王亚盟, 班睿
, 刘露, 申雨 天津大学化工学院, 系统生物工程教育部重点实验室, 天津 300350
收稿日期：2016-04-13；修回日期：2016-05-30；网络出版日期：2016-06-03
基金项目：国家“863计划”（2012AA02A701）
*通信作者：班睿, Tel/Fax:+86-22-87402179;E-mail:banrui@tju.edu.cn
摘要： [目的]构建异源D-海因酶和N-氨甲酰水解酶共表达的重组枯草芽孢杆菌，探讨其作为全细胞催化剂合成D-对羟基苯甘氨酸的可行性。[方法]采用Paco表达盒表达D-海因酶基因hyd或sd1，采用PAE表达盒表达N-氨甲酰水解酶基因adc。分别以质粒pHP13和pUB110为载体，构建D-海因酶和N-氨甲酰水解酶共表达质粒pHCS、pHCY和pUCS。在受体菌中整合表达了acoR和sigL基因，敲除了skf和sdp基因。将共表达质粒分别转化不同的受体菌，通过测定全细胞催化活性，表征D-海因酶和N-氨甲酰水解酶共表达的效果。[结果]带有质粒pHCY和pHCS的重组菌，全细胞催化活性分别为0.21 U/mL和0.31 U/mL。整合表达acoR和sigL基因以及高拷贝质粒pUCS，使全细胞催化活性达到1.0 U/mL。[结论]异源D-海因酶和N-氨甲酰水解酶在枯草芽孢杆菌中能够正确表达。基因拷贝数、acoR和sigL基因表达水平，及skf和sdp基因缺失对重组菌的催化活性具有显著影响。
关键词： 枯草芽孢杆菌 D-海因酶 N-氨甲酰水解酶 全细胞催化剂 D-对羟基苯甘氨酸
Construction of recombinant Bacillus subtilis by co-expression of heterologous D-hydantoinase and N-carbamoylase
Yameng Wang, Rui Ban
, Lu Liu, Yu Shen Key Laboratory of Systems Biotechnology, Ministry of Education, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300350, China
Received 13 April 2016; Revised 30 May 2016; Published online 03 June 2016
*Corresponding author: Ban Rui, Tel/Fax:+86-22-87402179;E-mail:banrui@tju.edu.cn
Supported by the National Programs for High Technology Research and Development of China (2012AA02A701)
Abstract: [Objective]We aimed at co-expressing heterologous D-hydantoinase and N-carbamoylase in Bacillus subtilis, and evaluating the feasibility of producing D-p-hydroxyphenylglycine by the recombinant B.subtilis whole-cell catalysis.[Methods]The Paco expression cassette was combined with the coding sequence of hyd or sd1 gene as an artificial gene to express D-hydantoinase.The PAE expression cassette was combined with the coding sequence of adc gene as an artificial gene to express N-carbamoylase.The D-hydantoinase and N-carbamoylase co-expression plasmids pHCS (sd1+adc) and pHCY (hyd+adc) were constructed, using plasmid pHP13 as carrier; the co-expression plasmids pUCS (sd1+adc) was constructed, using plasmid pUB110 as carrier.The additional copy of acoR and sigL gene was integrated at chromosome.The skf and sdp gene were knocked out in B.subtilis.All recombinant strains bearing co-expression plasmid were characterized by analyzing whole-cell catalysis activity.[Results]In the recombinant strains with plasmid pHCY and with pHCS, the whole-cell catalytic activity reached 0.21 U/mL and 0.31 U/mL, respectively.After the over-expression of acoR, sigL, and high-copy-number pUCS, the whole-cell catalytic activity reached 1.0 U/mL.[Conclusion]Overexpression of acoR, sigL and the deletion of skf, sdp genes had significant effects on the catalysis activity of recombinant whole-cell.
