史雅静¹, 徐明², 王振宇¹, 庞月¹, 张改琴¹, 贾媛媛¹, 李秀超¹, 方永俊¹, 韩雪松¹, 赵秋伶¹
1. 辽宁科技学院生物医药与化学工程学院, 辽宁省生物医药与化学工程重点实验室, 本溪 117004;
2. 本钢板材股份有限公司, 本溪 117000
收稿日期: 2019-11-27; 修回日期: 2019-12-30; 录用日期: 2019-12-30
基金项目: 辽宁省大学生创新创业训练资助项目（No.201811430060）；国家自然科学基金青年基金资助项目（No.41701300，21702086）；辽宁省自然科学基金指导计划资助项目（No.201601338）
作者简介: 史雅静(1963-), 女, 教授, E-mail:shiyajing_yh@lnist.edu.cn
通讯作者（责任作者）: 史雅静(1963—), 女, 教授, 研究方向为环境生态毒理学, 有机固体废弃物资源化.E-mail:shiyajing_yh@lnist.edu.cn

摘要：为了探索农业废弃香菇菇渣"减量化、无害化、资源化"循环化利用的有效途径.本实验按照不同碳氮比设置菇渣混合基质，接种蚯蚓（Eisenia foetida）对其进行生物转化.实验培养56 d，每14 d取样，分别测定了总氮、总有机碳、木质素和纤维素含量，脲酶、蔗糖酶、纤维素酶和多酚氧化酶活性变化情况，以及菇渣生物转化前后的结构变化情况（扫描电子显微镜SEM）和生物转化产物浸提液的发芽率等指标.结果显示：在蚯蚓生物转化过程中，各处理组总氮、总有机碳和木质纤维素含量与处理前相比均有不同程度的降低，其中，碳氮比为25的处理组纤维素和木质素的降解率最高，分别为50.06%和77.01%；各个处理组中脲酶、蔗糖酶、纤维素酶和多酚氧化酶活性呈不同程度的变化趋势，其中，碳氮比为25的处理组纤维素酶活性增加最多，增加了81.25%；扫描电镜结果显示，蚯蚓生物转化可以将菌渣碎片化；另外，蚯蚓堆肥产物浸提液可以提高黑麦草发芽率.综上，推测碳氮比为25的蚯蚓生物转化体系更有利于菇渣基质处理.
关键词：菇渣蚯蚓生物转化纤维素木质素
Biotransformation of lignocellulose in mushroom residue by earthworm
SHI Yajing¹, XU Ming², WANG Zhenyu¹, PANG Yue¹, ZHANG Gaiqin¹, JIA Yuanyuan¹, LI Xiuchao¹, FANG Yongjun¹, HAN Xuesong¹, ZHAO Qiuling¹
1. Provincial Key Laboratory of Biomedical and Chemical Engineering, School of Biomedical and Chemical Engineering, Liaoning Institute of Science and Technology, Benxi 117004;
2. Bengang Steel Plates Co., Ltd., Benxi 117000
Received 27 November 2019; received in revised from 30 December 2019; accepted 30 December 2019
Abstract: In order to explore the effective method of recycle utilization of mushroom (Shii-take) residue, the mixtures of mushroom residue with different carbon and nitrogen (C/N) ratios were prepared, and the earthworms (Eisenia foetida) were inoculated for biotransformation. Briefly, the earthworms were inoculated into the mixtures of mushroom residue with different C/N ratios and cultivated for 56 days, and the samples were collected every 14 days. Then, the contents of total nitrogen, organic carbon, lignin and cellulose in samples were determined; the activities of urease, invertase, cellulase and polyphenol oxidase in samples were examined; the structure of the mushroom residue was analyzed by scanning electron microscopy (SEM); and the germination rates of ryegrass treated with the extract derived from above mixtures were also examined. Consequently, after being treated with earthworms, the contents of total nitrogen, organic carbon, lignin and cellulose in samples of all treated groups had significant decreases. Especially in the treated group with C/N ratios 25, in which the degradation rates of cellulose (50.06%) and lignin (77.01%) reached to the lowest level in all treated groups. Simultaneously, the activities of urease, invertase, cellulase and polyphenol oxidase in samples of all earthworms-treated groups were enhanced significantly, and also in the treated group with C/N ratios 25, the activities of enzymes reach to the highest level (up to 81.25%) in all treated groups. Additionally, the results of SEM demonstrated that the earthworms can promote the fragmentation of mushroom residue, also the extract derived from earthworms treated mixtures can improve the germination rates of ryegrass. Conclusively, it reasonably speculates that earthworms derived biotransformation contribute to the treatment of mushroom residue, and the mixture with C/N ratios 25 is optimal for earthworms derived biotransformation.
