刘晓琳1,2, 刘卫1, 解志红1
1.中国科学院烟台海岸带研究所, 山东 烟台 264003;
2.中国科学院大学, 北京 100049
收稿日期：2016-05-02；修回日期：2016-06-24；网络出版日期：2016-07-19
基金项目：中科院重点部署项目（KZZD-EW-14）；烟台市科技发展计划（2013JH021）；中科院****；国家自然科学基金（31370108，31570063）；山东省自主创新及成果转化专项（2014ZZCX07303）
*通信作者：解志红, Tel:+86-535-2109183;Fax:+86-535-2109000;E-mail:zhxie@yic.ac.cn
摘要： 细菌通过趋化系统获得在复杂环境中的生存优势。趋化性在细菌致病性、病菌定殖、固氮细菌与宿主共生、植物与微生物互作等方面有重要的作用。作为趋化信号适应中不可或缺的调节蛋白，对CheZ的深入研究具有重要意义。本文主要对CheZ的结构、作用机制、功能调节、蛋白定位以及进化地位等方面的研究现状进行了综述，旨在为其它细菌中趋化系统的研究提供有益参考。
关键词： 趋化系统 磷酸酯酶 CheZ 蛋白定位
Advances in phosphatase CheZ of bacterial chemotaxis signaling pathway
Xiaolin Liu1,2, Wei Liu1, Zhihong Xie1
1.Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, Shandong Province, China;
2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Received 02 May 2016; Revised 24 June 2016; Published online 19 July 2016
*Corresponding author: Xie Zhihong, Tel:+86-535-2109183;Fax:+86-535-2109000;E-mail:zhxie@yic.ac.cn
Supported by the Key Research Program of the Chinese Academy of Sciences (KZZD-EW-14), by the Yantai Science and Technology Project (2013JH021), by the One Hundred-Talent Plan of Chinese Academy of Sciences, by the National Natural Science Foundation of China (31370108, 31570063), and by the Shandong Independent Innovation and Achievement Transformation Program (2014ZZCX07303)
Abstract: Bacteria get a survival advantages in the complex environment through the chemotaxis system.Chemotaxis plays an important role in colonization and pathogenicity of bacteria, the legume-rhizobia symbiosis, and plant-microbe interactions.Phosphatase CheZ is an indispensable regulatory protein in the process of chemotactic signal adaptation.This review focused on the structure, mechanism of action, functional regulation, protein targeting and the status of the evolutionary of CheZ.This work can benefit the study of other bacterial chemotaxis systems.