Key words: Bacillus subtilis D-hydantoinase N-carbamoylase whole-cell catalyst D-p-hydroxyphenylglycine
D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)是生产多种β-内酰胺类半合成抗生素的重要中间体，目前市场年需求量已超过万吨[1]，海因酶法(hydantoinase process)是最具竞争力的D-HPG工业生产方法[2]。所谓海因酶法，就是利用海因酶(hydantoinase)、N-氨甲酰水解酶(N-carbamoylase)和消旋酶的联合催化作用，将D, L-5-单取代海因转化为光学纯的L-或D-氨基酸的生物转化方法[3]。海因酶法合成D-HPG的原料是D, L-对羟基苯海因，催化剂是相应的D-海因酶和N-氨甲酰水解酶(N-carbamylD-amino acid amidohydrolase)(图 1)。由于D, L-对羟基苯海因能够自消旋，所以不需要消旋酶参与反应。
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| 图 1. 海因酶法合成D-对羟基苯甘氨酸的反应 Figure 1. Synthesis of D-p-Hydroxyphenylglycine by hydantoinase method. R: Hydroxy phenyl. |
| 图选项 |
海因酶法生产D-HPG的工艺主要有2种：一种是利用游离酶或固定化酶作为催化剂的酶催化法[4-5]，另一种是利用微生物静息细胞作为催化剂的全细胞催化法。前者由于催化剂制备过程复杂，催化剂成本过高，限制了其在工业生产中的应用。而全细胞催化法具有催化剂制备简单及成本低的优势，在D-HPG工业生产中被普遍采用。最早被用于D-HPG工业生产的全细胞催化剂，是分离的具有D-海因酶和N-氨甲酰水解酶活性的野生菌[6-8]。野生菌一般存在N-氨甲酰水解酶活性缺失或者偏低的不足，造成D-HPG生产效率低下。
采用基因工程技术，构建D-海因酶和N-氨甲酰水解酶共表达的重组菌，作为全细胞催化剂，能够弥补野生菌的缺陷。但是，到目前为止，所有研究都选择大肠杆菌(Escherichia coli)作为受体菌[9-13]。在皮氏罗尔斯通菌(Ralstonia pickettii)中共表达同源D-海因酶和N-氨甲酰水解酶的研究，是唯一的例外[14]。共表达异源D-海因酶和N-氨甲酰水解酶的重组E. coli用于生产D-HPG，存在一些难以克服的障碍。例如，共表达的N-氨甲酰水解酶更容易形成包涵体，造成酶活性的不平衡；过高的表达量对细胞代谢造成极大负担，而难以实现大规模生产[2-3]。采用表达D-海因酶和N-氨甲酰水解酶融合蛋白的方法，也只能部分解决酶活性平衡问题[15]。另外，E. coli内毒素的存在也是生产医药中间体的不利因素。
革兰氏阳性的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是传统的工业发酵菌株，属于GRAS (Generally recognized as safe)菌株。以B. subtilis作为受体菌，可以克服E. coli的固有缺陷。本研究探讨了异源D-海因酶和N-氨甲酰水解酶在B. subtilis中共表达的可能性，以及重组B. subtilis全细胞用于海因酶法生产D-HPG的可行性。同时，也考察了acoR和sigL基因过表达、增加基因拷贝数和敲除skf和sdp基因对重组细胞的催化活性的影响。
1 材料和方法 1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 表 1为本实验所使用的菌株和质粒。 表 1. 实验所用的菌株和质粒 Table 1. The strains and plasmids used in the study
| Strains and plasmids | Genotype | Source |
| B. subtilis 168 | trpC2 | stored in this lab |
| B. subtilis 168N | trpC2, ΔaraR::Para-neo | stored in this lab |
| E. coli top10 | Host for plasmid construction | stored in this lab |
| B. subtilis WD-1 | trpC2, ΔsacB:: Pcdd-acoR, ΔaraR::Para-neo | this study |
| B. subtilis WD-2 | trpC2, ΔyolA:: Pcdd-sigL, ΔaraR::Para-neo | this study |
