorganisms, including inhibitors for nitrification and inhibitors against microbial growth. Since the discovery of ammonia-oxidizing archaea, researchers have re-screened different inhibitors to meet the needs of the study of ammonia oxidizing microorganisms. Inhibitors both accelerate the enrichment of archaea, and help researchers to distinguish between archaea and bacteria for their contribution to nitrification and their own anabolic potential. In this paper, the concentrations and inhibitory effects of various inhibitors were reviewed, including traditional inhibitors, like dicyandiamide, 3, 4-dimethylpyridine phosphate, and allylthiourea; alkyne inhibitors such as 1-octyne; nitric oxide scavengers and antibiotics. These inhibitors are specific or versatile in their ability to inhibit the activity and growth of ammonia-oxidizing microorganisms. By summarizing these inhibitors, we hope to provide a reference for the choice of inhibitor in the research of ammonia oxidizing microorganisms.
Keywords: nitrification inhibitors ammonia-oxidizing bacteria ammonia-oxidizing archaea dicyandiamide acetylene 2-phenyl-4, 4, 5, 5, -tetramethylimidazoline-1-oxyl 3-oxide
氨氧化反应指氨氧化微生物催化氨氧化成亚硝酸盐的反应，它是硝化反应的第一步，也是限速步骤。自1890年发现氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria，AOB)以来，人们普遍认为自然界的氨氧化反应都由AOB催化完成，直到2005年第一株氨氧化古菌Nitrosopumilus maritimus SCM1[1]的分离鉴定，氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea，AOA)才逐渐进入人们的视野。氨氧化微生物包括古菌和细菌，两者在自然界中具有不同的生态位分异[2-4]。在富集和分离AOA、探究AOA与AOB的生态位分异、研究氨氧化反应机理等方面常常会用到不同的抑制剂，例如乙炔、辛炔、链霉素等。
氨氧化微生物研究中涉及到的抑制剂种类很多，主要可以分为两大类：硝化作用抑制剂与生长抑制剂。硝化作用抑制剂指作用于反应过程的抑制剂，硝化作用抑制剂可以细分为传统硝化作用抑制剂、炔烃类抑制剂和一氧化氮清除剂。而生长抑制剂则是抑制菌体生长和蛋白合成的，如抑制细菌生长的抗生素。