Key words: chemotaxis system phosphatase CheZ protein targeting
细菌通过运动回应外界的化学物质刺激，这个过程称为趋化。趋化的运动依靠鞭毛的顺时针和逆时针旋转来实现。鞭毛顺时针旋转使细菌随机改变运动方向，称为翻转；鞭毛逆时针旋转使细菌直线运动，称为泳动。当细菌感应到高排斥物浓度时，细菌通过翻转频率增加改变自身运动方向，不断远离。反之，当细菌感受到高吸引物浓度时，鞭毛顺时针旋转被抑制，逆时针旋转被加强，细菌不断向前运动[1-2]。细菌的趋化实际上是一种趋利避害的过程[3-4]。
将外界物质浓度梯度信号转化为细菌自身的行为变化是一个信号转导的过程。大肠杆菌仅含有一套趋化系统[5]，主要是通过趋化双组分调节系统使得细菌能够感受外界的环境变化，并通过改变自身运动状态获得有利的营养资源或者是有利的生存条件[6]。组氨酸蛋白激酶CheA与跨膜的甲基化受体趋化蛋白MCP的胞质部分相连，并且CheA的His48残基的自磷酸化的频率受到MCP受体的胞外连接位点是否被吸引物或排斥物分子占据来调节。当MCP的胞外连接位点被排斥物占据时，CheA激酶自磷酸化的抑制解除[7]。磷酸化的CheA之后将磷酸基团转移到能够自由扩散的调节蛋白CheY的Asp57残基上。磷酸化的CheY (CheY-P)与鞭毛马达开关蛋白结合，从而诱发鞭毛进行顺时针的翻转导致细菌的运动方向改变[8-9] (图 1)。
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| 图 1. 大肠杆菌趋化信号通路 Figure 1. The chemotaxis signaling pathway in Escherichia coli. |
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将CheY-P去磷酸化才可以使趋化系统恢复初始状态，从而使细菌重新获得回应外界刺激的能力[10]。为了快速的适应外界环境，趋化系统中的CheY-P能够进行自我去磷酸化，半寿期只有不足1 min，但这对于快速变化的外界环境而言还是太慢了[11]，因此需要其它的磷酸酯酶蛋白调节CheY-P的浓度快速下降[12]。CheZ是大肠杆菌趋化通路中唯一起磷酸酯酶作用的蛋白，是最早发现的趋化通路磷酸酯酶，并且被广泛和深入研究。
目前实验中验证的CheZ蛋白主要存在于β-和γ-变形菌中[12]，在α和ε-变形菌中也有发现，另外在δ变形菌中也可能存在CheZ蛋白。CheZ在趋化过程当中起着重要的调节作用，无论CheZ磷酸酯酶酶活过高或过低，都会导致细菌的趋化能力受损[13]。本文综述了CheZ蛋白的结构、功能及调控机制等。
1 CheZ蛋白的结构 以大肠杆菌为例，CheZ蛋白是由总长为214个氨基酸残基组成的二聚体。四螺旋束结构是CheZ蛋白的主体部分[14]。每个单体的N端残基1-34构成螺旋结构，并直接与四螺旋束相连[15]。35-168氨基酸残基形成一个两亲性的螺旋，在残基100-104处构成一个发夹回环，并且CheZ是以“头对头”的方式组装为一个长形的四螺旋束[14]。二聚体内的作用面是相当稳定的，因为在四螺旋束内有许多链间和链内相互作用，包括在疏水作用面上有33对残基和26个氢键。而在C端，残基199-214构成极端螺旋结构[14]，C端螺旋通过一个由32个残基组成的高度灵活的连接器拴在四螺旋束上[15]。
早期通过肠杆菌中CheZ序列比对发现，CheZ蛋白具有3个高度保守的区域，分别是：残基50-62，138-148和202-214三部分[16]。残基50-62位于N端部分。该部分区域的氨基酸替换突变多为功能获得性突变[6, 17-18]，点替换其中氨基酸，如Asp50、Arg54等，磷酸酯酶活性提高。一般认为，N端的折叠对CheZ的活性区域有阻碍作用。残基138-148区域为CheZ的催化活性部位。经过序列比对，发现在5个变形菌纲中CheZ的N端部分保守性较低，而活性中心的Gln147 (甚至-DXXXQ-基序)是保守的(图 2)。有研究发现该区域内氨基酸突变可能是通过影响CheZ寡聚化，从而导致磷酸酯酶活性降低[19]。残基202-214位于C端部分，是与CheY-P结合的主要部位[16]。CheZ的C端部分具有高度的机动性。就像是伸于CheZ外侧高度动态的机械臂，可能起提高与CheY-P碰撞几率，以增强CheZ与CheY-P之间相互作用的功能[20]。此外，在残基95-98处有一段保守基序D (D/E) WF，是CheZ与CheAS相互作用的部位，但该基序仅在肠杆菌中较为保守[21-22](图 2)。