| B. subtilis WD-3 | trpC2, ΔyolA:: Pcdd-sigL, ΔsacB:: Pcdd-acoR, ΔaraR::Para-neo | this study |
| pHP13 | Cmr, Emr | stored in this lab |
| pUB110 | Kmr, Blmr | stored in this lab |
| pHCY | Cmr, Emr, hyd::Paco, adc::PAE | this study |
| pHCS | Cmr, Emr, sd1::Paco, adc::PAE | this study |
| pUCS | Blmr, Kmr, sd1::Paco, adc::PAE | this study |
| B. subtilis LXZm | trpC2, ΔaraR::Para-neo, ΔsacB::Pcdd-ribA-DN*-cat-araR | stored in this lab |
| B. subtilis WD-4 | trpC2, ΔaraR::Para-neo, Δsdp, ΔyolA:: Pcdd-sigL, ΔsacB:: Pcdd-acoR | this study |
| B. subtilis WD-5 | trpC2, ΔaraR::Para-neo, Δsdp, Δskf, ΔyolA:: Pcdd-sigL, ΔsacB:: Pcdd-acoR | this study |
| Cmr: chloromycetin resistance; DN*: the fragment used for homologous recombination. | ||
表选项
1.1.2 主要培养基 (1) LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母抽提物5，NaCl 10，pH 7.5，琼脂粉15 (固体培养基)，用于B. subtilis的一般培养。需要时加入氯霉素6 mg/L，或新霉素15 mg/L，或博来霉素10 mg/L。(2)发酵培养基(g/L)：蛋白胨32.00，酵母提取物20.00，NaCl 5.00，NH4Cl 2.00，ZnSO4 0.10，KH2PO4 6.00，Na2HPO4 12.00，CaCl2 0.06，pH 7.2，用于培养B. subtilis测定全细胞催化活性。
1.1.3 主要试剂 Taq酶购自北京索莱宝科技有限公司；HifiDNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司；DNA胶回收试剂盒和PCR产物纯化试剂盒购自上海生工生物有限公司；dNTPs、限制性内切酶和cDNA第一链扩增试剂盒购自Thermo scientific公司；细胞总RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；D, L-对羟基苯海因购自中天化工有限公司；D-对羟基苯甘氨酸标准品和对二甲氨基苯甲醛购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司(TCI)；博来霉素购自天津博鑫生物科技有限公司；羟基丁酮购自天津希恩思生化科技有限公司；其余生化试剂为进口或国产分析纯试剂。 1.2 常规DNA操作方法 所用PCR引物和所设计的D-海因酶和N-氨甲酰水解酶基因序列的合成，及DNA测序都委托北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成。表 2为本实验所用的PCR引物。其余的DNA片段都来自PCR扩增，或者重叠PCR的拼接[16]。B. subtilis感受态细胞的制备、DNA片段或质粒的转化，及转化子筛选均采用Spizizen方法。质粒提取采用CTAB法，核酸的电泳，蛋白质的聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)均参考《分子克隆实验指南》。
表 2. 引物及合成序列 Table 2. Primers and synthetic sequences
| Primers | Primer sequences (5'→3') |
| Paco1 | TACCAAGGAGGAGTTATAGCGAACGGCACGATAGACTGTAT |
| Hyd1/Hyd2 | ATCAATCACAATGGAGGACAA/CGGGATCCATCAATCACAATGGAGGACAA |
| acoR-U1/Cdd2 | CTCCTCCAGCAAGATGATT/GTGTAAATTCCTCCCTTACCT |
| acoR1 | AGGTAAGGGAGGAATTTACACATGAACTCGGTGCCAAACG |
| acoR2 | CTCATCGGTGTCTGTGTTAT |
| acoR-D1 | ATAACACAGACACCGATGAGTTGATCCTAACGATGTAACC |
