王磊1, 程飞跃1,2, 赵大贺1,2, 杨海波1,2, 向华1,2
1.中国科学院微生物研究所, 微生物资源前期开发国家重点实验室, 北京 100101;
2.中国科学院大学, 北京 100049
收稿日期：2016-06-15；修回日期：2016-07-15；网络出版日期：2016-07-28
基金项目：国家自然科学基金青年项目（31301071）
*通信作者：向华,Tel/Fax:+86-10-64807472;E-mail:xiangh@im.ac.cn
摘要： [目的]通过转录组高通量测序技术（即RNA-seq），结合生物信息学分析和分子生物学方法，在组学水平鉴定极端嗜盐菌中可能的非编码RNA（ncRNA）。[方法]将培养至对数中期的地中海富盐菌在不同盐浓度下处理30分钟，提取RNA，进行链特异的转录组测序和5'端区分的转录组测序，通过生物信息学分析在全基因组范围内鉴定ncRNA，预测其转录边界；然后通过Northern blot和环化RNA反转录聚合酶链式反应（CR-RT-PCR）对部分预测的ncRNA进行实验验证。[结果]比较两种RNA-seq技术在不同培养条件下的RNA测序结果和对转录单元的精细分析，共鉴定到105个高可信度的ncRNA，并发现4个在不同盐度下表达差异较大的ncRNA，通过Northern blot和CR-RT-PCR验证了incRNA1436和incRNA1903的表达情况、转录本、转录起始位点及终止位点等。[结论]首次在组学水平鉴定了地中海富盐菌中的ncRNA，不同盐浓度刺激下部分ncRNA的转录差异暗示其有可能参与地中海富盐菌对盐胁迫的适应，高可信度ncRNA的组学发现为今后全面开展嗜盐古菌ncRNA的功能机制研究提供了基础数据及重要的切入点。
关键词： 地中海富盐菌 非编码RNA 盐度刺激 转录组测序
Identification of non-coding RNA in Haloferax mediterranei
Wang Lei1, Cheng Feiyue1,2, Zhao Dahe1,2, Yang Haibo1,2, Xiang Hua1,2
1.State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China;
2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Received 15 June 2016; Revised 15 July 2016; Published online 28 July 2016
*Corresponding author: Corresponding author. Tel/Fax: +86-10-64807472; E-mail:xiangh@im.ac.cn
Supported by the National Natural Science Foundation of China (31301071)
Abstract: [Objective] To identify non-coding RNAs in Haloferax mediterranei through high-throughput RNA sequencing, bioinformatics analysis and molecular techniques.[Methods] After H. mediterranei cells under log phase of growth were treated with different salt concentrations for 30 minutes, total RNA was extracted for the following strand-specific RNA sequencing and differential RNA sequencing. These RNA-seq data were used to identify the genome-wide ncRNAs and to predict the 5' and 3'-ends of the transcripts by bioinformatics analysis. A few selected ncRNAs were further confirmed by Northern blotting and Circularized RNA reverse transcription-PCR analysis.[Results] We identified 105 highly credible ncRNAs. Expression of four ncRNAs showed difference in different salt concentrations. We confirmed the expression, length of transcripts, transcription start and termination sites of incRNA1436 and incRNA1903 by Northern blotting and CR-RT-PCR.[Conclusion] We identified the ncRNAs of H. mediterranei in a genome-wide scale, including identification of a few ncRNAs involved in the responses of H. mediterranei to different salt concentrations. Our results have provided fundamental data and novel insights for future study of the function of ncRNA in haloarchaea.