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| 图 2. 变形菌门CheZ序列比对图(序列数据来源于NCBI数据库，细菌名称后缀为GI号) Figure 2. Sequence alignment of phosphatase CheZ from proteobacteria. Conserved amino acid residues are highlighted by grey colors. The conserved motif of activity is marked at the bottom of the figure. The amino acid residues that may interact with CheA in gamma-proteobateria are framed. |
| 图选项 |
2 CheZ蛋白的作用机制 在大肠杆菌中，趋化系统中的磷酸酯酶CheZ促进CheY-P去磷酸化。1个CheZ二聚体有2个催化活性位点，可以与2个CheY-P相互作用。每1个CheY-P先后通过2个不同的相互作用面与CheZ结合。这2个作用面分别是CheZC和CheZcore[14]。CheZC是CheZ的C端短肽，而CheZcore是CheZ的催化活性部位。首先，CheY-P与CheZ的1个C端结合。在无CheY-P时，CheZ的C端高度灵活移动，起到类似于机械臂的作用[20]。CheZC具有高度运动性，这一特点有效地增加了其与CheY-P作用的半径[20]，能够有效增加其与CheY-P碰撞的几率。所以CheY-P与CheZC具有相当高的亲和力(Kd=26 μmol/L)[23]，当CheY-P存在时，二者可以快速结合[24]。随后，CheY-P与CheZ活性位点处结合。CheY-P与CheZC的结合一方面使CheY-P接近CheZcore四螺旋束部分，另一方面提高了活性位点附近的CheY-P浓度[17]。两方面的影响都增加了四螺旋束与CheY活性位点作用的可能[20]。但是，第1个CheY-P与第1个CheZ活性位点结合，会导致与之相对的位于CheZ四螺旋束对面的第2个活性位点的构象改变，使得第2个CheY-P与CheZ活性位点结合的限速作用解除，所以第2个CheY-P与CheZ活性位点的作用变得高效[15]。而CheZ蛋白与CheY-P之间的协同效应正是由活性位点的这种特性所决定的[15]。
CheZ活性位点处具体的反应机制在大肠杆菌CheZ-CheY-BeF3-Mg2+共结晶体中得到阐明[17]。CheZ的活性位点催化保守基序中，位于催化表面的Asp143和Gln147插进CheY的活性位点中。Asp143与CheY活性位点处的Lys109形成盐桥，且Gln147定向至BeF3-基团。Gln147的酰胺氮处于合适的位置能够与1个水分子形成氢键，且水分子能够在线攻击磷原子[17]。CheZ的作用是提供了一个额外的功能基团促进在CheY中已有的自我去磷酸化反应机制。通过定位在在线攻击中起作用的水分子以合适构象，使CheY-P的去磷酸化更加有效[14]。这种作用使得CheZ将CheY-P的自我去磷酸化的速率提高了100倍[24]。此外，CheZ依赖的CheY-P去磷酸化作用还必须要有二价镁离子的存在。
3 CheZ活性的调节 CheZ的活性调节方式主要有2种。第1种是CheZ的活性受到CheY-P浓度的调节。CheZ与CheY-P之间的作用呈现明显的正协同效应[24]。当CheY-P的浓度低时，CheZ的活性受到抑制，从而可以使细胞内的CheY-P积累到一定量的水平[15]。反之，当细胞内CheY-P浓度很高时，CheZ的磷酸酯酶活性也达到较高水平，使细胞内CheY-P的浓度很快降下来，从而使细菌获得重新对外界信号做出反应的能力，但CheZ磷酸酯酶活性的变化滞后于CheY-P浓度的变化[22]。CheZ的活化与去活化都存在迟滞，延迟时间虽然短但是使细菌能够有时间将胞外的刺激有效地转变为胞内的CheY-P浓度变化。