| acoR-G2 | GGAGTCAGTGAACAGGTAC |
| sigL-U1 | GGCAGTTACTTATTGGACAG |
| sigL1 | AGGTAAGGGAGGAATTTACACATGGATATGAAACTTCAGC |
| sigL2/sigL3 | CTCTACTGAAAGTGTTTTCCA/TGGAAAACACTTTCAGTAGAG |
| sigL4 | CATTATCACTCGGCATGGA |
| sigL-D1/G2 | TCCATGCCGAGTGATAATGTTGGTGTCGTCTCAATCTT/TTGCTGAGTATTGTTCTGTC |
| RTccpA1/A2 | ACGAGCATGTGGCGGAAT/GATAGCGACTGACGGTGT |
| PU7 | TCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGAGTGCCGACCAAAACCATAAAAC |
| PU8 | CGGGATCCCAGCACAATTCCAAGAAAAACA |
| skf-U1/U3 | CATTAGGCTGGAAGTCTGTA/AACAGCAGAGAAGTCACTCCATAAGTAAACCTCCTCT |
| skf-D1/D2 | GAGTGACTTCTCTGCTGTT/ATGGGTGCTTTAGTTGAAGACACAGTCGGTTCGTCTAA |
| skf-G1/G2 | CACGAAAACTGAATGAATAAGAGATGAGTGCTGACCA/GCTCCACCACATCTGATAC |
| CR1/CR2 | TCTTCAACTAAAGCACCCAT/TTATTCATTCAGTTTTCGTG |
| sdp-U1 | GCTTAGAGGAGGTAATCTACAT |
| sdp-U2S | CAGCCGCTTCTAAATCAGACTAACCAAGTGATGACAACA |
| sdp-D1S | TCTGATTTAGAAGCGGCTG |
| sdp-D2S | ATGGGTGCTTTAGTTGAAGACGATACAATGGTCAGGAAAT |
| sdp-G1 | CACGAAAACTGAATGAATAAGGAGGTGAATCAGTCAAGTT |
| sdp-G2 | CGCCCACAACATATAAATATCC |
表选项
1.3 D-海因酶和N-氨甲酰水解酶共表达质粒的构建方法 以质粒pHP13为载体构建共表达质粒：将全合成的D-海因酶基因和N-氨甲酰水解酶基因通过重叠PCR拼接为1个片段，并在片段两端分别引入Hind Ⅲ与BamHⅠ酶切位点。将质粒pHP13和拼接的基因片段分别用Hind Ⅲ与BamHⅠ双酶切4 h，然后再将二者用T4 DNA连接酶16 ℃连接3 h；取适量的连接产物转化E. coli top10感受态细胞，通过蓝白筛选和氯霉素抗性筛选出转化子；然后提取质粒，通过酶切电泳、PCR扩增和DNA测序，验证重组质粒的正确性。
以质粒pUB110为载体构建共表达质粒：PCR扩增得到含有D-海因酶基因和N-氨甲酰水解酶基因的DNA片段，PCR扩增质粒pUB110由ori+到部分ori-共3277 bp的片段；然后采用重叠PCR方法，将上述2个DNA片段拼接为1个片段，并在拼接片段的两端都加上BamHⅠ酶切位点；然后将拼接片段用BamHⅠ酶切4 h，再用T4 DNA连接酶16 ℃连接3 h；最后取适量连接产物转化B. subtilis 168感受态细胞，用新霉素抗性筛选转化子。转化168N菌株，用博来霉素抗性筛选转化子。由转化子中提取的质粒最终通过酶切电泳、PCR扩增及测序验证。
1.4 基因的整合表达和敲除方法 采用无标记基因修饰方法[17]，对B. subtilis染色体上的基因进行修饰，包括基因的整合表达和敲除。选择在染色体sacB位点整合表达acoR基因，首先从B. subtilis 168染色体上PCR扩增acoR基因的编码序列R片段(2149 bp)，再从B. subtilis LXZm菌株染色体上扩增含有上游同源臂U和Pcdd表达盒[18]的UPcdd片段(1311 bp)，以及含有下游同源臂G、正向选择标记盒CR和内部同源重组片段D的DCRG片段(3628 bp)。然后通过重叠PCR方法，拼接成UPcddRDCRG片段。用UPcdd-RDCRG片段转化B. subtilis 168N感受态细胞，用氯霉素抗性平板筛选抗性菌落。抗性菌落转接LB培养基，37 ℃、220 r/min培养4 h。培养液稀释后涂布新霉素抗性平板，用新霉素抗性反向选择“弹出”正向选择标记盒的转化子。最后，通过PCR扩增和DNA测序验证，得到Pcdd-acoR基因整合的重组菌株WD-1。采用相同的方法，在B. subtilis 168N染色体yolA位点整合表达了Pcdd-sigL基因，构建了WD-2；以及Pcdd-acoR和Pcdd-sigL基因共整合表达的重组菌WD-3。采用相同的方法，在B. subtilis WD-3菌株染色体上敲除了skf和sdp基因，构建了双缺陷菌株WD-5。