Key words: Haloferax mediterranei non-coding RNA salinity stimulation RNA-sequencing
非编码RNA (non-coding RNA，ncRNA)是指生物体内各种不参与蛋白质编码的RNA。ncRNA在细菌、古菌和真核生物中均广泛存在，发挥着重要的生理功能[1-2]。目前在不同生物中进行ncRNA的系统发现仍然是极其重要的基础性工作。随着测序技术和生物信息学分析方法的进步，鉴定ncRNA的技术也在不断发展。以第二代高通量测序为基础的RNA-seq技术[3]大大促进了转录组复杂性研究，并为ncRNA的鉴定提供了新方法。其中链特异性RNA测序(strand-specific RNA sequencing，ssRNA-seq)技术[4]可将mRNA链的方向信息保存到测序文库中，测序后的数据分析可确定转录本是来自正义还是反义DNA链。与普通转录组测序相比，它更能准确地统计转录本的数量和确定基因的结构，同时可以发现更多的反义转录本，成为当前发现基因组范围内ncRNA的重要方法。dRNA-seq (differential RNA sequencing)技术[5-6]是一种能够区分初始转录本和加工过的转录本的新的RNA-seq技术。通过5′单磷酸依赖的外切酶(Terminator 5′-phosphate-dependent exonuclease，TEX)能够特异性的降解加工过的转录本，通过比较经TEX处理的加工转录本库和不经TEX处理的初始转录本库，可以在全基因组水平上对转录起始位点(TSS)、启动子区域、5′-UTR和操纵子的注释等方面进行更精确的研究。
古菌是一类与细菌和真核生物并列的重要生命类群，古菌具有基因组简单和遗传机器为真核类型等特点。但是与真核生物和细菌相比，古菌ncRNA的研究才刚刚起步，迄今为止只在有限的几株古菌开展了ncRNA的组学分析，包括闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)[7]、硫矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)[8]、詹氏甲烷球菌(Methanocaldococcus jannaschii)[9]、马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)[10]、强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)[11]和沃氏富盐菌(Haloferax volcanii)[12-13]等。其中在硫矿硫化叶菌的RNA-seq研究中，研究人员找到了310个ncRNA，包括 125个反式ncRNA和185个顺式ncRNA[8]；Heyer等[14]对沃氏富盐菌的RNA-seq分析研究发现了190个ncRNA，并鉴定到转录本中存在大量tRNA衍生片段，且这些tRNA衍生片段在不同生理条件下表达量存在较大差异。对古菌转录组的深度测序和相关初步研究表明，古菌ncRNA类型丰富，功能多样，既具有真核类型的small nucleolar RNA (snoRNA)参与核酸修饰[15]，又具有原核生物特有的CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) RNA参与抗病毒及基因组稳定性维持[16-17]，更多的ncRNA可能参与环境响应和基因表达调控。因此开展古菌ncRNA的系统研究，对于理解ncRNA的生理功能、分子机制以及相关机制的进化具有重要意义。
地中海富盐菌(Haloferax mediterranei)是极端嗜盐古菌的重要代表，相比其他古菌类群更容易培养和进行遗传操作，全基因组测序已经完成[18]，因此是研究古菌ncRNA的理想材料。ssRNA-seq可以区分来自基因组正义链或反义链上的reads，更加精确检测转录位置和方向；dRNA-seq则能够精确分辨初始转录本，在全基因组水平上鉴定转录起始位点。本研究通过综合利用ssRNA-seq和dRNA-seq技术，结合生物信息学分析鉴定了地中海富盐菌中ncRNA，并选取典型ncRNA，通过Northern blot和CR-RT-PCR(Circularized RNA reverse transcription-polymerase chain reaction)[19]对其验证。本工作为地中海富盐菌ncRNA功能机制的研究奠定了基础。