Keywords: mushroom residueearthworm biotransformationcelluloselignin
1 引言(Introduction)我国是食用菌的第一大生产国(Gao et al., 2015).据统计, 2016年我国食用菌总产量达3597×10⁴ t, 占世界总产量的70%, 按照食用菌生物学利用率40%计算, 每年至少会产生约5395×10⁴ t菇渣(周祥等, 2018；郑玉权等, 2019).香菇是人们喜爱的食用菌种类, 据中国食用菌商务网对全国香菇主产区的不完全统计数据显示, 2018年全国香菇总产量达961.51×10⁴ t, 每年约有1442×10⁴ t的菇渣产生.由于这些农业废弃物中含有大量未被利用的木质纤维素, 存在环境污染和资源浪费等问题(焦蕊等, 2009).因此, 研究生物转化降解木质纤维素对促进生物质的高效利用、减轻环境污染有着极其重要意义.目前, 对木质纤维素的处理大多集中在降解菌剂的筛选及资源化应用方面(宋汉英等, 1985；米青山等, 2008；韩道杰等, 2014；马志良等, 2015；桑羽希等, 2019), 而利用蚯蚓对菇渣废弃物中木质纤维素进行生物及高值化应用的研究较少.
有研究显示, 利用蚯蚓处理农业废弃物的效果显著, 可将多数农业废弃物转化为腐殖质, 从而有效降低固体废弃物带来的环境危害和风险(金波等, 2009；王国锋等, 2013；Nurhidayati et al., 2018；熊娟等, 2018).木质纤维素是生物质的一大种类, 包括纤维素、半纤维素及木质素组成的生物质, 是构成细胞壁的主要成分(林燕萍, 2018).木质纤维素也是光合作用产生的有机碳的最大量积累形式, 其稳定的性质使其难以被利用, 即使采用传统堆肥处理可以使部分木质纤维素降解(徐杰等, 2018), 但需要的时间较长(Abbasi et al., 2018).因此, 提高木质纤维素的降解效率是生物质能源利用的关键瓶颈之一, 而且含有大量未被分解木质纤维素的菇渣废弃物的随意堆放(周祥等, 2018), 不仅占用大量空间, 还会引起病菌积聚、害虫滋生, 进行而严重危害人类健康(黄国峰等, 2001；Dai et al., 2018).因此, 农业固体废弃物中木质纤维素的转化利用一直是人们关注的热点之一.
本研究拟通过接种蚯蚓处理不同C/N比的菇渣与猪粪混合基质, 在非堆肥情况下连续培养56 d, 通过测定混合基质的理化性质、纤维素和木质素含量及相关酶活性等指标, 研究蚯蚓生物转化菇渣与猪粪混合基质的潜力, 为进一步研究菇渣等农业废弃物还田和高值化利用提供理论依据.
2 材料与方法(Materials and methods)2.1 材料处理猪粪和香菇均采自学校周边农户, 将采集的猪粪和菇渣样本自然风干, 粉碎后过2 mm筛, 备用.本研究以处理香菇菌渣为目的, 采用蚯蚓介导的堆肥使用方法, 优化猪粪添加量, 实现更高效处理香菇菌渣的效果.香菇菌渣和猪粪的含碳量分别为193.3 g·kg^-1和259.0 g·kg^-1, 含氮量分别为68 g·kg^-1和202 g·kg^-1.试验中蚯蚓选用赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)对菇渣混合基质进行生物转化.黑麦草(Lolium perenne.sp)购自富友种子农药肥料公司.
2.2 试验设计本研究共设置5个处理组, 其中, 单纯香菇渣处理组为对照(CK), 香菇渣和猪粪分别按照C/N比为30、25、20、15进行混合配比并设置处理组MD1、MD2、MD3和MD4, 每处理组设置15个重复.将配置好的300 g菇渣混合基质装入1000 mL的大烧杯中, 基质湿度为60%, 预先培养1周.将体重在0.35~0.50 g之间成熟度接近的蚯蚓接种到5个处理组, 接种量为3~4 g/100 g菇渣混合基质(约10条), 将烧杯口用2层纱布盖好, 于人工气候箱在25 ℃和相对湿度60%条件下培养56 d, 分别于蚯蚓处理的第0(放蚯蚓前)、14、28、42和56 d, 破坏性取样, 每个处理组每个采样时间点选取3个重复, 测定相关指标.
2.3 测定方法采用电位法测定pH值(鲍士旦, 2000)；采用凯氏定氮法测定总氮；采用重铬酸钾氧化-分光光度法测定有机碳；采用苯酚钠比色法测定脲酶(关松荫, 1980)；采用3, 5-二硝基水杨酸比色法测定蔗糖酶、羧甲基纤维素酶(周颖, 2009)；采用邻苯二酚比色法测定多酚氧化酶(黄赫雁等, 2016)；采用氧化还原法测定纤维素、木质素含量(熊素敏等, 2005).
采用不同蚯蚓生物转化堆肥产物的1.25%水提液处理100粒黑麦草(Lolium perenne sp.)种子, 根据公式计算种子发芽率：R=(N/100)×100%(其中, R为种子发芽率, N为发芽的种子数), 每处理3个平行.
扫描电镜观察：样品经过处理干燥后, 放置在导电胶带上, 清除未粘牢的样品后喷金, 采用扫描电子显微镜(Thermo Fisher, Quanta 250)进行观察.
2.4 数据分析采用Excel 2016软件对数据进行处理和作图；运用SPSS19.0统计软件进行单因素分析(ANOVA)和最小显著差异分析(LSD), 不同处理间差异显著性定义为p＜0.05.
3 结果与讨论(Results and discussion)3.1 蚯蚓生物转化过程中总氮和总有机碳含量的变化在蚯蚓生物转化过程中, 各菇渣混合基质处理中总氮和总有机碳含量变化见图 1.在蚯蚓生物转化过程中, 菇渣混合基质各处理中总氮含量均呈下降趋势, 对照组(CK)在第14 d时达到最低值, 并且持续到试验结束, MD1处理组下降幅度最大, 下降了33.04%(p＜0.05).大量研究证实, 蚯蚓可以促进有机废弃物的生物转化(Wani et al., 2013；王国锋等, 2013；许晓玲等, 2018), 从而促进有机大分子向小分子的转化, 生成腐殖酸和各种生物酶类物质, 生成吲哚乙酸和赤霉素等植物生长因子.分析总氮含量的减少原因, 可能是由于蚯蚓影响了混合基质中氮的存在形式, 一部分氮供蚯蚓自身生长和繁殖的需要, 另一部分氮的矿化速率受到蚯蚓的影响, 例如蚯蚓加速了铵态氮到硝酸盐的转化, 使总氮含量下降(邱江平等, 1999；王国锋等, 2013).
图 1(Fig. 1)

