徐晓庆^1,2,,
苏命²,
朱宜平³,
崔长征^1,,,
MUHAMMAD Suruzzaman²,
徐亚楠²,
于建伟²,
杨敏²
1.华东理工大学资源与环境工程学院，国家环境保护化工过程环境风险评价与控制重点实验室，上海 200237
2.中国科学院生态环境研究中心，环境水质学国家重点实验室，北京 100085
3.上海城投原水有限公司，上海 200125

作者简介: 徐晓庆(1994—)，女，硕士研究生。研究方向：饮用水源地产嗅风险评估与调控。E-mail：lovelyyokyo@163.com.

通讯作者: 崔长征,cuichangzheng@ecust.edu.cn ;

中图分类号: X832

Evaluation of typical odorant 2-methylisoborneol based on real time qPCR in source water and its application

XU Xiaoqing^1,2,,
SU Ming²,
ZHU Yiping³,
CUI Changzheng^1,,,
MUHAMMAD Suruzzaman²,
XU Yanan²,
YU Jianwei²,
YANG Min²
1.State Environmental Protection Key Laboratory of Environmental Risk Assessment and Control on Chemical Process, School of Resources and Environmental Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China
2.State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry, Research Center for Eco-Environmental Science, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China
3.Shanghai Chengtou Raw Water Co. Ltd., Shanghai 200125, China

Corresponding author: CUI Changzheng,cuichangzheng@ecust.edu.cn ;

CLC number: X832

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摘要:我国地表水源中由丝状蓝藻代谢产生2-甲基异莰醇(2-MIB)导致的嗅味问题十分普遍。由于传统显微镜检测方法无法鉴别产嗅藻种，不能满足水源水质管理要求，故有必要构建能特异性表征水体产嗅潜力的检测方法。由于丝状藻代谢产生2-MIB主要受其合成功能基因调控，设计了2-MIB功能基因引物，经引物特异性检验及PCR条件优化后，构建了基于2-MIB功能基因的定量PCR方法，并采用实际环境样品进行测试与验证。结果表明：引物特异性良好，定量PCR方法能有效检测2-MIB功能基因，并绘制了标准曲线，得出检测限为8.44×10² copies·L^?1；实际样品测试结果显示其2-MIB功能基因浓度在2.09×10⁷~1.94×10¹⁰ copies·L^?1范围内，与基于仪器分析方法测定的2-MIB浓度符合线性关系(R²=0.63，P<0.01)，表明定量方法可行。该方法具有灵敏性高、特异性好的特点，能特异性检测产嗅基因，可应用于水源地中产嗅潜力评估与预警。
关键词: 定量PCR/
2-甲基异莰醇/
产嗅功能基因/
丝状蓝藻/
饮用水

Abstract:Two-methylisoborneol (2-MIB) is a typical secondary metabolite released from cyanobacteria which causes off-flavor odor problem in surface water across China. Microscopy is the traditional method to identify such cyanobacteria. However, merely it is troublesome to distinguish between 2-MIB producers and non-producers by morphological structure and cannot meet the requirement of the source water quality management. It is necessary to build the test method which can specifically characterize the odor-producing capacity of waterbody. Due to the functional gene regulation for 2-MIB yield from cyanobacteria, the primers of 2-MIB function gene were designed and its specificity test was performed, then the PCR conditions were optimized. Real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) can be an alternative method to evaluate 2-MIB syntheses which is controlled by 2-MIB functional gene. Here, 2-MIB identification primers (MIBF/MIBR) have been designed and tested with field samples. A good standard curve was established, R²=0.999 5, P<0.01, and the detection limit was 8.44×10² copies·L^?1. The concentrations of 2-MIB gene of field samples were between 2.09×10⁷ copies·L^?1 to 1.94×10¹⁰ copies·L^?1, which were significantly conformity with 2-MIB concentrations measured by GC-MS (R²=0.63, P<0.01). The high sensitivity and specificity of this qPCR-based method suggests that it can effectively evaluate the risk of 2-MIB occurrence and able to monitor source water quality management.
Key words:fluorescence quantitative PCR/
2-methylisoborneol/
odor-producing functional gene/
filamentous cyanobacteria/
drinking water.