1 材料和方法 1.1 材料
1.1.1 菌株及培养条件： 本研究所用的极端嗜盐古菌为地中海富盐菌H. mediterraneiATCC33500，采用AS-168 培养基于37 °C、200 r/min的摇床培养[20]。其中NaCl 浓度根据需要分别调整至10%、15%和20%。分子克隆所用的菌株为E. coli JM109，采用LB培养基常规培养[21]。
1.1.2 主要试剂和仪器： 提取RNA的TRIzol试剂购自Invitrogen公司，T4 DNA 连接酶购自New England Biolabs，酵母抽提物(Yeast extract)为Oxoid原装，酸水解酪素(Casamino acids)为Difco原装，PCR反应中的TaqDNA聚合酶为上海生工产品，M-MLV反转录酶、pGEM-T Easy载体购自Promega，其他常见生化试剂全部购自北京化学试剂公司。RNA-seq相关试剂由相关测序公司提供。实验过程还用到低温高速离心机(Eppendorf Centrifuge 5810 R)，Nanodrop 1000分光光度计(Thermo Fisher Scientific)等仪器。 1.2 极端嗜盐古菌的盐刺激和总RNA的提取 将H. mediterranei在15% NaCl-AS-168培养基中培养至稳定前期的种子液，以4∶100 转接至100 mL相同培养基中扩大培养至对数后期(约 2 d)，分别取10 mL菌液加到40 mL新鲜的不同NaCl浓度的培养基中，使NaCl终浓度分别为10%、15%和20%，培养30 min，取5 mL菌体离心，收集菌体，用TRIzol试剂(Invitrogen 公司)提取总RNA。取1 μL RNA样品在Nanodrop 1000分光光度计上测定，OD260/OD280在2.0左右。
1.3 转录组测序 将上述不同盐浓度(各设3个重复)刺激下的RNA进行RNA-seq。其中ssRNA-seq具体实验流程为：使用Ribo Zero kit去除rRNA，将RNA打断为大约350 nt长度的片段，使用dUTP法进行链特异性建库[4]，然后采用Hiseq进行测序(在北京基因组研究所进行测序)。而dRNA-seq测序实验流程为：使用Ribo Zero kit来去除rRNA，然后进行TEX处理(去除5′单磷酸mRNA)和TAP处理(将5′三磷酸mRNA处理为5′单磷酸mRNA)，连接5′末端接头，反转录合成cDNA第一链，PCR富集，使用Hiseq2000测序仪进行测序(由诺和致源生物信息科技有限公司完成)。
1.4 转录组数据处理 对于得到的ssRNA-seq原始数据，首先去除5′和3′接头序列，如果剩余序列长度小于原来长度的1/3，则去除；去除N(N表示无法确定碱基信息)的比例大于10%的序列；去除低质量序列(质量值Q≤5的碱基数占整个读数的50%以上)，获得clean reads。然后去掉重复序列，获得唯一序列。最后用Bowtie2[22]将唯一序列映射至参考基因组。对于dRNA-seq原始读取序列，处理方法同上，用Bowtie2将clean reads映射至参考基因组。
1.5 转录边界预测[23] 基于ssRNA-seq数据，首先通过Rockhopper软件[24]来初步预测基因组中存在的操纵子(同向表达基因如果距离<40 bp，就默认为是一个操纵子)。然后根据reads分布，来确定转录单元的转录起始位点(transcription start site，TSS)(我们把起始密码子上游100 bp内reads数变化最大的位置预测为TSS)和转录终止位点(transcription terminationsite，TTS)(终止密码子向下延伸，reads数大幅下降处为转录终止位点；表达量低于终止密码子处reads数1/3或者reads数<3，也认为其为终止位点)。获得TSS和TTS位置信息后，编写脚本寻找先前转录单元之间是否存在通读现象，确定最后转录单元。
1.6 ncRNA的预测 基于先前预测转录单元，首先寻找反义ncRNA：寻找每个转录单元负链上reads数最高的点位，确定其TSS和TTS。然后以同样的方法寻找基因间区ncRNA。
1.7 Northern blot验证 选取部分预测的ncRNA，用Northern blot进行验证，本实验中所用的探针见表 1。实验流程如下：将RNA样品进行聚丙烯酰胺变性胶电泳，移至半干胶转膜仪(Trans-Blot SD Cell，Bio-Rad)以12 V/100 cm2恒压转膜45 min，紫外照射使RNA与膜交联，将尼龙膜装入杂交瓶，按20 mL/100 cm2的比例加入预杂交液，52 °C预杂交2 h。弃去预杂交液，加入杂交液和2 μL标记的探针引物 (10 μmol/L)。52 °C杂交16 h，之后进行洗膜。洗膜结束后，进行化学发光法显色，在暗室中压片、显影。