图 1 蚯蚓生物转化过程中总氮和总有机碳的变化 (不同小写字母表示相同处理时间不同处理之间差异显著(p < 0.05), 下同) Fig. 1Contents of total nitrogen and total organic carbon in mushroom residue during earthworm biotransformation

在蚯蚓生物转化过程中, 各处理的总有机碳含量与试验初期相比均有不同程度降低, 其中, MD2处理在试验后期有机碳含量与培养初期(第0 d)相比下降幅度最大, 达到19.67%(p＞0.05).第42 d和56 d, 各处理组中总有机碳含量基本恒定, 差异不显著(p＞0.05).总有机碳的变化情况表明蚯蚓会调节总有机碳向趋同的方向发展.本研究结果与相关研究结果一致(刘佳等, 2012；王国锋等, 2013), 这可能是由于蚯蚓生物转化菇渣混合基质过程中, 培养初期, 蚯蚓利用易于降解的有机物分解转化成CO₂、H₂O、矿物质和稳定的腐殖酸并为自身提供必要的生长物质, 有机碳的分解速度较快；而到后期, 随着易分解物质被完全降解之后, 蚯蚓和微生物只能利用较难降解的有机物(如木质纤维素等)作为营养物质(刘佳等, 2012；马丽娜, 2017), 因此, 蚯蚓处理后期有机碳的降解速度相对缓慢.
3.2 蚯蚓生物转化过程中纤维素和木质素的变化在蚯蚓生物转化过程中, 各菇渣混合基质处理中纤维素和木质素含量的变化如图 2所示.在生物转化过程中, 蚯蚓降解纤维素的效率各不相同.第28 d时, 各处理的纤维素含量与初始相比明显减少, 到第56 d时, MD2、MD3处理中的纤维素降解率分别达到峰值, 为50.06%和48.37%.纤维素含量下降可能是由于加入了猪粪, 补充了氮源, 促进了蚯蚓和微生物的生长.研究表明, 不同含量的氮素添加会影响蚯蚓降解木质纤维素能力(展漫军等, 2013；邓艳芹等, 2017).其中, MD2体系的降解效果最好, 由此推测在菌渣基质中C/N=25的条件下, 蚯蚓处理菌渣基质中纤维素的降解效果最佳.
图 2(Fig. 2)