1.5 实时荧光定量PCR分析 使用罗氏公司Light Cycler 480荧光定量PCR仪，采用荧光实时定量PCR (qRT-PCR)方法，测定靶基因的胞内mRNA相对水平，用于表征靶基因的相对表达水平。使用LB培养基，37 ℃、225 r/min摇瓶培养待测菌株；在培养至12、18和24 h时，分别取样并提取细胞总RNA作为模板，进行cDNA第一链的扩增，然后进行qRT-PCR扩增测定Ct值。上述实验的条件及具体操作步骤，均按照所使用试剂盒的推荐条件进行。qRT-PCR扩增的参比基因为B. subtilis的碳分解代谢全局调控蛋白CcpA编码基因ccpA。分别测定对照菌和目标菌的靶基因及参比基因的Ct值，根据2-△△Ct法[19]，计算目标菌靶基因mRNA胞内水平相对于对照菌的倍数。
1.6 全细胞D, L-对羟基苯海因催化活性的测定 待测菌株用5 mL LB培养基，225 r/min、37 ℃活化培养12 h。按2%接种量转接30 mL发酵培养基，37 ℃、225 r/min振荡培养6 h，加入终浓度为0.5%的羟基丁酮，继续诱导培养至24 h。取2 mL发酵液离心收集菌体，用Tris-HCl缓冲液(50 mmol/L，pH 8.0)洗涤2遍，再用10 mL 40 ℃预热的反应液(0.3% D, L-对羟基苯海因的Tris-HCl缓冲液)重悬，置40℃水浴恒温箱中，160 r/min振荡反应30 min，加入10 μL的6 mol/L HCl终止反应；反应液13000 r/min离心1 min，取上清液作为分析样品。对B. subtilis 168菌株的培养物进行相同的处理及反应，所得反应液的上清液，作为随后分光光度法测定D-HPG的参比液。
采用Agilent 1260 HPLC定量测定反应液中的D, L-对羟基苯海因、D-HPG和中间物N-氨甲酰基-对羟基苯甘氨酸，色谱条件为：Poroshell 120 EC18-2.7 m (4.6 mm×50 mm)色谱柱，流动相φ(CH3CN):φ(H2O)=10:90(体积比)，进样量1 μL，流速0.5 mL/min，紫外检测器波长210 nm。
采用茚三酮法定量测定反应液中的D-HPG：在试管中加入0.9 mL样品、0.1 mL盐酸(0.2 moL/L)和0.5 mL的0.2%茚三酮溶液，混匀后静置5 min；然后在100 ℃水浴中反应3 min；用分光光度计测量反应液在570 nm下的OD值，根据公式(1)计算每毫升发酵液中收集的静息细胞所具有的催化活性。
 | (1) |
采用对二甲氨基苯甲醛(PDAB)法，定性检测样品中的N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸。取100 μL样品和10% PDAB (6 mol/L HCl)试剂10 μL，在96孔板中混匀，肉眼观测颜色变化。PDAB试剂与N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸可在常温下发生反应，生成黄色物质，表明样品中含有N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸。
1.7 超声法细胞破碎方法 将待测菌株用发酵培养基培养，并加入羟基丁酮诱导18 h后，将培养液4 ℃、4000 r/min离心15 min，收集菌体沉淀，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2遍；1 g湿菌体用20 mL PBS缓冲液重悬，用超声破碎仪破碎30 min (400 W，运行5 s、休息5 s工作模式)；将细胞裂解液4 ℃、4000 r/min离心15 min，收集上清液用于聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。
1.8 活菌计数及芽孢计数方法 活菌计数采用平板计数法，即：每一稀释度做3个平板，37 ℃培养14 h，进行菌落计数，单位为CFU/mL。进行芽孢计数时，先将稀释好的菌悬液80 ℃水浴15 min，然后采用平板计数法计数。
2 结果和分析 2.1 D-海因酶与N-氨甲酰水解酶的共表达 通过氨基酸序列比对，选择来自Bacillus stearothermophilus SD-1的sd1基因[20]，以及Jannaschia sp. CCS1的hyd基因[21]，作为在B. subtilis中进行异源表达的D-海因酶基因。选择羟基丁酮诱导的Paco表达盒[22]，与sd1或hyd基因编码序列，以及T7终止子，分别拼接为Paco-sd1和P aco-hyd基因，并进行全序列合成。选择来自Agrobacterium sp. KNK712的N-氨甲酰水解酶基因adc的编码序列[23]，与PAE表达盒[24]及噬菌体cry1Aa终止子[25]拼接为PAE-adc基因，并进行全序列合成。将全合成的Paco-sd1和Paco-hyd基因，分别与PAE-adc基因通过重叠PCR拼接为adc-sd1片段和adc-hyd片段，片段两端分别引入了酶切位点(图 2)。
