, 袁乙卜1, 张建民1, 郭英明1, 吕景花2, 杨锐龙1, 胡彬11. 西安工程大学城市规划与市政工程学院, 西安 710048;
2. 河南师范大学环境学院, 新乡 453007
收稿日期: 2020-07-10; 修回日期: 2020-09-26; 录用日期: 2020-09-26
基金项目: 陕西省教育厅自然科学专项项目（No.16JK1344，18JK0359）；西安工程大学博士科研启动课题项目（No.107020245）；陕西省大学生创新创业训练计划项目（No.S201910709059）
作者简介: 陈希(1985—), 女, 博士, E-mail: Xi_Chen2011@126.com
通讯作者（责任作者）: 陈希(1985—), 女, 博士, 西安工程大学城市规划与市政工程学院教师.从事水污染控制理论和技术, 以及环境生物学方面的教学和科研工作.发表论文10余篇, 其中SCI/EI收录6篇.E-mail: Xi_Chen2011@126.com
摘要：分别采用NaAc（R1）、NaAc+胰蛋白胨（R2）和可溶性淀粉+胰蛋白胨（R3）为碳源模拟生活污水，研究大分子有机物对除磷颗粒污泥特性及菌群结构的影响.结果表明，在培养初期，大分子有机物有利于除磷污泥的凝聚，随着大分子有机物含量的增多，除磷污泥的颗粒化速度依次加快，经过120 d的培养R3反应器最先实现颗粒化.系统稳定后，3个反应器中成熟颗粒污泥的平均粒径分别为500、400和300 μm，SVI30在45 mL·g-1上下波动，R2和R3的大分子有机物系统中存在少量絮体污泥.所有系统对COD、PO43--P和NH4+-N的去除率分别达到90%、95%和99%以上.扫描电镜观察显示，R1系统颗粒污泥密实，表面光滑，主要由球菌组成；R2、R3系统污泥表面呈毛毯状，R2系统污泥以丝状菌为骨架，表面附有大量球菌和杆菌，R3系统污泥由球菌、杆菌和丝状菌共同组成.16S rRNA基因高通量测序结果显示，碳源的不同导致各颗粒污泥系统细菌群落呈现较大差异.NaAc易促进酸杆菌门（Acidobacteria）的生长，而胰蛋白胨和可溶性淀粉这类大分子有机物有利于拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Actinobacteria）的生长.在属水平，Defluviicoccus这一偏好乙酸盐的传统聚糖菌为R1系统的优势菌群，而水解菌Cloacibacterium及发酵型聚磷菌Tessaracoccus为R3系统的优势菌群.各系统中均未检测到传统聚磷菌Candidatus Accumulibacter.
关键词：大分子有机物除磷颗粒污泥沉降性能脱氮除磷菌群结构
Effects of macromolecular organic matters on the characteristics and bacterial community structure of the phosphorus removal granular sludge
CHEN Xi1
, YUAN Yibu1, ZHANG Jianmin1, GUO Yingming1, Lü Jinghua2, YANG Ruilong1, HU Bing11. School of Urban Planning and Municipal Engineering, Xi'an Polytechnic University, Xi'an 710048;
2. College of Environment, Henan Normal University, Xinxiang 453007
Received 10 July 2020; received in revised from 26 September 2020; accepted 26 September 2020
Abstract: The effects of macromolecular organics matters on the characteristics and bacterial community structure of phosphorus removal granular sludge were studied, in which NaAc (R1), NaAc + tryptone (R2), and soluble starch + tryptone (R3) were respectively used as carbon source to simulate the municipal wastewater. In the early stage of cultivation, macromolecular organic matters were conducive to the aggregation of phosphorus removal sludge. With the increase of the content of macromolecular organic matters, the granulation speed of phosphorus removal sludge accelerated in turn. After 120 days of cultivation, the sludge in R3 system was the earliest to achieve granulation. When the systems were stable, the average particle sizes of mature granular sludge were respectively 500, 400 and 300 μm, the SVI30 values fluctuated around 45 mL·g-1, and a small amount of flocs can be found in the R2 and R3 systems due to the macromolecular organic matters in the influent. The removal efficiencies of COD, PO43--P and NH4+-N in all the systems were higher than 90%, 95% and 99%, respectively. Scanning electron microscope observation showed that the granular sludge of the R1 system was dense and the surface was mainly composed of cocci. The surfaces of the sludge in the R2 and R3 systems were both blanket-like. The sludge in the R2 system was based on filamentous bacteria, and a large number of cocci and bacilli attached to the surface. The sludge in the R3 system was composed of cocci, bacillus and filamentous bacteria. The results of 16S rRNA gene high-throughput sequencing showed that the different carbon sources resulted in significant differences in the bacterial communities among the three systems. NaAc easily promoted the growth of Acidobacteria, while macromolecular organic matter such as tryptone and soluble starch were beneficial to the growth of Bacteroidetes and Actinobacteria. At the genus level, Defluvicoccus, a traditional glycogen accumulating organisms which preferred acetate, was the dominant bacteria in the R1 system; while the hydrolytic bacteria Cloacibacterium and the fermentative phosphate accumulating organisms Tessaracoccus dominated in the R3 system. The traditional phosphorus accumulating organisms Candidatus Accumulibacter was not detected in all the systems.