表 1. 本文中使用的引物 Table 1. The primers used in this study
| Primers | Sequences (5'→3') |
| Northern blot a | |
| incRNA1903-probe | ATCGGGCACGGGAACTGGGC |
| incRNA1436-probe | GACGAGTGACCCGGGCAGGTCACTG |
| CR-RT-PCR | |
| incRNA1903-F | GGAACGGCGAATCCTCAC |
| incRNA1903-R | CTCCCCTTACGGGTCGGT |
| incRNA1436-F | CGTGTCCCTGCCCAAACC |
| incRNA1436-R | GGGTTTGGGCAGGGACAC |
| 7S RNA-F | CGGTTCATCGGTGGTAC |
| 16S RNA-R | GCATGACTCCCGTATGAA |
| a: 5′-end are labeled with biotin. | |
表选项
1.8 环化RNA反转录聚合酶链式反应(CR-RT- PCR) 选取incRNA1903和incRNA1436进行CR-RT-PCR实验以测定其精确的转录起始位点(TSS)和终止位点(TTS)[25]。方法如下：取 5-10 μg RNA样品65 °C水浴10 min变性，立即冰浴2 min。然后进行环化，环化体系如下：RNA5-10μg、10×T4RNA连接酶缓冲液2.5μL、T4RNA连接酶2μL、RNase抑制剂0.5μL、DEPC水10μL；37°C水浴1h。用DEPC水调节反应体系至500μL，加入200μL中酚-氯仿，充分混匀，12000r/min、4°C离心10min，弃上清，用70%乙醇洗涤2次，加入15μLDEPC水溶解。向已环化的RNA中加入1μL反转录引物(1μmol/L)，65°C变性10min，立即置于冰上2min。按以下体系添加：RNase抑制剂0.5μL、5×RT缓冲液8μL、dNTPs(10mmol/L)1μL、DEPC水13.5μL，在42°C水浴预热2min后，加入1μLM-MLV反转录酶。42°C继续水浴1h，然后75°C水浴15min。取2μL上述反转录产物为模板，用位于基因编码区域内部且靠近两端的一对反向引物进行PCR扩增。
本实验中所用的PCR扩增引物见表 1。常规的PCR反应体系(25 μL)如下：模板1μL、10×Taq缓冲液2.5μL、dNTPs(2mmol/L)2.5μL、Taq聚合酶0.3μL、正向引物(10μmol/L)1μL、反向引物(10μmol/L)1μL、ddH2O16.7μL；反应程序如下：95°C5min；95°C30s，54°C30s，72°C45s，40个循环；72°C10min。
对于incRNA1436，由于预测转录本大小只有124nt，并不利于环化自连，故将其分别和7SRNA与16SRNA连接然后进行PCR扩增。将得到的PCR产物与pGEM-TEasy载体连接，转化E.coliJM109，挑取单克隆测序，鉴定发生衔接的位点，从而确定5′和3′末端。
2 结果和分析 2.1 高可信度ncRNA的鉴定 通过对ssRNA-seq结果的分析，在10%、15%和20% NaCl盐浓度刺激的条件下，映射至基因组上的读数分别为1149872、1041661和1088969。通过对dRNA-seq结果的分析，映射至基因组上的读数为11100543。
基于ssRNA-seq数据，我们首先找到反义链上表达量最高的点，然后寻找其转录起始位点TSS和转录终止位点TTS，最终发现350个反义ncRNA (asRNA)，其中TSS位置与dRNA-seq数据完全吻合的ncRNA个数为44个(作为高可信度ncRNA)。采用类似鉴定反义ncRNA的方法，我们最终发现216个基因间区ncRNA (incRNA)，其中TSS位置与dRNA-seq数据完全吻合的基因间区ncRNA个数为61个(为高可信度ncRNA)。因此共获得高可信度ncRNA共计105条。