图 2 蚯蚓生物转化过程中纤维素和木质素含量的变化 Fig. 2Contents of cellulose and lignin in mushroom residue during earthworm biotransformation

各菇渣混合基质处理组中木质素的含量变化与纤维素含量变化相似.第42 d时, 各处理的木质素含量与第56 d时基本一致, 均明显低于对照组(p＜0.05).其中, MD2处理的木质素降解效果最明显, 相比试验初期(第0 d)木质素降解率达到了77.01%.已有研究表明, 木质素是由苯丙烷单元通过醚键和碳碳键连接而成的聚酚类三维网状高分子芳香族化合物, 在植物内有具有防止生物降解的功能, 其降解困难(苏同福等, 2007；王小珊等, 2014；谢长校等, 2015).本试验显示, 利用蚯蚓生物处理对木质素进行降解, 可以明显提高木质素的降解效率.可能的原因是蚯蚓生物转化菇渣混合基质过程中, 蚯蚓通过粘液的分泌来为微生物提供碳源, 这些微生物又能通过降解有机物来为蚯蚓提供营养和能量物质(邓艳芹等, 2017), 从而达到酶解纤维素类物质的目的, 特别是在接种蚯蚓以后, 在蚯蚓、微生物和酶的联合作用下能更有效地降解木质纤维素(金波等, 2009).因此, 推测本研究中的MD2条件更有利于木质纤维素的降解.
同时, 本实验各处理组木质纤维素降解率为40%~77%, 而传统堆肥木质纤维素降解率为20%~30%(徐杰等, 2018), 表明蚯蚓堆肥更有利于木质纤维素的降解.由此推测, 蚯蚓堆肥更有利于菌渣生物转化.
3.3 蚯蚓生物转化过程中4种酶活性的变化本试验中, 菌渣基质中剩余大量未被香菇降解的木质纤维素, 其结构稳定难以降解, 易引起环境污染和资源浪费(田朝光等, 2010；熊娟等, 2018).自然界中, 除了由真菌分泌酶降解木质纤维素以外, 土壤及动物消化道微生物也可以降解木质纤维素(Carlile et al., 2001).
本研究在不同碳氮比处理下构建最优的蚯蚓生物转化菌渣基质的体系, 通过酶活性变化推测体系中有机物转化的变化情况, 从而筛选蚯蚓生物转化菌渣基质的最佳模式.在蚯蚓生物转化菇渣混合基质过程中, 各处理中脲酶、蔗糖酶、纤维素酶、多酚氧化酶活性的变化如图 3所示.
图 3(Fig. 3)

图 3 蚯蚓生物转化过程中脲酶(A)、蔗糖酶(B)、纤维素酶(C)和多酚氧化酶(D)活性变化情况 Fig. 3The activities of urease(A), sucrase(B), cellulase(C) and polyphenol oxidase(D) in mushroom residue during earthworm biotransformation

从图 3A中可知, 经蚯蚓生物转化56 d, 各处理脲酶活性总体均呈下降趋势, 相比试验初期(第0 d)下降幅度为22.7%~33.04%.这与许晓玲等(2018)利用蘑菇渣和禽畜粪便复配蚯蚓堆肥过程中脲酶活性的变化趋势一致.从图 3B中可知, 蚯蚓生物转化菇渣过程中蔗糖酶活性大小依次为MD4＞MD3＞MD2=MD1=对照组.这与周东兴等(2019)利用蚯蚓堆制生物处理猪粪过程中蔗糖酶活性的变化趋势相似.从图 3C中可知, 蚯蚓生物转化菇渣过程中, 各处理组的纤维素酶活性显著高于对照组(p＜0.05)(除MD2处理在第14 d时与对照组接近), 纤维素酶活性的变化与纤维素的降解程度相一致(见3.2节). MD3处理的纤维素酶活性最大, 达到0.45 U·g^-1.从图 3D中可知, 蚯蚓生物转化菇渣过程中, 各处理组的多酚氧化酶活性显著高于对照组(p＜0.05), 其变化情况与纤维素酶相比存在一定的滞后性.分析其原因可能是大部分木质素的降解发生在纤维素降解之后, 蚯蚓促进更多的多酚氧化酶产生降解酚类物质而减小其毒性所致(Ganesh et al., 2009；Alteio, 2014).
综上, 在整个蚯蚓生物转化菇渣混合基质过程中, 基质的脲酶、蔗糖酶、纤维素酶和多酚氧化酶活性均有有不同程度的提高.由此推测, 蚯蚓介导的堆肥处理可进一步促进香菇菌渣体系中剩余的难以降解的木质纤维素的分解, 加速了难降解类有机碳的周转, 从而有效保护环境, 实现其资源化.
3.4 蚯蚓生物转化过程中pH的变化pH值是影响微生物活性的主要因素之一, 也是用于微生物环境评估的重要参数(许晓玲等, 2018).在蚯蚓生物处理前后, 各菇渣混合基质中pH的变化如图 4所示.从图 4可知, 第0 d各处理组的pH值为8.7~8.8, 随着蚯蚓处理时间的延长, pH总体均呈下降趋势, 与CK组相比, MD4处理的pH值降低幅度最大(p＜0.05), 后期(第56 d)达到最小值7.6, 接近中性.本研究中菇渣混合物料的pH值总体呈下降趋势, 到实验后期接近中性, 可能是由于添加的猪粪有机肥中含有尿素等物质, 其硝化反硝化后会导致系统pH降低(张永春等, 2010).
图 4(Fig. 4)