Keywords: macromolecular organic matterphosphorus removal granular sludgesludge settleabilitynitrogen and phosphorus removalbacterial community structure
1 引言(Introduction)好氧颗粒污泥系统在过去近30年迅速发展, 受到越来越多的关注(Morgenroth et al., 1997；Nancharaiah et al., 2019).好氧颗粒污泥沉降性能好, 污泥浓度高, 可实现同步脱氮除磷, 在节能降耗、节省土地资源等方面具有很大潜力(Khan et al., 2015).在全球范围内, 目前已有40多家大型污水处理厂正在使用好氧颗粒污泥系统处理各种市政和工业废水(Pronk et al., 2017a).传统的好氧颗粒污泥以单一好氧环境培养, 虽然启动时间短, 但污泥生长速度快, 稳定性较差, 颗粒容易解体或产生大量丝状菌(Franca et al., 2018).采用厌氧好氧交替的环境, 筛选除磷功能菌群(包括聚磷菌和聚糖菌)等具有存储功能的菌群, 可以显著降低污泥的生长速率, 促进污泥颗粒化, 进而培养出性能稳定的好氧颗粒污泥—除磷颗粒污泥(de Kreuk et al., 2004, Pronk et al., 2015).由于聚磷菌/聚糖菌偏好短链脂肪酸(VFA), 在传统研究中, 除磷颗粒污泥的培养常采用乙酸钠、丙酸钠等短链脂肪酸盐(Sengar et al., 2018).
城市污水中的大分子有机物主要为糖类、蛋白质和脂类物质(Santos et al., 2013；Zhang et al., 2016), 三者约占总COD的65%(Cholnatee et al., 2004), 有时甚至高达78%(Kamma et al., 1994).在实际污水的管网运输过程中, 大分子有机物可能在管道中(厌氧环境)水解发酵而转化为小分子有机物物质, 但该部分占比较小(Jin et al., 2018).赵爽(2014)对西安市3个污水处理厂的进水水质分析发现, 实际污水中的VFAs浓度较低, 仅占总COD的3%~4%.López-Vázquez等(2008)报道, 荷兰污水处理厂进水中的VFAs约占总COD的11%~18%.可见, 实际生活污水中VFA等小分子有机物的含量非常有限, 大分子有机物才是碳源的主体(杨雄等, 2015).在全球实际污水中, 大分子有机物约占进水总COD的50%~90%(李志华等, 2011；Wang et al., 2014a).对于城市污水, 即使经过初沉池, 大分子有机物仍约占出水COD的45%~88%(Morgenroth et al., 2002).大分子有机物需经过水解发酵才能被除磷功能菌群利用, 水解过程速率缓慢是影响碳源利用和污泥颗粒化的限速步骤.因此, 以VFA为碳源的传统研究在探讨实际污水的除磷污泥颗粒化问题时存在一定的困难.
有关大分子有机物对污泥的影响, 最近几年才逐渐得到关注.在传统絮状活性污泥系统中, 大分子有机物缓慢的水解作用会抑制丝状菌的生长, 可以有效改善污泥的沉降性能.Martins等(2011)以土豆淀粉为碳源, 研究了聚合物基质对活性污泥沉降性能的影响, 指出颗粒态有机物能够提高活性污泥的沉降性能.Wang等(2013)采用甘薯淀粉模拟城市污水中的颗粒态碳源, 发现由于缓慢的水解作用导致液相中有机物含量过低, 颗粒态有机物可以有效抑制丝状菌的扩展生长.然而, 在颗粒污泥系统中, 有关大分子有机物对污泥颗粒化的影响尚不完全清楚.
一些****发现, 大分子有机物降解过程中的絮凝和吸附等作用, 在一定程度上可以促进或者至少并不影响污泥颗粒化(张杰等, 2016；Cetin et al., 2018).但更多的研究和工程实践证实, 相比短链脂肪酸为碳源的颗粒污泥系统(培养时间仅需数周), 大分子有机物缓慢的水解速率将延缓甚至阻碍颗粒污泥的形成.在含有大量大分子有机物的中低浓度城市污水中, 除磷颗粒污泥的培养时间明显变长, 大约需要160~400 d不等(Liu et al., 2010；Wagner et al., 2015a).Wagner等(2015b)采用36%乙酸盐、14%水解蛋白胨和50%颗粒态淀粉的混合碳源模拟城市污水, 研究颗粒态有机物对生物除磷污泥颗粒化的影响, 指出颗粒态有机物会延缓除磷污泥的颗粒化过程.此外, de Kreuk等(2010)采用颗粒态淀粉和可溶性淀粉分别模拟实际污水中的胶体态和溶解态大分子有机物, 证实由于吸附和水解作用, 大分子有机物可在颗粒污泥上形成明显的有机物浓度梯度, 刺激丝状菌的大量生长.最近, Layer等(2019)采用蛋白胨和淀粉模拟城市污水中的颗粒态有机物, 考察有机物的扩散性对好氧颗粒污泥的影响, 发现大分子有机物的存在使系统形成的颗粒污泥粒径更小, 并导致除磷颗粒污泥系统中存在20%~40%(占总污泥浓度百分比)的絮体污泥.现阶段, 有关大分子有机物对除磷污泥颗粒化影响的研究较少, 对于大分子有机物影响除磷污泥颗粒化的内在机制缺乏深入的认识, 而对该现象所涉及的核心功能菌群尚不明确(Wang et al., 2018b；Piotr et al., 2018；Kang et al., 2018).