图1定量PCR引物(MIBF/MIBR)凝胶电泳验证结果
Figure1.Test result of qPCR primer MIBF/MIBR


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图2MIBF/MIBR质粒定量PCR标准曲线
Figure2.Standard curve of plasmid based on primer MIBF/MIBR


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图3基于定量PCR方法的实际样品2-MIB功能基因丰度测试结果
Figure3.Quantitative PCR-based detection result of 2-MIB functional genes in real environment samples


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图4基于 GC-MS分析法测定2-MIB物质浓度与qPCR方法测定2-MIB功能基因相关性检验
Figure4.Correlation test of 2-MIB substance concentration based on GC-MS analysis and 2-MIB functional gene determination by qPCR method


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表12-MIB功能基因引物
Table1.Primers of 2-MIB function gene

序号	名称	引物序列(5′~3′)	FACHB-1375	FACHB-1277	阴性对照	PCR产物长度/bp	来源
1	MIB3313F	CTCTACTGCCCCATTACCGAGCGA	+	+	?	913	[19]
	MIB4226R	GCCATTCAAACCCGCCGCCCATCCA
2	MIB3324F	CATTACCGAGCGATTCAACGAGC	+	+	?	726	[19]
	MIB4050R	CCGCAATCTGTAGCACCATGTTGA
3	MIBS-RTF	CGCTCGCTTGTGAGTGAGATAG	?	?	?	未检测	[19]
	MIBS-RTR	GGCAGTAGAGTGGTGAGGCAGTT
4	MIBF	GACCCAKMTCGGCTGYTGAT	+	+	?	389	本研究
	MIBR	TAGAAGCTGTCGTGCTGKCG
注：“+”表示PCR结果为阳性，琼脂糖凝胶电泳检测结果有条带；“?”表示PCR结果为阴性，琼脂糖凝胶电泳检测结果无条带。

序号	名称	引物序列(5′~3′)	FACHB-1375	FACHB-1277	阴性对照	PCR产物长度/bp	来源
1	MIB3313F	CTCTACTGCCCCATTACCGAGCGA	+	+	?	913	[19]
	MIB4226R	GCCATTCAAACCCGCCGCCCATCCA
2	MIB3324F	CATTACCGAGCGATTCAACGAGC	+	+	?	726	[19]
	MIB4050R	CCGCAATCTGTAGCACCATGTTGA
3	MIBS-RTF	CGCTCGCTTGTGAGTGAGATAG	?	?	?	未检测	[19]
	MIBS-RTR	GGCAGTAGAGTGGTGAGGCAGTT
4	MIBF	GACCCAKMTCGGCTGYTGAT	+	+	?	389	本研究
	MIBR	TAGAAGCTGTCGTGCTGKCG
注：“+”表示PCR结果为阳性，琼脂糖凝胶电泳检测结果有条带；“?”表示PCR结果为阴性，琼脂糖凝胶电泳检测结果无条带。

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表2MIBF/MIBR NCBI比对结果
Table2.NCBI blast result of MIBF/MIBR

序号	NCBI登记号	基因名	藻种拉丁名	藻种中文名	MIBF/%	MIBR/%
1	HQ830028.1	2-methylisoborneol (2-MIB) synthesis complete sequence	Pseudanabaena sp.	伪鱼腥藻属	100	100
2	HQ630883.1	MIB synthase gene	Pseudanabaena limnetica	湖泊伪鱼腥藻	100	100
3	AB826230.1	pgmtc gene for monoterpene cyclase	Pseudanabaena galeata	洋伪鱼腥藻	100	100
4	HQ630887.1	MIB synthase gene	Pseudanabaena sp.	伪鱼腥藻属	100	100
5	LC486303.1	mic	Microcoleus pseudautumnalis	微鞘藻属	100	100
6	HQ630885.1	MIB synthase gene	Oscillatoria limosa	泥生颤藻	100	100
7	HQ830029.1	2-methylisoborneol (2-MIB) synthesis associated operon	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
8	KP013063.1	A2 MIB cyclase gene	Leptolyngbya sp.	瘦鞘丝藻属	100	100
9	LC157987.1	MIB synthase	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
10	LC157990.1	MIB synthase	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
11	LC157992.1	MIB synthase	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
12	LC157991.1	MIB synthase	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
13	LC157989.1	MIB synthase	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
14	LC157988.1	MIB synthase	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
15	LC157986.1	MIB synthase	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
16	KJ658377.1	2-methylisoborneol synthase gene	Oscillatoria sp.	颤藻属	100	100
17	KJ658378.1	2-methylisoborneol synthase gene	Planktothrix sp.	浮丝藻属	100	100
18	MN167115.1	MIB synthase gene	Pseudanabaena galeata	洋伪鱼腥藻	100	100
19	MK759878.1	2-methylisoborneol (mib) gene, partial cds	Oscillatoria prolifera	颤藻	0	0
20	KM013398.1	A2 MIB cyclase (mic) gene, partial cds	Leptolyngbya sp.	瘦鞘丝藻属	0	0
21	KM013397.1	MIB cyclase (mic) gene, partial cds	Planktothricoides sp.	浮丝藻属	0	0
22	KM013396.1	MIB cyclase (mic) gene, partial cds	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	0	0
23	MK124613.1	MIB synthase gene, partial cds	Pseudanabaena sp.	伪鱼腥藻属	0	0