1 硝化作用抑制剂 硝化作用是自然界氮循环的中间环节，连接固氮过程和反硝化过程。在微生物的作用下氨被氧化成亚硝酸盐，亚硝酸盐进一步被氧化为硝酸盐。硝化作用使铵态氮不断被氧化，造成了土壤中氮肥的大量流失，并且生成的硝酸盐和亚硝酸盐会导致水体污染。N2O是硝化作用的副产物，其温室效应是CO2的310倍，除此之外N2O还会对臭氧层造成极大的威胁[5]。因此，为了减少农业氮肥损失，提高氮肥利用率，降低环境污染，20世纪以来科学家们就针对硝化作用的抑制进行了大量研究。
虽然AOB与AOA都能将氨氧化成亚硝酸盐，但它们的代谢机理有所差异。在AOB的氨氧化路径中，氨先在氨单加氧酶(ammonia monooxygenase，AMO)的作用下氧化成羟胺，然后羟胺转移到细胞周质空间，由羟胺氧还酶(hydroxylamine oxidoreductase，HAO)氧化成亚硝酸。羟胺的氧化会释放4个电子，这4个电子由细胞色素c554转运给辅酶Q，随后2个电子传回氨单加氧酶，用于氨氧化反应的启动，另外2个电子沿着电子链继续转移[6]。虽然人们至今还没有搞清楚AOA的氨氧化途径，但目前提出的几种代谢机理与AOB都相差甚远：首先，AOA与AOB的AMO氨基酸序列相似度很低，只有40%左右[6]；其次，AOB中羟胺在HAO的作用下氧化成亚硝酸，但古菌中却并未找到编码HAO或其同系物的基因序列[7]；第三，细菌氨氧化反应的中间产物为羟胺，而对于古菌，除了羟胺之外，NO也是氨氧化反应中重要的中间产物[7-9]。
硝化作用抑制剂作用于反应过程中的酶或中间产物，从而阻断反应进行。由于古菌与细菌的氨氧化机理不完全相同，所以有同时抑制古菌和细菌的硝化作用抑制剂，也有能分别对古菌或细菌产生特异性抑制作用的抑制剂。
1.1 传统硝化作用抑制剂 20世纪人们都认为自然界中的氨氧化作用由AOB催化完成，因此传统硝化抑制剂的研究大多针对AOB。氨氧化过程中起关键作用的酶有AMO和HAO，AMO将氨氧化成羟胺，HAO将羟胺氧化成亚硝酸盐。羟胺的积累会对细胞产生毒性，因此一般不将HAO作为抑制剂的作用位点，而是以AMO为抑制剂的作用位点。AMO是结合在微生物细胞膜上的一种酶，它可催化的底物超过60种[10]，这些底物都能与AMO的活性位点结合并发生反应，从而对AMO氧化氨的过程产生竞争性或非竞争性的抑制。AMO以Cu作为其中心金属元素[11]，所以Cu的螯合剂也会显著抑制AMO的活性。根据抑制机理的不同，研究者们对传统硝化抑制剂作了以下分类[10, 12-13]。
(1) 底物抑制剂，作为底物与AMO结合并发生反应。这一类抑制剂包括竞争性抑制剂和非竞争性抑制剂。竞争性抑制剂即该底物直接作用在NH4+与AMO的结合位点上，如甲烷、乙烯和CO等；非竞争性抑制剂则是结合在AMO其他的位点上，如乙烷、丙烷、氯甲烷等。
(2) 金属螯合抑制剂，与AMO的中心金属元素Cu结合从而使AMO失活。例如，含硫脲基的化合物作为Cu的螯合剂可以抑制AMO活性，而添加Cu元素后被抑制的AMO活性会逐渐恢复[14]。这一类抑制剂在研究中较为常用，包括双氰胺(dicyandiamide，DCD)、3, 4-二甲基吡啶磷酸盐(3, 4-dimethylpyrazole phosphate，DMPP)、丙烯基硫脲(allylthiourea，ATU)等。
(3) 机理性抑制剂，该抑制剂被催化氧化后的产物具有高活性，并且能与AMO共价结合使之失活。机理性抑制作用需要氧气和酶的参与，这种抑制往往具有不可逆的特点，被机理性抑制剂抑制后，微生物氨氧化活性的恢复取决于胞内蛋白的生物合成[12]。
传统硝化抑制剂已在农业上广泛使用，以减少氮肥流失，关于这一点国内****也做过总结和归纳[15-16]，使用较多的主要有DCD、DMPP、ATU等。这几类抑制剂主要是通过对Cu的螯合作用来抑制AMO的活性。古菌与细菌的AMO酶具有相似性，且中心金属元素都为铜，所以传统硝化抑制剂对AOA也有一定的抑制作用，但抑制效果往往比其对AOB的抑制效果弱。近年的研究成果表明，传统硝化抑制剂主要用于探究原位土壤中氨氧化微生物的生理和生态特性，抑制强度和使用浓度如表 1所示。
表 1. 传统硝化抑制剂对AOA和AOB的抑制效果 Table 1. Strength of inhibition of traditional nitrification inhibitors on AOA and AOB