本研究以城市污水厂絮状活性污泥作为接种污泥, 在3个等工作体积推流式进水的序批式反应器(SBR)中, 分别以100%NaAc、60%NaAc+40%胰蛋白胨、60%可溶性淀粉+40%胰蛋白胨为碳源培养除磷颗粒污泥(胰蛋白胨和可溶性淀粉分别代表污水中的蛋白质类和糖类大分子有机物), 考察大分子有机物对除磷颗粒污泥沉降性能、脱氮除磷特性、粒径、表面形貌和菌群结构的影响, 探索大分子有机物影响除磷污泥颗粒化的内在机制, 以期为除磷颗粒污泥处理实际污水提供理论和实验依据.
2 材料与方法(Materials and methods)2.1 实验装置与运行参数采用3组相同规格的圆柱形有机玻璃SBR反应器, 如图 1所示.各反应器高度为110 cm, 有效水深为92 cm, 内径为7.5 cm, 高径比(H/D)为12.27, 有效容积为4 L.反应器底部设有微孔砂芯曝气头, 采用电磁式空气压缩机(海利ACO-318)供气, 转子流量计控制曝气量为1.2 L · min-1.实验采用推流式进水的SBR反应器, 等工作体积运行, 进水从底部由布水盘以活塞流均匀进入, 上部已处理好的水被逐渐置换出反应器, 由出水口同步自流至出水桶.进水流量由蠕动泵(保定兰格BT100-2J)控制, 进水上升流速为0.46 m · h-1, 排水比50%.采用恒温水浴(西安东瑞YHX-030)保持反应器在20 ℃运行.
图 1(Fig. 1)
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| 图 1 反应器示意图 (1.进水箱；2.蠕动泵；3.时间控制器；4.曝气泵；5.进水口；6.砂芯曝气头；7.好氧阶段取样口；8.出水口(取样口)；9.出水箱) Fig. 1Schematic diagram of the reactor |
反应器每天运行6个周期, 每周期4 h.其中, 同步进出水60 min, 静置30 min, 曝气145 min, 沉淀5 min(启动阶段沉淀时间在30 d内逐渐由30 min减少至5 min, 曝气时间对应延长).整个系统采用时间控制器自动控制.
2.2 进水水质和接种污泥采用模拟生活污水(COD 400 mg · L-1、TN 40 mg · L-1、TP 10 mg · L-1), 进水配方详见表 1.每升模拟污水分别加入1 mL微量元素浓缩液和10 mL矿物质浓缩液(表 2).接种污泥取自西安市第四污水处理厂(AAO工艺)回流污泥, 将取回的污泥过筛(筛孔1 mm)2~3次, 去除较大的杂质和悬浮物后加入反应器.该污水厂AAO工艺具有良好的除磷效果(赵爽, 2014；李瑾, 2015).
表 1(Table 1)
| 表 1 人工模拟生活污水配方 Table 1 Composition of artificial domestic wastewater | ||||||||||||||||
表 1 人工模拟生活污水配方 Table 1 Composition of artificial domestic wastewater
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表 2(Table 2)
| 表 2 微量元素和矿物质浓缩液组分及其浓度 Table 2 Components and concentrations of trace elements and mineral concentrates | ||||||||||||||||||||||||||||||||||
表 2 微量元素和矿物质浓缩液组分及其浓度 Table 2 Components and concentrations of trace elements and mineral concentrates
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2.3 常规指标分析方法定期检测反应器常规水质及污泥性能指标, 参考《水和废水监测分析方法》第四版(国家环境保护总局, 2002)进行.进水和静置阶段从反应器顶部出水口取样, 好氧阶段从中部取样口取样(图 1).污泥结构及生物相采用可见光-荧光显微镜(奥林巴斯BX53)及场发射扫描电镜(Quanta-450-FEG)观察.扫描电镜(SEM)预处理方法为：在好氧期末取一定量的颗粒污泥, 加入磷酸盐缓冲溶液(PBS)在4 ℃下8000 r · min-1离心清洗3次, 每次5 min.加入新配的2.5%戊二醛混匀后置于4 ℃下固定4 h, 再加入PBS缓冲液混匀后在4 ℃下8000 r · min-1离心清洗3次, 每次离心5 min.依次用30%、50%、70%、85%、95%、100%的乙醇进行梯度脱水(每次加入乙醇后振荡混匀静置15 min, 8000 r · min-1离心5 min, 弃上清液).乙酸异戊酯8000 r · min-1离心置换2次, 每次15 min.样品采用冷冻干燥机(FD-1D-50)在-55 ℃下冷冻干燥12 h.用导电胶将污泥样品固定在样品台上并镀金膜(Pt), 进行SEM观察.