第2种是CheZ的活性受到组氨酸激酶CheAS的调节。cheA基因通过基因内串联翻译起始位点编码2种多肽：CheAL和CheAS[25]。CheAL不能与CheZ相互作用；CheAS的P1域缺失97个氨基酸残基，其不能使CheY磷酸化，但可与CheZ结合并促进CheZ磷酸酯酶活性[26]。CheAS通过对CheZ寡聚体发起亲核攻击使CheZ从胞质结合到受体复合簇上[27]。CheZ主要以氨基酸残基95-98之间的基序[D (D/E) WF]与CheAS的F98相互作用[21]。从结构上看，CheAS是与CheZ的螺旋发夹末端处结合[28]。CheAS与CheZ的结合使CheZ的磷酸酯酶活性提高2-3倍。CheAS促进CheZ酶活力上升的原因主要是CheAS与CheZ的螺旋发夹末端连接引起CheZ结构变化，并通过四螺旋束将变化传递到CheZ的活性中心，解除了四螺旋束对活性中心的抑制，从而提高CheZ的磷酸酯酶活性[15]。对CheZ调节的方式也可能是通过CheAL/CheAS之间的比例变化来进行调节[29]。研究发现，CheAS约占细胞内CheA总量的三分之一[30]。CheAL既可以形成CheAL/CheAL同源二聚体，也可以形成CheAL/CheAS异源二聚体[31-32]。此外，也可能存在通过CheAS氧化还原的变化调节CheZ的机制。CheAS的P1域上的Cys存在氧化态和还原态，而氧化态的CheAS则不能与CheZ相互作用[33]。
4 CheZ的细胞内亚定位及其意义 在大肠杆菌中，CheZ是趋化系统中的附属胞质蛋白，既有多数以游离的状态散布于细胞质中，也有部分与受体复合簇结合定位于细胞极端[34-35]。在不同条件下，结合到膜受体复合簇上的CheZ蛋白只占CheZ蛋白总量的一小部分[36]，不会随着吸引物的增加而变化[37]。CheZ主要通过与CheAS作用结合到受体复合簇上[21]。
CheZ定位于细胞极端的受体复合簇具有多重意义。(1)这种定位可以防止细菌胞内形成CheY-P浓度梯度影响有效趋化[38-40]。当通过基因敲除缺失CheZ时，细菌会在胞内形成一定的CheY-P浓度梯度。以受体复合簇处的CheY-P浓度最高，随着与受体复合簇距离的增加而下降[37]，导致细菌不能有效趋化[41-42]。只有当CheZ存在时，胞内CheY-P浓度较为均一。这时细菌所有的鞭毛复合体获得一样的信号，以同样的方向进行旋转，从而有效趋向吸引物。这对于像大肠杆菌这种具有周质鞭毛的细菌尤为重要[39]。(2) CheZ定位于受体复合簇，能够增加对外界信号的敏感度[37]。尽管CheZ在对外界的信号获取过程中不起作用[43]，但是CheZ在趋化通路信号放大过程中起着重要作用。通过替换突变构建CheZ定位能力缺失菌株进行实验，发现能够正常定位于受体复合簇的CheZ可以使细菌更加敏捷地对外界刺激做出回应[37, 44]。并且，即便将趋化适应蛋白CheB/CheR敲除后，细菌通过CheA/CheZ共定位依然能够对外界刺激敏锐地做出反应[37]。(3)显著提高CheZ蛋白的酶促活性。CheZ亚细胞定位于极端，与受体复合簇结合，一方面增加了CheZ与CheY-P相互作用的几率[37]，另一方面与CheA的作用提高了CheZ的催化活性。CheA与CheZ的结合导致CheZ的N端构象变化，并通过四螺旋束将这一变化传递到活性中心，从而提高了CheZ的催化活性。两方面的作用使极端的磷酸酯酶活性显著提高。(4)促进了CheA与CheY之间的磷酸转移反应。在没有外界物质刺激时，仍然有部分CheZ定位在受体复合簇上。这种定位促进CheA与CheY之间的磷酸转移反应[37]。研究发现，CheZ与CheY-P之间的相互作用分布在整个细胞中，并且总的磷酸转移速率处于稳定状态。而在受体复合簇处的CheZ催化活性提高，趋化信号的传导速度加快，从而提高了CheA与CheY之间的磷酸转移速率[37]。推测这对细菌受到外界吸引物刺激时，快速提高胞内CheY-P浓度有一定意义。(5)使反应限定在一定区域，提高反应效率。在大肠杆菌等细菌中，CheZ与CheY-P的反应虽然没有被细胞器单独分隔开，但是可以通过蛋白定位于细胞膜的特定部位，从而在一定程度上实现类似于真核细胞器分隔反应的作用[38]。
大肠杆菌CheZ蛋白依赖于CheA (s)和趋化受体蛋白进行定位[21, 34]。而在幽门螺旋杆菌中，CheZ蛋白的定位既不依赖CheA也不依靠鞭毛马达蛋白，而是依赖于只在ε-变形菌中才存在的ChePep蛋白，CheZ蛋白在ChePep的协助下定位于极端[39]。