| Inhibitor | Concentration | AOA | AOB | Reference |
| DCD | 10 kg/hm2 | + | ++ | Di and Cameron, 2011 |
| 50 mg/kg | ++ | + | Zhang et al., 2012 | |
| 0–1500 μmol/L | + | ++ | Shen et al., 2013 | |
| DMPP | 10 kg/hm2 | + | ++ | Di and Cameron, 2011 |
| 1.94 kg/hm2 | – | ++ | Kleineidam et al., 2011 | |
| ATU | 100 μmol/L | + | ++ | Hatzenpichler et al., 2008 |
| 100 μmol/L | + | ++ | Taylor et al., 2010 | |
| 0.1–500 μmol/L | + | ++ | Shen et al., 2013 | |
| 20 μmol/L | – | ++ | Jung et al., 2014 | |
| 10 μmol/L | + | ++ | Sauder et al., 2017 | |
| ++ significant inhibition; + low inhibition; – no inhibition. | ||||
表选项
DCD是一种白色粉末，为常见的化工原料。研究表明200–300 mg/L的DCD就能完全抑制Nitrosomonas europaea的硝化活性[17]，8–10 mg/kg的DCD能有效抑制牧场土壤中Nitrosospira的生长和代谢[18]。DCD对AOB和AOA的抑制效果存在争议，在不同研究环境中差别较大。在中性和弱酸性的牧场草地中，氮含量较高，氨氧化作用由AOB主导，DCD能显著抑制AOB的生长和N2O的排放，但对AOA的抑制作用并不明显[19-22]。而在强酸性土壤中，DCD能完全抑制AOA的硝化活性，并且古菌的amoA基因丰度也逐渐降低，但DCD对细菌amoA基因丰度的影响不显著[4]，由此可以推断DCD对氨氧化微生物的抑制作用可能受环境pH的影响。
DMPP相对来说是一种比较新的硝化抑制剂，与DCD相比，DMPP具有效率高、用量少、没有生态毒性等优点[23]。DMPP与AMO结合后对AOB的生长以及氨氧化活性都会产生强烈的抑制作用，但对AOA的抑制作用却很小[20]，甚至没有[24]。而Florio等[25]的研究却表明DMPP对土壤中AOB和AOA氨单加氧酶的转录活性都有抑制作用。除了对氨氧化微生物的直接抑制作用外，近几年的研究也开始关注DMPP对N2和N2O排放量的影响，已有研究表明DMPP能有效减少牧场土壤中N2O和N2的排放[26]。
丙烯基硫脲(ATU)也是通过对Cu的螯合作用来抑制AMO的活性，100 μmol/L以内的ATU就能完全抑制AOB的活性[14, 27-28]，但同样浓度的ATU却不能完全抑制古菌Nitrososphaera gargensi [29]。Sauder等[30]在古菌Nitrosocosmicus exaquare的富集物中加入了10 μmol/L ATU，发现富集物的氨氧化活性并没有被抑制，说明低浓度的ATU对AOA的抑制作用较弱，利用这一特性可以使用低浓度的ATU作为AOB的特异性抑制剂。
Shen等[8]比较了DCD和ATU对氨氧化细菌Nitrosospira multiformis和氨氧化古菌Nitrososphaera viennensis EN76的抑制作用，结果发现DCD和ATU对细菌和古菌都有抑制作用，但是对古菌N. viennensis的抑制作用要弱得多，ATU对N. viennensis的半抑制浓度是N. multiformis的1000倍。
总的来说，传统硝化抑制剂对AOB的抑制作用强于AOA，尤其是低浓度的ATU对AOA几乎没有抑制作用，在试验中可以被用作AOB的特异性抑制剂。另外，关注传统硝化抑制剂对温室气体N2O排放量的影响也是目前的一个研究热点。