2.4 污泥菌群结构分析为探究除磷颗粒污泥形成过程中微生物种群结构的变化, 对接种污泥及3个反应器中的成熟颗粒污泥进行16S rRNA基因高通量测序(上海美吉生物医药科技有限公司).采用Illumina Miseq PE300平台对污泥样品进行测序, 扩增区域为细菌16S rRNA基因V3~V4区, 引物为338F(5′-ACTCC TACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3′).扩增程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 27个循环；最后72 ℃延伸10 min.采用UPARSE软件, 根据97%的相似度对序列进行聚类分析, 并在聚类过程中去除单序列和嵌合体.利用RDP classifier对每条序列进行物种分类注释, 与Silva数据库进行比对, 之后对所得细菌分类信息进行多样性与群落组成分析.
3 结果与讨论(Results and discussion)3.1 污泥浓度及沉降性能变化如图 2所示, 运行初期3个反应器的MLSS迅速降低, 污泥流失较为严重, 经过13 d的培养, 分别由11975、11348和11057 mg · L-1降至4850、4510和4878 mg · L-1.这主要是由于颗粒污泥培养初期沉淀时间较短(30 min), 系统选择压较大, 导致较多的污泥絮体随出水排出.系统运行20 d左右, 菌群逐渐稳定, 性能好转.在20~90 d期间, 3个反应器的MLSS整体呈现R3>R2>R1的趋势.随着污泥的颗粒化, 在培养90 d后, 系统逐渐稳定, 3个反应器的MLSS维持在4000~5500 mg · L-1.
图 2(Fig. 2)
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| 图 2 3组反应器中MLSS、SVI5、SVI30和MLVSS/MLSS随时间的变化趋势 Fig. 2Trends of MLSS、SVI5、SVI30 and MLVSS/MLSS over time in three reactors |
伴随着除磷污泥的颗粒化, 污泥的SVI5和SVI30呈先增加后下降的趋势.刚接种的污泥沉降性能较好, SVI5分别为83.51、88.12和90.44 mL · g-1, SVI30分别为81.84、84.60和85.01 mL · g-1.培养初期污泥出现明显的膨胀现象, SVI急剧升高, R1、R2和R3系统的SVI30峰值可分别至181.87、212.01、183.73 mL · g-1.随着菌群逐渐适应新环境, 污泥沉降性能逐渐改善.R1、R2和R3系统SVI的下降速度依次加快, 120 d后R1和R2的SVI5下降并维持在50 mL · g-1上下波动, R3的SVI5数值略高(80 mL · g-1左右), 3个反应器的SVI30在45 mL · g-1上下波动.R3系统中后期, SVI5/SVI30(1.78左右)略大于R1和R2系统(1.11左右), 这是由于R3系统中小絮体的存在及成熟颗粒污泥的密实度相比R1、R2系统较低.Angela等(2011)指出, SVI5/SVI30值越接近1.0意味着污泥颗粒化程度越高.由此可知, 本研究3个系统均实现颗粒化, R1和R2系统的颗粒化程度略高于R3系统.
从整个培养阶段来看, 菌群从开始适应新环境(20 d)到运行100 d左右, R3的SVI30整体低于R1、R2.结合污泥的MLSS可以推测, 这种现象可能由R3系统进水中的大分子有机物引起.当可溶性淀粉和胰蛋白胨进入R3系统后, 它们被吸附在絮体表面并诱导系统中的游离细菌向污泥絮体靠拢, 同时这些大分子有机物可作为絮凝剂, 发挥“桥连和网捕”作用, 有利于形成较大的污泥聚集体.与之相似, 张杰等(2016)向富含VFA的模拟生活污水中投加淀粉, 借助淀粉的絮凝、吸附等作用加速除磷污泥的颗粒化.100 d后随着污泥的逐渐颗粒化, 淀粉的作用慢慢弱化, 3个系统的SVI30基本持平.
混合液挥发性悬浮固体浓度(MLVSS)是表征污泥中有机物含量的一个重要指标, 也可间接表示颗粒污泥中聚合磷酸盐和其他矿物质的含量(Li et al., 2014).接种污泥的MLVSS/MLSS仅为65%, 低于普通活性污泥.随着反应器的运行, MLVSS/MLSS开始增加, R1系统在第61 d达到最大值84.64%, R2和R3系统分别在第120 d和170 d达到最大值86.89%和87.77%.随着污泥的颗粒化, MLVSS/MLSS数值逐渐降低, R1和R2中颗粒污泥成熟后此数值维持在75%和80%左右, R3中污泥MLVSS/MLSS保持在85%左右.这表明小分子碳源使污泥的无机物含量较高, 而大分子碳源使污泥的有机物含量较高.