序号	NCBI登记号	基因名	藻种拉丁名	藻种中文名	MIBF/%	MIBR/%
1	HQ830028.1	2-methylisoborneol (2-MIB) synthesis complete sequence	Pseudanabaena sp.	伪鱼腥藻属	100	100
2	HQ630883.1	MIB synthase gene	Pseudanabaena limnetica	湖泊伪鱼腥藻	100	100
3	AB826230.1	pgmtc gene for monoterpene cyclase	Pseudanabaena galeata	洋伪鱼腥藻	100	100
4	HQ630887.1	MIB synthase gene	Pseudanabaena sp.	伪鱼腥藻属	100	100
5	LC486303.1	mic	Microcoleus pseudautumnalis	微鞘藻属	100	100
6	HQ630885.1	MIB synthase gene	Oscillatoria limosa	泥生颤藻	100	100
7	HQ830029.1	2-methylisoborneol (2-MIB) synthesis associated operon	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
8	KP013063.1	A2 MIB cyclase gene	Leptolyngbya sp.	瘦鞘丝藻属	100	100
9	LC157987.1	MIB synthase	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
10	LC157990.1	MIB synthase	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
11	LC157992.1	MIB synthase	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
12	LC157991.1	MIB synthase	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
13	LC157989.1	MIB synthase	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
14	LC157988.1	MIB synthase	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
15	LC157986.1	MIB synthase	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	100	100
16	KJ658377.1	2-methylisoborneol synthase gene	Oscillatoria sp.	颤藻属	100	100
17	KJ658378.1	2-methylisoborneol synthase gene	Planktothrix sp.	浮丝藻属	100	100
18	MN167115.1	MIB synthase gene	Pseudanabaena galeata	洋伪鱼腥藻	100	100
19	MK759878.1	2-methylisoborneol (mib) gene, partial cds	Oscillatoria prolifera	颤藻	0	0
20	KM013398.1	A2 MIB cyclase (mic) gene, partial cds	Leptolyngbya sp.	瘦鞘丝藻属	0	0
21	KM013397.1	MIB cyclase (mic) gene, partial cds	Planktothricoides sp.	浮丝藻属	0	0
22	KM013396.1	MIB cyclase (mic) gene, partial cds	Planktothricoides raciborskii	拉氏拟浮丝藻	0	0
23	MK124613.1	MIB synthase gene, partial cds	Pseudanabaena sp.	伪鱼腥藻属	0	0