2.2 嗜盐古菌ncRNA的特点分析 统计发现，我们鉴定到的这105个高可信度的ncRNA (ssRNA-seq数据与dRNA-seq数据同时支持)，其中81个ncRNA长度位于100-299 nt这个范围内(图 1)，占77.14%。100-299 nt范围内，asRNA有32个，占所预测asRNA的72.73%；incRNA有49个，占所预测incRNA的80.33%。
 |
| 图 1. ncRNA长度分布 Figure 1. Length distribution of ncRNA in the Haloferaxmediterranei. |
| 图选项 |
计算RPKM(Reads Per kilobase of transcript per million mapped reads)值，比较样品间的基因表达差异[26](表 2)。对105个ncRNA在不同盐浓度条件下的表达差异(以RPKM值为参考)分析发现，RPKM值差异超过2倍的ncRNA有45个，其中RPKM值差异超过5倍的有4个，全部都是incRNA (表 2)。
表 2. 表达差异5倍以上的ncRNA Table 2. The ncRNA with expression level more than five times (at least between 2 treatments)
| ncRNA | RPKM(10% NaCl) | RPKM(15% NaCl) | RPKM(20% NaCl) |
| incRNA0723 | 8.735249 | 11.86299 | 74.1222 |
| incRNA1436 | 34.85254 | 231.4789 | 86.45368 |
| incRNA2271 | 27.16288 | 157.687 | 32.7739 |
| incRNA6338 | 1.145029 | 2.073311 | 8.9866 |
表选项
2.3 Northern blot分析 选择表达量最高的incRNA1903和表达差异 5倍以上的incRNA1436，对基于RNA-seq预测的结果，进行Northern blot杂交实验验证。结果显示(图 2)，incRNA1903和incRNA1436均有表达。incRNA1903测序预测的大小是417 nt，图中显示的约是450 nt，与预测的结果基本相符。有趣的是，结果显示incRNA1436有两个信号带，表明可能有两个转录本。其中，较大的转录本的大小约是120 nt，与预测的124 nt大小相似，小转录本约是90 nt。总体说明RNA-seq发现的ncRNA真实存在。
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| 图 2. Northern blot验证incRNA1436和incRNA1903的表达 Figure 2. Northern analysis of incRNA1436 and incRNA1903. |
| 图选项 |
进一步，我们选取了在不同盐浓度刺激下的incRNA1436进行Northern blot验证(图 3)。在15% NaCl培养基中培养的地中海富盐菌经低盐(10%NaCl)和高盐(20% NaCl)环境刺激30 min后提取RNA。结果显示，在15% NaCl培养基中生长的菌体，incRNA1436的大、小2个转录本表达量较高，当在低盐(10% NaCl)和高盐(20% NaCl)刺激后，大、小转录本的表达量均下降，而大转录本表达量的下降尤为明显，这与RNA-seq观察到该ncRNA在15% NaCl条件下表达量最高的结果一致，说明该ncRNA表达确实受盐度变化的诱导(图 3为3次重复的代表性结果)，初步验证了基于RNA-seq的结果鉴定ncRNA和分析其表达量的可信性。而其大、小2个转录本的加工机制及如何参与调控地中海富盐菌对盐胁迫的应答过程则有待进一步的研究。
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| 图 3. 不同盐浓度刺激下incRNA1436的Northern实验结果 Figure 3. Northern blot analysis of incRNA1436 under the stimulation of different salt concentration. Loading equal RNA,duplicating 3 times. |
| 图选项 |