3.2 典型周期内污染物浓度变化图 3为典型周期内R1、R2和R3系统中污染物浓度及pH、DO的变化曲线.在进水阶段, 进水以推流式进入反应器, 与沉积在反应器底部的颗粒污泥充分接触, 并将上一周期已处理的水缓慢推移置换出反应器.此时的取样口为反应器顶部的出水口, 用以检测出水水质.由于边壁效应, 反应器存在少部分短流, 进水阶段各反应器出水口的COD、NH4+-N和PO43--P缓慢增加.在进水完成后, 3个反应器的COD分别为53.2、49.2和39.12 mg · L-1, NH4+-N分别为3.82、1.52和1.63 mg · L-1, PO43--P分别为5.67、3.41和4.25 mg · L-1.反硝化主要在此阶段进行, 进水阶段末期3个反应器的NO3--N分别降低至9.06、14.73和13.91 mg · L-1, 几乎无NO2--N产生.需要指出的是, 在厌氧进水阶段, 尤其是进水初期, 由于污水中的磷尚未由反应器底部上升至出水口, 故磷浓度比较低(初时零时刻).在此阶段, 进水中的污染物和污泥释放的磷主要聚集在反应器的下半部分.
图 3(Fig. 3)
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| 图 3 R1、R2和R3反应器稳定运行典型周期内污染物浓度及反应器中DO、pH变化 (a、b为R1, c、d为R2, e、f为R3) Fig. 3Variations of concentrations of pollutants and DO, pH during one cycle of stable operation in R1, R2 and R3 |
进入曝气阶段, 在空气的水力搅拌作用下, 反应器下半部分高浓度的污染物和污泥与上半部分水质较好的上清液均匀混合, 系统中COD、NH4+-N和磷的浓度急剧升高.曝气后各反应器COD持续降低, 周期末COD分别为35.80、37.96和28.88 mg · L-1, COD去除率分别为91.05%、90.51%和92.78%.在曝气初期, R1的NH4+-N含量远高于其他两个反应器, 这是由于R1中的氮源为NH4Cl, 而R2、R3中有50%的氮由胰蛋白胨提供, 在厌氧阶段胰蛋白胨水解不完全导致水相NH4+-N含量低于R1.到好氧末期各反应器的NH4+-N基本消耗殆尽, NH4+-N去除效率达99%以上.NO2--N浓度只在好氧初期出现轻微增加, 随后立即转化为NO3--N, R1、R2和R3中的氮主要以NO3--N形式存在.在整个好氧阶段, R1、R2和R3的NO3--N浓度整体上依次降低, 大分子有机物似乎有利于同步硝化反硝化的进行.曝气初期各反应器中PO43--P浓度分别为16.04、13.55和11.92 mg · L-1, 可见随着大分子有机物的增加, R1、R2和R3系统在厌氧阶段的释磷量依次减少.这可能由于在厌氧进水和静置阶段, R2和R3系统的胰蛋白胨和可溶性淀粉需要进一步水解发酵才能被聚磷菌利用, 导致聚磷菌在与其他细菌对有机物的竞争中处于劣势, 污泥的释磷量较低.在整个好氧阶段, PO43--P浓度不断下降, 至好氧末期PO43--P浓度分别降至0.46、0.34和0.08 mg · L-1, 去除率达95%以上.
在进水和静置阶段, R1、R2和R3反应器的DO浓度均在0.02 mg · L-1以下, 由于有机物在污泥的作用下发生水解发酵, 3个反应器的pH在厌氧末期分别降至8.16、7.99和7.65, R2和R3系统的水解酸化更为强烈.进入曝气段后DO值骤升, 最终维持在8.5 mg · L-1左右.由于有机酸的利用和CO2的吹脱作用, 3个反应器的pH逐渐升高至8.70、8.65和8.45.在周期末的沉淀和排水阶段, pH值有略微降低, 这可能由污泥的发酵作用所致.
3.3 除磷颗粒污泥的外观形态在絮体污泥颗粒化的过程中, 不同碳源条件下污泥形态存在明显差异(图 4).接种污泥结构分散、凝聚性较差, 丝状菌穿插在小絮体内部, 污泥絮体以丝状菌为骨架.运行一段时间后丝状菌减少, 絮状污泥逐渐消失, 污泥结构较为密实, 呈现出集聚趋势, R1、R2和R3反应器在运行40 d左右开始出现细小的颗粒污泥雏形(图 4a、4d和4g).120 d时, R1、R2反应器的污泥粒径均小于临界粒径200 μm(de Kreuk et al., 2007) (图 4b和4e), 虽然颗粒污泥雏形较为密实, 但就粒径而言尚未完全颗粒化；R3反应器内污泥的平均粒径为200 μm, 可认为此时已形成颗粒污泥(图 4h).可见, 大分子有机物有利于除磷污泥的凝聚, 污泥的颗粒化速度随大分子有机物含量的增多而加快, 经过120 d的培养R3反应器最先实现颗粒化.此后, 各系统中颗粒污泥粒径随培养时间逐渐增大.由于基质种类的差别, R1、R2和R3系统中颗粒污泥的增长速度依次减小.200 d后, 3个系统颗粒污泥的平均粒径分别可达500、400和300 μm, 成熟除磷颗粒污泥个体以椭球形为主, 密实度较高, 外观轮廓清晰(图 4c、4f、4i).