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| 图 2. adc-sd1(adc-hyd)序列的构成 Figure 2. The composition of adc-sd1(adc-hyd) sequence. |
| 图选项 |
以低拷贝的E. coli-B. subtilis穿梭质粒pHP13作为载体，分别与adc-sd1和adc-hyd连接，构建D-海因酶与N-氨甲酰水解酶共表达质粒。经过在E. coli top10中的筛选和验证，得到了adc-sd1共表达质粒pHCS，以及adc-hyd共表达质粒pHCY。
将重组质粒pHCY和pHCS分别转化B. subtilis 168感受态细胞，筛选出168/pHCY和168/pHCS转化子。各选择10株转化子，进行摇瓶培养及测定全细胞的催化活性。所测定的全部转化子均能够催化D, L-对羟基苯海因转化为D-HPG (图 3)，而且反应液的定性测定显示没有反应中间物N-氨甲酰基-D-对羟基苯甘氨酸的积累。说明在B. subtilis中，异源的sd1、hyd和adc基因，能够被Paco表达盒或PAE表达盒正确表达，并且表达产物具有正常的催化活性。由于168/pHCY菌株的平均催化活性为0.21 U/mL，168/pHCS菌株的平均催化活性为0.31 U/mL，且2株菌的生物量均为3.5×108 CFU/mL左右，表明B. stearothermophilus SD-1的D-海因酶(sd1基因)性能更好，故选择adc-sd1基因及其表达质粒pHCS用于后续研究。
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| 图 3. 不同重组菌株的全细胞催化活性比较 Figure 3. Comparison of whole-cell catalytic activity of the recombinants. |
| 图选项 |
2.2 acoR和sigL基因过表达对细胞催化活性的影响 Paco表达盒受σL识别，转录需要羟基丁酮诱导，并依赖激活蛋白AcoR。由于sigL和acoR基因的表达受到严格调控[26]，可能会限制多拷贝Paco表达盒的转录效率。分别在B. subtilis 168N整合表达一个额外的acoR和sigL基因拷贝，并在sigL基因编码序列中引入了G573A同义突变，以消除其碳分解代谢物调控元件(cre-box)。经过筛选和验证，分别得到acoR整合表达菌株B. subtilis WD-1和sigL整合表达菌株WD-2，以及sigL和acoR双整合表达菌株WD-3。
采用qRT-PCR方法，测定了WD-3菌株sigL和acoR基因mRNA的胞内相对水平。结果显示(表 3和表 4)，WD-3菌株的sigL和acoR基因的胞内mRNA水平，均显著高于对照菌168N。从生长12 h到24 h，mRNA水平的差异倍数呈降低趋势，表明野生型的sigL和acoR基因在稳定期才被充分表达。
表 3. acoR基因的qRT-PCR转录分析 Table 3. The transcription analysis of acoR using qRT-PCR
| Cycle number | 168N | ΔCt | WD-3 | ΔCt | ΔΔCt | 2-ΔΔCt | ||
| ccpA | acoR | ccpA | acoR | |||||
| Ct12 (mean) | 35.95 | 39.89 | 3.94 | 34.29 | 28.94 | -5.35 | -9.29 | 626.0 |
| Ct18 (mean) | 31.23 | 33.17 | 1.94 | 33.20 | 28.36 | -4.84 | -6.70 | 110.0 |
| Ct24 (mean) | 34.04 | 36.40 | 2.36 | 30.22 | 29.48 | -0.74 | -3.10 | 8.6 |
表选项
表 4. sigL基因的qRT-PCR转录分析 Table 4. The transcription analysis of sigL using qRT-PCR
| Cycle number | 168N | ΔCt | WD-3 | ΔCt | ΔΔCt | 2-ΔΔCt | ||
| ccpA | sigL | ccpA | sigL | |||||
| Ct12 (mean) | 35.95 | 38.28 | 2.33 | 34.29 | 29.48 | -4.81 | -7.14 | 141 |