1.2 炔烃类抑制剂 炔烃类抑制剂对氨氧化微生物都有一定的抑制作用，不论碳链长短，所有炔烃几乎都能完全抑制细菌Nitrosomonas europaea的氨氧化代谢，碳链长度2–5的炔烃也能完全抑制古菌N. maritimus的氨氧化。其中，乙炔常被用作AOA和AOB的通用抑制剂。
在氨氧化微生物的研究中，乙炔的使用由来已久。1978年Hynes等[31]发现乙炔能抑制N. europaea 纯培物中氨氮的氧化，随后乙炔逐渐被用作土壤硝化作用的有效抑制剂[32]。乙炔是机理性抑制剂，它被氧化后会生成不饱和的环氧化合物，该环氧化物具有高活性，能与AMO共价结合，使AMO发生不可逆的失活，失活后氨氧化活性的恢复取决于新的氨单加氧酶的合成，也就是取决于氨氧化微生物的生物合成作用[12-13, 33]。低浓度的乙炔(≥1 Pa)就对N. europaea的氨氧化有100%的抑制效果。
当碳链长度超过6时，炔烃对古菌的抑制作用就逐渐减弱，尤其是辛炔，对AOB有很强的抑制作用，但对AOA的抑制作用很弱，甚至没有。实验证明浓度低于20 μmol/L的辛炔能特异性抑制氨氧化细菌N. europaea，对古菌N. maritimus的活性没有影响[34]。与N. maritimus相同，另外两株古菌N. viennensis和N. gargensis对碳链长度小于5的炔烃非常敏感，但是对碳链较长的炔烃却表现出很强的耐受性。在浓度低于20 μmol/L的辛炔的作用下，古菌N. viennensis和N. gargensis的活性都不会受影响[35]。
乙炔能同时抑制AOA和AOB的氨氧化活性，而20 μmol/L以下辛炔只能特异性抑制AOB，研究者们常利用这一特性来研究AOA和AOB的对硝化活性的相对贡献。Taylor等[36]用4 μmol/L辛炔区分AOA和AOB的硝化活性，以添加乙炔的悬浮土样作为对照组，分别得到了AOA和AOB硝化潜能随温度变化的关系，对比了AOA和AOB热力学特性的不同。Yang等[37]也用相同的方法，研究了AOA和AOB的硝化活性与氨氮浓度和温度的关系。Hink等[38]用辛炔区分AOA和AOB硝化活性以及产生的N2O的量，添加乙炔抑制全部的氨氧化活性作为对照，得出当氨含量与施肥量一致时，实验土样中氨氧化活性和N2O的产生都由AOB主导，在相同条件下AOA产生的N2O低于AOB。炔烃类抑制剂在试验研究中的应用如表 2所示。
表 2. 炔烃类抑制剂对AOA和AOB的抑制效果 Table 2. Strength of inhibition of alkyne inhibitors on AOA and AOB
| Inhibitor | Concentration | AOA | AOB | Reference |
| Acetylene | 8 μmol/L | ++ | ++ | Taylor et al., 2010 |
| 0.01% V/V | ++ | ++ | Lehtovirta-Morley et al., 2011 | |
| 0.01% V/V | ++ | ++ | Hink et al., 2016 | |
| 6 μmol/L | ++ | ++ | Sauder et al., 2017 | |
| 10 μmol/L | ++ | ++ | Taylor et al., 2017 | |
| 6 μmol/L | ++ | ++ | Yang et al., 2017 | |
| 1-Octyne | 20 μmol/L | – | ++ | Taylor et al., 2013 |
| 20 μmol/L | + | ++ | Taylor et al., 2015 | |
| 0.03% V/V | – | ++ | Hink et al., 2016 | |
| 8 μmol/L | – | ++ | Sauder et al., 2017 | |
| 4 μmol/L | – | ++ | Taylor et al., 2017 | |
| 4 μmol/L | – | ++ | Yang et al., 2017 | |