图 4(Fig. 4)
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| 图 4 除磷颗粒污泥的形态变化 (a~c. R1中培养40、120、200 d；d~f. R2中培养40、120、200 d；g~i. R3中培养40、120、200 d) Fig. 4Formation and evolution of the aerobic granular sludge |
R1中颗粒污泥球形度更高, 边界光滑, 且系统中小絮体少(图 4c).R2中颗粒污泥的球状小凸起不断演变, 最终的成熟颗粒污泥呈现出花椰菜状(图 4f).R3反应器中颗粒污泥粒径受限, 经过200 d的培养粒径最大只达到300 μm左右, 且污泥密实度相对R1和R2中较低, 存在孔隙和通道(图 4i).这是由于R3系统中碳源为缓慢降解有机物, 需要在细胞外进一步水解为小分子有机物才能被微生物吸收和利用(Zhang et al., 2016), 有机物的水解速率限制了颗粒核心部位微生物对底物的吸收, 同时不利于胞外聚合物(EPS)的分泌, 阻碍了粒径的增长.此外, R2、R3的成熟颗粒污泥系统中有少量的絮体污泥(图 4f和4i).推测这是因为大分子有机物缓慢的水解发酵速率使其难以在厌氧段被完全转化为VFA并储存于胞内, 絮体污泥的存在可以为大分子有机物提供更多的附着点, 因此, 絮体污泥和颗粒污泥可能对有机物的降解存在协同关系.
3.4 除磷颗粒污泥SEM分析采用SEM对成熟除磷颗粒污泥的表面形貌进行观察(图 5). 以NaAc(R1)为进水碳源形成的除磷颗粒污泥表面相对光滑、密实, 颗粒污泥主要由球菌组成(图 5a).当以大分子有机物作为部分或全部碳源时(R2和R3), 除磷颗粒污泥表面均呈毛毯状.R2系统中颗粒污泥以丝状菌为骨架, 短杆菌和球菌在丝状菌的骨架中聚集生长(图 5b).R3系统的颗粒污泥中杆菌、球菌和丝状菌均有分布, 结构相对松散, 污泥表面有大量孔道, 为基质的输送提供通道(图 5c).此外, R2和R3系统原生动物和后生动物数量较多, 包括钟虫、轮虫和红斑瓢体虫等(图 4e、4h和图 5b、5c), 这些原生和微型后生动物有利于大分子有机物和游离细菌的去除(Cetin et al., 2018).
图 5(Fig. 5)
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| 图 5 不同碳源条件下的除磷颗粒污泥SEM照片 (a.R1, b.R2, c.R3) Fig. 5SEM photographs of aerobic granular sludge under different carbon source conditions |
3.5 污泥菌群结构分析3.5.1 多样性分析将接种污泥和成熟期颗粒污泥进行16S rRNA基因高通量测序, 对序列进行质量控制后, 按差异水平为3%以内进行比对得到各样品所含操作分类单元数量(OTU), 结果见表 3.接种污泥、R1、R2和R3系统污泥分别含有960、401、450和213个OTU.韦恩图分析显示, R1与R2存在267个相同的OTU, R1与R3存在119个相同的OTU, R2与R3只存在138个相同的OTU, 说明R1与R2的相似度更高.此外, 接种污泥、R1、R2和R3系统污泥的Shannon指数分别为5.36、3.29、3.99和2.76, 污泥菌群多样性排序为：接种污泥>R2>R1>R3.可见, 处理实际污水的接种污泥具有更高的生物多样性, 适量增加大分子有机物可以满足更多类型细菌的生存, 进而增加污泥菌群的多样性, 而100%的大分子有机物会降低菌群的多样性.这可能由于大分子有机物需要先吸附水解才能被大部分微生物代谢利用, 对微生物的生存产生了较大的选择压.
表 3(Table 3)
| 表 3 污泥样品菌群多样性指数 Table 3 Bacterial diversity index of sludge samples | |||||||||||||||||||||||||
表 3 污泥样品菌群多样性指数 Table 3 Bacterial diversity index of sludge samples
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3.5.2 细菌群落分布特征分析在门水平, 选择相对丰度大于1%的门进行丰度变化分析, 其余细菌归为其它(others)(图 6a).变形菌门(Proteobacteria) 在接种污泥和3个成熟颗粒污泥系统中均为优势菌门, 分别为23.97%、39.89%、56.57%和31.45%.3个系统中成熟颗粒污泥的优势菌门具有较大差异, 除变形菌门外(Proteobacteria), 在R1中优势菌门主要为拟杆菌门(Bacteroidetes)和酸杆菌门(Acidobacteria), 占比分别为10.38%和42.45%；R2中的优势菌门为拟杆菌门(Bacteroidetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)和放线菌门(Actinobacteria), 占比分别为14.41%、10.93%和7.55%；R3中的优势菌门为拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria), 占比分别为33.65%和24.41%.在3个系统中厚壁菌门(Firmicutes)和绿弯菌门(Chloroflexi)基本被淘汰出系统, 颗粒污泥成熟以后二者在反应器中的比例均低于0.5%.