5 CheZ蛋白在进化中的意义 CheZ存在于α、β、γ、δ和ε-变形菌纲中(图 3)。将不同变形菌纲中的CheZ蛋白进行多序列比对，结果显示从进化角度上CheZ分为4类，其中γ和β-变形菌的CheZ亲缘关系更近。但是从CheZ的结构域特点上看，可以将CheZ大致分为3类：第1类是以大肠杆菌为代表的存在于β和γ-变形菌中经典的CheZ。这类CheZ蛋白能够与2个CheY-P进行作用[17]，同时也能够与CheA进行作用。第2类存在于α和δ-变形菌中，尽管它们位于不同的进化支中，但是其CheZ在结构域上非常相似。它们的CheZ完全缺乏CheA结合区，暗示这类CheZ蛋白不能与CheA进行结合，但是目前还没有实验证实。第3类CheZ分布于ε-变形菌中。这类CheZ具有延长的CheA连接区，但与β/γ-变形菌中的CheZ的CheA连接区没有序列相似性。尽管如此，仍说明ε-变形菌中的CheZ能够和CheA相互作用。虽然在不同的变形菌纲中CheZ有很大差异，但是它们都具有保守的磷酸酯酶催化活性中心，且系统发育显示，这些CheZ具有共同的祖先[45]。
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| 图 3. 变形菌门CheZ序列进化树 Figure 3. Neighbour-joining phylogenetic tree (left) based on CheZ protein sequences. The domain architectures of CheZ are listed on the right, data from Pfam. Bootstrap analyses made with 1000 cycle are shown at the branch points. Scale bar indicates 0.2 changes/site. |
| 图选项 |
在具有趋化系统的细菌中，只有20%左右含有CheZ[46]。虽然含有CheZ的细菌在总量上并非多数，但是其分布广泛，几乎在各个细菌门类中都有存在。此外，cheZ在基因组中的位置多变，不仅在保守che簇中的位置不固定，而且还时常单独脱离于che簇之外。再者，CheZ蛋白的结构多变，仅在变形菌门中便可大致分为3类。CheZ的这些特点显示了其在进化研究中所具有的独特优势。
6 挑战与展望 趋化性在细菌致病性、病菌定殖[47]、固氮细菌与宿主共生[48]、植物与微生物互作[49]等方面有重要的作用。而作为趋化信号适应中不可或缺的调节蛋白，对CheZ的深入研究具有重要的意义。当前随着共晶结构分析、微流体化学梯度和大规模并行自动跟踪研究等各种手段的飞速发展，更多关于磷酸酯酶的报道不断涌出，极大地拓宽我们对信号转导系统的理解和认识，也使我们理解与认识细菌的行为本质更近了一步。但是目前还有很多问题亟待解决。在细菌中，CheAL和CheAS往往以相对稳定的比例存在[30]，但是CheZ与CheAS和CheAL三者之间的调节关系尚不清楚。另外，CheAS的氧化态与还原态之间的调节对CheZ乃至整个趋化系统的作用也鲜有报道。我们课题组在对α-变形菌纲中的茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans ORS571)的基因组进行分析时，发现其基因组编码多个CheY，其中一个CheY与CheZ基因反向相邻，且一同位于趋化基因簇之外[48]。苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)利用多个CheY来实现CheY-P的去磷酸化，茎瘤固氮根瘤菌中多个CheY与CheZ之间存在何种关系，又是如何协调？在α-变形菌中，CheZ定位情况如何，没有与CheA作用位点的CheZ是如何进行定位？是否类似ε-变形菌需要借助其他偶联蛋白的协助进行定位？另外，根据CheZ结构域分析可知α、δ、ε-变形菌的N端相对与γ、β-变形菌普遍较长，延长的N端区有何作用，是否参与了细胞内其它反应或生命活动？CheY不仅存在磷酸化调节，也存在乙酰化调节，乙酰化的CheY可以提高鞭毛的旋转频率[50]，这与CheZ的基因敲除或酶促活力下降时的细菌趋化表型类似，说明细菌可能通过乙酰化调节CheY与CheZ之间的相互作用。这些问题都有待更多的科研工作去揭示。总之，对细菌趋化通路中磷酸酯酶的深入研究，将有助于揭示细菌对环境的适应机制及其与宿主的互作机理。
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