| Ct18 (mean) | 31.23 | 36.39 | 5.16 | 33.2 | 31.75 | -1.45 | -6.61 | 98 |
| Ct24 (mean) | 34.04 | 39.97 | 5.93 | 30.22 | 34.6 | 4.38 | -1.55 | 3 |
表选项
将D-海因酶和N-氨甲酰水解酶共表达质粒pHCS分别转化WD-1、WD-2和WD-3菌株，筛选出WD-1/pHCS、WD-2/pHCS和WD-3/pHCS菌株。以B. subtilis 168N/pHCS为对照，进行摇瓶培养和全细胞催化活性测定。结果显示(图 4)，过表达sigL和acoR基因都能明显提高催化活性，其中过表达sigL基因的效果相对显著；二者共同过表达，平均催化活性达到0.56 U/mL，比对照菌提高了80%。因此，为了维持多拷贝Paco表达盒的正常转录效率，必需提高σL和AcoR蛋白的胞内水平。
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| 图 4. 过表达acoR和sigL基因对全细胞催化活性的影响 Figure 4. Effect of over-expressing acoR and sigL genes on whole-cell catalytic activity. Reactions were performed in triplicate, and error bars represent the standard errors of the means. |
| 图选项 |
2.3 增加adc和sd1基因拷贝数对全细胞催化活性的影响 质粒pUB110在B. subtilis中有30-50个拷贝，PCR扩增其部分片段[27]，与adc-sd1片段拼接线性片段(图 5)，然后经酶切和连接反应环化，并转化B. subtilis 168，经筛选和测序鉴定，构建了高拷贝的adc-sd1基因共表达质粒pUCS。
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| 图 5. 重组质粒pUCS的构建 Figure 5. Construction of recombinant plasmid pUCS. |
| 图选项 |
将重组质粒pUCS转化B. subtilis WD-3感受态细胞，经博来霉素抗性筛选、酶切电泳及测序验证，得到了正确的WD-3/pUCS转化子。随机选择10株转化子测定其全细胞催化活性。结果显示(图 6)，WD-3/pUCS菌株的平均催化活性超过1.0 U/mL，最高达到1.2 U/mL，催化活性的平均值比WD-3/pHCS菌株提高了78%。
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| 图 6. WD-3/pUCS菌株的催化活性 Figure 6. Catalytic activity of WD-3/pUCS. |
| 图选项 |
为了直观比较菌株WD-3/pUCS和WD-3/pHCS的D-海因酶和N-氨甲酰水解酶胞内水平差异，分别对其细胞裂解液的上清液进行了SDS-PAGE分析，上样量均为20 μL。D-海因酶(Sd1)和N-氨甲酰水解酶(Adc)亚基的理论分子量，分别为54 kDa和34 kDa。电泳结果显示(图 7)，在WD-3/pUCS和WD-3/pHCS菌株细胞裂解液的上清液中，均能检出约54 kDa和35 kDa的蛋白条带，而且它们的亮度呈现由WD-3/pHCS到WD-3/pUCS的明显递增趋势。而作为对照的WD-3菌株，在相应位置没有明显条带。增加表达质粒的拷贝数，能够显著增加D-海因酶和N-氨甲酰水解酶的表达量及全细胞的催化活性。
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| 图 7. 重组菌细胞裂解液的SDS-PAGE Figure 7. SDS-PAGE of cell lysate of recombinants. M: protein marker. |
| 图选项 |
2.4 羟基丁酮诱导时间的优化 羟基丁酮对Paco表达盒的诱导表达机制尚不明确。在此前的实验中，诱导剂羟基丁酮在发酵培养基中的加入时间(发酵6 h)、终浓度(0.5%)和诱导时间(18 h)，均采用文献值[22]。为了确定诱导时间的正确性，对WD-3/pUCS和WD-3/pHCS菌株分别进行了诱导时间为8、12、16、18、20和22 h的发酵培养。全细胞催化活性的测定结果显示(图 8)，羟基丁酮诱导18 h，细胞的催化活性最高，结果与文献值相符。
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| 图 8. 羟基丁酮诱导时间与全细胞催化活性的关系 Figure 8. The relationship between induced time by acetoin and whole-cell catalytic activity. Reactions were performed in triplicate, and error bars represent the standard errors of the means. |