图 6(Fig. 6)
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| 图 6 细菌门水平(a) 及属水平(b) 的群落结构分析 Fig. 6Analysis of bacterial community at phylum(a) and genus(b) level |
在R1和R2中酸杆菌门(Acidobacteria)的相对丰度分别由接种污泥的8.17%增加至42.44%和10.93%, 而在R3中其占比仅为0.04%.在R2和R3中放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度分别由接种污泥的5.12%增加至7.54%和24.41%, 这类细菌能分泌降解复杂多糖的胞外酶(Větrovsky et al., 2014), 可能在大分子有机物的降解中发挥重要作用.拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度在接种污泥、R1和R2系统污泥中无明显差异, 而在R3中的占比由17.31%上升至33.65%.由此猜测, NaAc这类小分子有机物的存在会促进酸杆菌门(Acidobacteria)的生长, 而胰蛋白胨和淀粉这类需水解发酵的大分子有机物的存在会促进拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobact-eria)的生长.此外, 大分子有机物还促进了Patescibacteria的生长, 抑制了浮霉菌门(Planctomycetes)的生长.Li等(2019)在以低高径比SBR反应器进行缺氧/好氧运行的研究中, 以NaAc为碳源时变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为系统的优势菌门, NaAc并没有促进酸杆菌门(Acidobacteria)的生长；当以淀粉为碳源时会促进Patescibacteria的生长, 但对放线菌门的影响较小(Actinobacteria).Sharaf等(2019)以NaAc为碳源单一好氧条件培养颗粒污泥, 系统中的优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes).上述结果与本研究存在一定差异.可见, 好氧颗粒污泥的菌群结构可能受碳源种类和运行工况等多种因素的共同影响.
在属水平上进一步筛选相对丰度大于1%的属进行分析.如图 6b所示, 接种污泥中微生物种群比较丰富, 其中, norank_o_Saccharimonadales、norank_f_saprospiraceae、norank_f_A4b为优势菌属, 相对丰度分别为7.78%、7.34%和4.37%.R1中norank_f_Blastocatellaceae的占比最高, 为27.69%；其次为Blastocatella和Defluviicoccus, 分别占11.67%和11.00%. R2中Defluvvimonas、Sphingorhabdus、Sphingopyxis和Blastocatella为优势菌属, 占比分别为9.86%、9.13%、8.56%和3.92%.在R3中Cloacibacterium、Tessaracoccus和Spingomonas占比相对较高, 分别为28.81%、13.53%和11.89%. norank_f_Blastocatellaceae、Blastocatella在以前的文献中很少报道, 这两种菌在成熟颗粒污泥中的积累表明其可能会促进除磷颗粒污泥的形成.进一步从进水基质的角度分析, 以乙酸盐为碳源的系统可能有利于norank_f_Blastocatellaceae和Blastocatella的富集.这与镜检照片中R1和R2的颗粒污泥粒径较大且密实度更高相一致.
3.5.3 功能菌群分析将检测出的功能菌群进行分类, 详见表 4.Candidatus_Microthrix(Fan et al., 2020)和norank_o_Microthrichales是接种污泥中特有的丝状菌, 在3个系统中均未检测到.接种污泥中还存在norank_f_saprospiraceae, 属于腐螺旋菌科, 相对丰度为7.34%.Xia等(2008)指出腐螺旋菌科通常附着在丝状菌和其它细菌的表面, 主要进行蛋白质的水解, 可为反硝化菌和其它细菌提供氨基酸等碳源, 在反硝化过程中具有重要作用.在接种污泥中还检测到传统聚糖菌Candidatus Competibacter(Rubio-Rincon et al., 2017), 所占百分比为4.09%, 而在R1、R2和R3中均未出现, 在培养过程中Candidatus Competibacter被淘汰出系统外.R1系统中检测到Defluviicoccus这种传统聚糖菌, 有研究表明, 在以乙酸盐培养的好氧颗粒污泥中, Defluviicoccus为主要微生物(Pronk et al., 2017b), 在厌氧条件下将VFA合成为聚羟基烷酸酯(PHAs)储存在细胞中, 在好氧条件下分解PHAs用于补充糖原和细胞生长, 不进行磷的累积(Li et al., 2020), 并且此种聚糖菌可利用硝酸盐作为电子受体进行反硝化(Wang et al., 2014b；Onetto et al., 2019).系统中未检测到传统的聚磷菌Candidatus Accumulibacter, 但在R3系统中检测到Tessaracoccus且具有较高的相对丰度(13.53%), 一些****将Tessaracoccus推定为聚磷菌PAOs(Nielsen et al., 2019), 但经过试验发现它的除磷能力很低(Mads et al., 2015；Mikkel et al., 2017).考虑到R3系统的基质为大分子有机物, 需要进一步的水解、发酵才能被代谢利用, 推测Tessaracoccus可能是发酵型PAOs, 该菌的具体功能和代谢途径需做进一步研究.Tetrasphaera是EBPR系统中常见的PAOs(Qiu et al., 2019), 与Candidatus Accumulibacter不同的是, 大多数Tetrasphaera只有一小部分亚种可以吸收VFA, 但可以利用葡萄糖和氨基酸, 并且能够发酵复杂的有机物和积累发酵副产物, 而不以PHAs的形式存储(Marques et al., 2017).本研究的3个系统中未发现Tetrasphaera的存在, 但在胰蛋白胨的R2系统及胰蛋白胨和可溶性淀粉的R3系统中检测出其所属的科Intrasporangiaceae, 相对比例分别为3.05%和2.71%.