图 4 蚯蚓生物转化过程中pH的变化情况 Fig. 4The pH values in mushroom residue during earthworm biotransformation

3.5 不同蚯蚓生物转化产物对植物发芽率的影响不同蚯蚓生物转化菇渣混合基质处理后的产物对黑麦草发芽率的影响如图 5所示.实验结果表明, 不同蚯蚓生物转化堆肥产物的1.25%水提液对黑麦草种子发芽均具有促进作用(p＜0.05).其中, MD2处理(C/N为25)黑麦草的发芽率最高, 较清水处理高12.04%.但MD1~MD4各处理组之间差异不显著(p＞0.05), 说明蚯蚓生物转化菇渣时添加猪粪等含氮物质是必须的.相关研究表明, 适宜的碳、氮源添加对蚯蚓堆肥有一定的影响, 可以促进种子发芽率, 增加径和根的比值、叶面积(Zaller, 2007；Arancon et al., 2008).并且蚯蚓堆肥会使得吲哚乙酸、细胞分裂素和赤霉素等植物激素增加, 从而促进植物种子发芽率(Bachman et al., 2008).由此推测, 本研究蚯蚓堆肥介导的生物转化菇渣混合基质所得产物与国内外研究结果对植物的影响类似.
图 5(Fig. 5)

图 5 不同处理组发酵产物浸提液对黑麦草发芽率的影响 Fig. 5Effect of extracting solution of biotransformation products from all treated groups on germination rate of ryegrass

3.6 不同蚯蚓生物转化产物的扫描电镜(SEM)分析利用电子扫描显微镜(SEM)观察了不同蚯蚓生物转化产物的纤维素表面的微观变化, 结果如图 6所示.从图中可见, 不同处理的蚯蚓生物转化产物的纤维素表面结构有不同程度变化.未经处理菇渣的纤维素表面较平滑(图 6a), 其余各处理组中的纤维素表面均有不同程度的断裂层(图 6b~6f), 其中, 图 6d、6e中纤维素表面出现明显的分层脱落现象, 大多呈现的是细小的碎片, 表明经过蚯蚓处理后的菇渣混合基质, 其纤维素结构被不同程度的破坏, 并且在碳氮比为25的降解体系(MD2)中蚯蚓降解效果最为明显, 这一结构变化与测定的纤维素和木质素含量变化相一致.
图 6(Fig. 6)

图 6 不同蚯蚓生物转化产物扫描电镜照片 (a.未经处理菇渣,b.CK,c.MD1,d.MD2,e.MD3,f.MD4；5000倍) Fig. 6The scanning electron micrograph of the biotransformation products in all treated groups

4 结论(Conclusions)1) 在蚯蚓生物转化菇渣混合基质的第56 d, 纤维素和木质素的降解率依次为MD2＞MD3＞MD1＞MD4>CK.其中, MD2处理中纤维素和木质素降解率最高, 分别达到50.06%和77.01%.由此推测, 在蚯蚓介导的降解体系中, MD2处理组更有利于香菇菌渣中纤维素和木质素的降解.
2) 在56 d的蚯蚓生物转化实验期间, 各处理组的脲酶、蔗糖酶、纤维素酶和多酚氧化酶活性均有不同程度变化, 其中, 多酚氧化酶与纤维素酶活性相比, 表现出一定的滞后性.
3) 扫描电镜结果显示, 蚯蚓生物转化可以将菌渣碎片化；另外, 蚯蚓堆肥产物浸提液可以提高黑麦草发芽率.综上, 推测碳氮比为25的蚯蚓生物转化体系更有利于菇渣基质处理.

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