| 图选项 |
2.5 敲除sdp和skf基因对全细胞催化活性的影响 B. subtilis在营养限制条件下会形成芽孢，在芽孢形成起始阶段，会出现芽孢形成细胞杀死非芽孢形成细胞的自相残杀(Cannibalism)行为。芽孢形成细胞分泌的毒素SKF (skfABCDEFGH operon)和SDP (sdpABC operon)，是杀死姊妹细胞的主要效应蛋白[28]。
为了考察自相残杀行为对全细胞催化活性的影响，在B. subtilis WD-3中顺序敲除sdp和skf基因，构建了双缺陷株菌株WD-5。转化表达质粒pUCS，筛选出WD-5/pUCS转化子。以菌株WD-3/pUCS为对照，通过摇瓶培养获得静息细胞。细胞被悬浮在Tris-HCl缓冲液中，置40 ℃水浴中振荡孵育。分别测定细胞催化活性、活菌量和芽孢量随孵育时间的变化。结果显示(图 9-A)，WD-3/pUCS细胞的催化活性衰减较快，孵育1.5 h后，催化活性由1.07 U/mL下降为0.24 U/mL，下降幅度为78%；而WD-5/pUCS细胞相对衰减较慢，孵育1.5 h后，催化活性由1.06 U/mL下降为0.48 U/mL，下降幅度为49%。两株菌的初始活菌量约为3.5×108 CFU/mL左右，WD-5/pUCS菌株的初始芽孢量为3.1×105CFU/mL，约高于WD-3/pUCS菌株一个数量级。细胞被孵育1.5 h后，二者的芽孢量均上升了一个数量级，而活菌量分别下降为7.6×106 CFU/mL和2.1×106 CFU/mL (图 9-B)。在孵育过程中，部分细胞可能丧失了繁殖能力，而不能用平板菌落计数法检测，表现为活菌量的显著下降。
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| 图 9. skf和sdp双缺陷对催化活性和活菌及芽孢量的影响 Figure 9. Effect of deletion skf and sdp genes on catalytic activity, viable count and spore number. A: catalytic activity. B: viable count and spore number; reactions were performed in triplicate, and error bars represent the standard errors of the means. |
| 图选项 |
3 讨论 通过构建表达质粒，在B. subtilis中成功地表达了有催化活性的异源D-海因酶和N-氨甲酰水解酶。在使用高拷贝表达质粒的条件下，重组全细胞的催化活性在1.0 U/mL左右，接近重组E. coli的水平[13]，超过重组R. pickettii菌株的活性水平[14]。因此，B. subtilis重组细胞完全可以替代E. coli，作为海因酶法生产D-HPG的全细胞催化剂，同时可以避免E. coli的不足。来自B. stearothermophilus SD-1的D-海因酶，具有较高的全细胞催化活性。D-海因酶和N-氨甲酰水解酶的酶学性能差异，对全细胞催化活性有重要影响。选择经过定向进化而性能优良的D-海因酶和N-氨甲酰水解酶进行共表达，一定会使重组B. subtilis全细胞催化活性达到更高水平。
选择Paco表达盒诱导表达D-海因酶，主要考虑其低泄露性的特点。但是，Paco表达盒的表达依赖羟基丁酮诱导、AcoR蛋白激活和σL因子识别，它们之间合适的定量关系难以确定。高拷贝的表达质粒pUCS仅比低拷贝的pHCS质粒增加了1.5倍的催化活性，原因很可能是有限的AcoR蛋白和σL因子胞内水平限制了多拷贝Paco表达盒的充分表达。Paco表达盒或许不是最合适的D-海因酶表达元件，还有进一步改进的空间。
B. subtilis的芽孢形成和伴随的自相残杀行为，都不利于合成D-HPG的催化反应。敲除skf和sdp基因能够显著降低催化活性的衰减速率，很可能是因阻断了自相残杀而减少了细胞裂解的效应。因此，在催化合成D-HPG的B. subtilis细胞中敲除skf和sdp基因是必要的。伴随skf和sdp基因双缺陷而出现的芽孢比例增加一个数量级的问题，可以通过敲除相关基因阻断芽孢的形成[29]。完全阻断芽孢的形成，可能会进一步减缓细胞催化活性的衰退。
综上所述，重组B. subtilis的全细胞催化活性还有进一步提升的空间，催化活性的衰减速率还有进一步降低的必要性，重组B. subtilis用于海因酶法合成光学纯的L-或D-氨基酸，具有较大的潜力。
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