| ++ significant inhibition; + low inhibition; – no inhibition. | ||||
表选项
1.3 一氧化氮(NO)清除剂 PTIO (2-phenyl-4, 4, 5, 5, -tetramethylimidazoline- 1-oxyl 3-oxide)是一种一氧化氮清除剂，在医药研究领域使用广泛[39-40]，PTIO或者羧基PTIO (carboxy-PTIO)会跟NO发生反应，生成NO2–和PTIs，根据稳态NO浓度的不同，NO2–与PTIs浓度之比介于1到2之间[41]。
AOB的氨氧化代谢途径已经很清晰，但AOA的代谢途径还未完全探明。Walker等[42]曾提出AOA与AOB的氨氧化路径不同，并推测NO是AOA氨氧化过程的一种中间产物。因此，研究者们认为一氧化氮清除剂会对AOA的氨氧化过程产生抑制作用，但不会对AOB产生影响，众多的研究也证实了这一观点。Shen等[8]对比了多种硝化抑制剂对AOA (N. viennensis EN76)和AOB (N. multiformis)的作用效果，其中，只有羧基PTIO对AOA有很强的抑制作用，且不会对AOB产生影响。PTIO对古菌N. viennensis半抑制浓度为(18.3±5.2)μmol/L，完全抑制浓度为52 μmol/L，然而200 μmol/L的PTIO对AOB也没有任何抑制效果。Jung等[43]为了探究NO在AOA氨氧化过程中的作用，向培养基中添加了PTIO，结果发现在100 μmol/L PTIO的作用下，AOA的生长和活性被完全抑制。Martens等[9]的研究证实了2株海洋型AOA(SCM1和HCA1)的代谢过程会产生中间产物NO，并且SCM1和HCA1的氨氧化作用在添加100 μmol/L PTIO的条件下被完全抑制，而100 μmol/L的PTIO对AOB没有产生抑制作用。
PTIO对AOA的抑制效果显著，且不会影响AOB的代谢，因此在氨氧化微生物的相关研究中，PTIO常常被用作AOA的特异性抑制剂，用于区分环境样品或混合培养物中AOA、AOB对硝化作用的相对贡献。例如，Yan等[44]向混合培养物中添加了200 μmol/L PTIO用于特异性抑制海洋AOA N. maritimus，发现40%–60%的氨氧化反应是由N. maritimus催化的。PTIO在不同试验中的使用浓度和抑制效果如表 3所示。
表 3. PTIO对AOA和AOB的抑制效果 Table 3. Strength of inhibition of PTIO on AOA and AOB
| Concentration/ (μmol/L) | AOA | AOB | Reference |
| 200 | ++ | – | Yan et al., 2012 |
| 50 | ++ | – | Shen et al., 2013 |
| 100 | ++ | – | Jung et al., 2014 |
| 100 | ++ | – | Martens-Habbena et al., 2015 |
| 100 | ++ | – | Sauder et al., 2016 |
| 150 | ++ | – | Kozlowski et al., 2016 |
| 200, 400 | ++ | – | Sauder et al., 2017 |
| ++: significant inhibition; +: low inhibition; –: no inhibition. | |||
表选项
除了PTIO之外，其他几种NO清除剂也被证实对AOA有特异性抑制作用[45]。咖啡酸、姜黄素、亚甲基蓝和奎诺二甲基丙烯酸酯对AOA (N. maritimus)和AOB (N. europaea)的抑制作用不同，能在较低浓度下对AOA产生抑制作用，且抑制强度远远大于AOB。尤其是100 μmol/L的咖啡酸和3 μmol/L的亚甲基蓝，都能对AOA产生100%的抑制作用，与100 μmol/L PTIO的抑制作用相当。目前，一氧化氮清除剂是唯一一类可以特异性抑制AOA的抑制剂，在今后的研究中肯定会有更多的应用。