表 4(Table 4)
| 表 4 系统中存在的功能菌群 Table 4 Functional bacteria present in the system | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
表 4 系统中存在的功能菌群 Table 4 Functional bacteria present in the system
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结合前文分析, 成熟颗粒污泥中MLVSS/MLSS分别为75%、80%和85%左右, R1中颗粒污泥的有机物含量更低, 3个系统的除磷效率达95%以上.从菌群丰度来看, 3个系统中无传统聚磷菌Candidatus Accumulibacter, 因此推测系统可能存在一部分未知的除磷菌群, 此外, 化学除磷也可能对污泥的磷累积发挥重要作用.
norank_o_Saccharimonadales在接种污泥、R2、R3系统污泥中有较高的丰度, 它与糖的代谢有关, 是系统中水解发酵大分子有机物的主要微生物(Liu et al., 2020).系统中还存在Terrimonas和Flavobacterium这些具有水解功能的菌属, 但其占比均较低.另外, 在R3系统污泥中还检测到较大比例的Cloacibacterium(28.81%), 它与Flavobacterium同科, 在功能上具有相似性.已有研究表明, Flavobacteriaceae在活性污泥及废水处理厂中很常见, 在对复杂有机物的水解中起重要作用(Allen et al., 2006).据此可以推测, Cloacibacterium在R3系统中会水解胰蛋白胨和可溶性淀粉这些大分子有机物.
EPS是污泥的重要组成部分, 影响着污泥的絮凝性能、沉降性能、脱水性能及颗粒污泥的稳定性.Flavobacterium(Flavobacteriaceae科)和Sphingopyxis(Sphingomonadaceae科)能够产生EPS, 在维持颗粒污泥的稳定性方面起着重要作用(Wang et al., 2018a).一些研究指出, Flavobacteriaceae和Sphingomonadaceae这两个科的细菌在好氧颗粒污泥系统中与EPS的形成有关(Xia et al., 2018；Schambeck et al., 2020).在3个系统中Flavobacteriaceae科的占比分别为0.62%、1.76%、0.84%, Sphingomonadaceae科的占比分别为2.65%、22.21%和12.09%, 这些菌种可以通过分泌EPS促进除磷污泥的颗粒化.在颗粒污泥中脱氮是通过各类硝化、反硝化细菌共同完成的.在3个系统中仅发现Nitrospira这种亚硝酸盐氧化细菌(NOB)的存在, 而未检测到传统氨氧化细菌(AOB).虽然系统中检测到的传统硝化细菌占比少, 但并未影响氨氮和亚硝氮的氧化.较高的DO及较少的反硝化菌(DNB)和反硝化聚磷菌(DNPAOs)导致NO3--N的积累, 3个系统相比而言, R3系统中DNB和DNPAOs的比例较高(表 4), 故反硝化效果更好, 这一点与NO3--N的去除效果相对应.
4 结论(Conclusions)1) 可溶性淀粉作为絮凝剂可加快絮体的集聚, 使污泥颗粒化速率更快, R3系统中颗粒污泥的粒径和密实性低于R1、R2系统.以NaAc单一碳源培养的颗粒污泥(R1)表面相对光滑, 球菌大量富集, 而以大分子有机物为碳源的R2、R3系统中污泥表面结构较松散, 呈毛毯状, 大分子有机物有利于丝状菌的生长.
2) 不同碳源种类会造成颗粒污泥中菌群结构的差异, NaAc会促进酸杆菌门(Acidobacteria)的生长, 而胰蛋白胨和淀粉这类需水解发酵的大分子有机物有利于拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)的生长.
3) norank_f_Blastocatellaceae、Blastocatella和norank_o_Saccharimonadales这种菌可能会促进除磷颗粒污泥的形成, 乙酸盐有利于norank_f_Blastocatellaceae和Blastocatella的富集, 而大分子有机物有利于norank_o_Saccharimonadales的生长.Defluviicoccus这一偏好乙酸盐的聚糖菌为R1系统中的优势菌种, 3个系统中已知种属的聚磷菌只占较小比例, 但并不影响系统的除磷效率(95%以上), 系统中可能存在一部分未知的聚磷菌群, 并可能发生了化学除磷.在以大分子有机物为碳源的R3系统中, 水解菌Cloacibacterium及潜在的发酵型聚磷菌Tessaracoccus为其优势菌属.3个系统中均未检测到传统聚磷菌Candidatus Accumulibacter.
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