2.4 采用CR-RT-PCR分析进一步测定ncRNA的起始与终止位点 将CR-RT-PCR实验单克隆测序结果与基因组序列比对，可得到incRNA1903转录本的TSS为图中+1处的A碱基(图 4-A)，比RNA-seq预测的转录本在5′端长13 nt；3′末端为图中449位处的T，比RNA-seq预测的转录本在3′端长19 nt。而对incRNA1436转录本进行序列比对发现有2个转录本存在，大转录本的TSS为图中+1处的G (图 4-B)，与RNA-seq预测的转录本的TSS是一致的；另一个小转录本TSS为图中30位处的C，这两个转录本的3′末端均为图中123位处的C，比RNA-seq预测的转录本在3′端处少1 nt。CR-RT-PCR与Northern blot实验关于incRNA1436有2个转录本的结果是一致的。本实验再次表明，RNA-seq系统发现的ncRNA真实存在，但其精确的5′端和3′端、以及可能的加工信息等，可能还需通过更加精确的遗传与分子生物学方法进行校准。
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| 图 4. CR-RT-PCR测定转录起始位点与终止位点 Figure 4. Sequence of the transcripts of incRNA1903 and incRNA1436. |
| 图选项 |
3 讨论 相对于细菌和真核生物，古菌ncRNA的研究比较薄弱，而嗜盐古菌ncRNA的鉴定及研究更是甚少。本研究首次通过RNA-seq技术在地中海富盐菌中进行高通量转录组测序分析，鉴定其基因组范围内的ncRNA。本文中综合采用了ssRNA-seq和dRNA-seq的测序结果进行分析，并使用去重复后的reads进行后续的分析，充分保证了分析结果的可信度。
通常ncRNA相比mRNA长度较短，因而较难被鉴定，dRNA-seq可在全基因组水平上鉴定转录本，极大地促进了ncRNA的研究。dRNA-seq在古菌ncRNA的研究中也是一个重要的技术手段，Jager等[10]首次用dRNA-seq对在不同含氮条件下马氏甲烷八叠球菌进行氮素响应的转录组测序研究分析，在全基因组水平上鉴定了876个TSS，不仅发现马氏甲烷八叠球菌含有多个可能的ncRNA，而且证实了多个ncRNA可在氮胁迫环境下特异表达，调控马氏甲烷八叠球菌快速适应底物转换。在本研究中，我们基于两种不同的RNA-seq技术测序分析，在地中海富盐菌中鉴定到高度可信的ncRNA转录本105个。值得我们注意的是，在这105个高可信的ncRNA中，仅在盐度刺激下表达差异(以RPKM值为参考)超过2倍的ncRNA则有45个，推测ncRNA可能参与了极端嗜盐古菌对盐刺激的响应、信号传递或适应。而这些高可信度ncRNA的发现，还将为研究ncRNA在其它生理条件下的功能机制奠定基础。
在鉴定到的105个高可信度的ncRNA中，选取了表达差异超过5倍的incRNA1436和表达量高的incRNA1903进行Northern Blot实验，结果显示了这两个ncRNA基因的转录本的真实存在；且在不同盐浓度刺激下incRNA1436的表达量存在较大差异，都与我们RNA-seq分析的结果一致，表明基于RNA-seq的结果鉴定的ncRNA是可信的，通过生物信息学分析可以有效地发现ncRNA存在与否。但是，CR-RT-PCR结果表明RNA-seq预测的ncRNA转录本边界与CR-RT-PCR实验得到的转录本边界可能会出现小的差异。比如，Northern Blot和CR-RT-PCR实验证明incRNA1436存在两个转录本，其中较大转录本的TSS与RNA-seq结果相同，而小转录本并没有通过RNA-seq鉴定出来。其主要原因可能是程序设计时默认5′远端的转录起点为唯一转录起点，因此通过Northern blot和CR-RT-PCR实验对相关ncRNA进行进一步分析，对于发现其加工与适应机制是非常必要的。
ncRNA虽然不编码蛋白质产物，但是在生物体内同样发挥着重要的生理功能，如incRNA1436在不同盐浓度刺激下存在较大的差异表达，可能参与地中海富盐菌对盐刺激的响应、信号传递和适应。而ncRNA在极端嗜盐古菌的遗传和生理代谢方面的功能将是我们下一阶段研究的重点部分。本研究通过高通量测序为基础的RNA-seq技术，结合生物信息学方法对地中海富盐菌ncRNA的系统鉴定，为今后嗜盐古菌ncRNA对功能机制的研究奠定了坚实的基础。
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