2 生长抑制剂 另一类常用的抑制剂为生长抑制剂，主要包括各类抗生素。通常情况下，对细菌有抑制作用的抗生素对古菌都没有影响，比如N. viennensis对链霉素、卡那霉素、羧苄青霉素和氨苄青霉素都不敏感[46]。氨氧化微生物研究中常用的抗生素包括链霉素、青霉素、卡那霉素、庆大霉素和奇霉素等。抗生素主要用于古菌的富集过程，例如在Nitrosotalea devanaterra的富集过程中，Lehtovirta等[47]在培养基中加入了50 mg/L链霉素用于抑制细菌的生长。并且她还使用同样的方法获得了Nitrosocosmicus franklandus的纯培物[48]。而在另一株氨氧化古菌N. viennensis的富集和分离过程中，Tourna等[46]使用链霉素、卡那霉素和氨苄青霉素作为常规添加剂，最终获得了2个富集物EN76和EN123。Chen等[49]在AOA的富集过程中使用了7种抗生素，形成7种不同的组合，结果发现同时使用链霉素、卡那霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素和四环素时效果最好，得到的AOA富集程度最高，达41.23%。Kozlowski等[7]在探究N. viennensis的氨氧化机理时也使用了羧苄青霉素来保证菌株的纯度。
除此之外，抗生素也能用于区分古菌与细菌的蛋白合成能力，例如在生理实验中，Taylor等[36]为了区分不同温度下AOA和AOB的生物合成潜能，使用了卡那霉素和壮观霉素来抑制细菌蛋白的合成。抗生素在氨氧化古菌的相关研究中使用十分普遍，对古菌的富集分离和生理探究都有重要的作用。
3 小结和展望 在氨氧化微生物的研究中，使用抑制剂是一种非常有效的研究手段，既可以加速氨氧化古菌的富集，也可以帮助我们区分古菌与细菌对硝化作用的贡献以及它们自身的合成代谢能力。在实验室的机理性研究中，乙炔、辛炔和PTIO常被用来区分AOA、AOB对硝化作用的贡献，而传统硝化抑制剂则主要用于农田土壤的原位研究。生长抑制剂主要是抗生素，在AOA的富集和分离等实验中，抗生素常被用来抑制细菌的生长，促进古菌富集，在AOA的机理性探究实验中，抗生素也用于维持古菌的高纯度。
N2O是一种重要的温室气体，而土壤中的硝化反应是产生N2O的重要源头。因此，近年来，传统硝化抑制剂在控制土壤N2O排放上的应用也受到了广泛关注。在牧场土壤中加入DCD或DMPP等硝化作用抑制剂后，氨氧化微生物，尤其是AOB被显著抑制，从而有效减少了牧场生态系统N2O气体的排放量[22]。但研究者们对AOA和AOB产生N2O气体的不同机制还所知甚少，抑制剂对N2O的抑制机理也尚未明晰。另外，研究者们普遍认为NO是AOA氨氧化反应的中间产物，AOB的氨氧化过程则只有羟胺作为中间产物，因此常常用一氧化氮清除剂PTIO来区分AOA和AOB对硝化作用的贡献，并且也取得了理想的实验结果。但Caranto等[50]却对此提出了挑战，他们的研究表明NO也是AOB氨氧化过程中不可或缺的中间产物，这与之前众多有关PTIO的试验结果相矛盾。AOA的代谢路径还有待探究，并且氨单加氧酶的具体化学结构也尚未有报道。很多抑制剂对AOA和AOB都有不同的作用效果，但具体原因，以及古菌和细菌氨单加氧酶的结构差异至今还没有科学的论断。因此，今后还需结合各种分子生物学的手段，在氨氧化反应机理及抑制剂作用机理方面进行深入探究。
除了AOA和AOB之外，全程硝化菌(complete ammonia oxidizing，comammox)也能好氧氧化铵态氮[51]，因此在不同的生境中comammox也会参与竞争，与AOA和AOB形成不同的生态位分异。目前，comammox的研究尚处于起步阶段，对其生理特性的研究主要依靠分子生物学手段，尚没有抑制剂能区分生境中的comammox与AOA、AOB，因此在这方面也需要投入更多的研究。
在农业上，要关注环境因素对抑制剂抑制效果的影响，因地制宜地选择合适的抑制剂，以减少氮肥流失和污染物质的生成。并且在研究现有抑制剂的同时，还需要开发新型高效的抑制剂以适应不同土壤、不同环境及实验室研究的需求。
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