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[1]	SU M, JIA D M, YU J W, et al. Reducing production of taste and odor by deep-living cyanobacteria in drinking water reservoirs by regulation of water level[J]. Science of the Total Environment, 2017, 574: 1477-1483. doi: 10.1016/j.scitotenv.2016.08.134
[2]	SUN D L, YU J W, YANG M, et al. Occurrence of odor problems in drinking water of major cities across China[J]. Frontiers of Environmental Science & Engineering, 2014, 8(3): 411-416.
[3]	PETRO K, MANOLIS L, CHRISTINA K, et al. Treatment of unpleasant odors in municipal wastewater treatment plants[J]. Water Science and Technology, 2010, 61(10): 2635-2644. doi: 10.2166/wst.2010.211
[4]	WANG C M, AN W, GUO Q Y, et al. Assessing the hidden social risk caused by odor in drinking water through population behavioral responses using economic burden[J]. Water Research, 2020, 172: 115507. doi: 10.1016/j.watres.2020.115507
[5]	WAGNER K. A review of “algae: source to treatment (M57)”[J]. Lake & Reservoir Management, 2010, 26(4): 345-346.
[6]	SAADOUN I M, SCHRADER K K, BLEVINS W T. Environmental and nutritional factors affecting geosmin synthesis by Anabaena sp[J]. Water Research, 2001, 35(5): 1209-1218. doi: 10.1016/S0043-1354(00)00381-X
[7]	SU M, YU J W, ZHANG J Z, et al. MIB-producing cyanobacteria (Planktothrix sp.) in a drinking water reservoir: Distribution and odor producing potential[J]. Water Research, 2015, 68: 444-453.
[8]	NERENBERG R, RITTMANN B E, SOUCIE W J. Ozone biofiltration for removing MIB and geosmin[J]. Journal of American Water Works Association, 2000, 92(12): 85-95. doi: 10.1002/j.1551-8833.2000.tb09073.x
[9]	WATSON S B. Cyanobacterial and eukaryotic algal odour compounds: Signals or by-products? A review of their biological activity[J]. Phycologia, 2003, 42(4): 332-350. doi: 10.2216/i0031-8884-42-4-332.1
[10]	IZAGUIRRE G, HWANG C J, KRASNER S W, et al. Production of 2-methyliso borneol by two benthic cyanophyta[J]. Water Science & Technology, 1983, 15(6/7): 211-220.
[11]	MARTIN J F, IZAGUIRRE G, WATERSTRAT P. A planktonic Oscillatoria species from Mississippi catfish ponds that produces the off-flavor compound 2-methylisoborneol[J]. Water Research, 1991, 25(12): 1447-1451. doi: 10.1016/0043-1354(91)90173-N
[12]	SUGIURA N, IWAMI N, INAMORI Y, et al. Significance of attached cyanobacteria relevant to the occurrence of musty odor in Lake Kasumigaura[J]. Water Research, 1998, 32(12): 3549-3554. doi: 10.1016/S0043-1354(98)00153-5
[13]	ZHANG K J, ZHANG T Q, DENG Y, et al. Occurrence of algae and algae-related taste and odour (T&O) compounds in the Qingcaosha Reservoir, China[J]. Journal of Water Supply: Research and Technology-Aqua, 2015, 64(7): 824-831. doi: 10.2166/aqua.2015.072
[14]	YANG M, YU J W, LI Z L, et al. Taihu Lake not to blame for Wuxi’s woes[J]. Science, 2008, 319(5860): 158.
[15]	钟秀华, 周丽辉, 余胜兵, 等. 顶空固相微萃取-气相色谱/质谱法测定饮水中2-甲基异莰醇和土臭素[J]. 环境卫生学杂志, 2015, 5(3): 97-100.
[16]	WANG C M, CANE D E. Biochemistry and molecular genetics of the biosynthesis of the earthy odorant methylisoborneol in Streptomyces Coelicolor[J]. Journal of the American Chemical Society, 2008, 130(28): 8908-8909. doi: 10.1021/ja803639g
[17]	GIGLIO S, CHOU W K W, IKEDA H, et al. Biosynthesis of 2-methylisoborneol in Cyanobacteria[J]. Environmental Science & Technology, 2011, 45(3): 992-998.
[18]	GIGLIO S, JIANG J Y, SAINT C P, et al. Isolation and characterization of the gene associated with geosmin production in cyanobacteria[J]. Environmental Science & Technology, 2008, 42(21): 8027-8032.
[19]	SUURN?KKI S, GOMEZ-SAEZ G V, RANTALA-YLINEN A, et al. Identification of geosmin and 2-methylisoborneol in cyanobacteria and molecular detection methods for the producers of these compounds[J]. Water Research, 2015, 68: 56-66. doi: 10.1016/j.watres.2014.09.037
[20]	吴燕芳. 固相萃取-气相色谱法检测水样中的土臭素和2-甲基异茨醇[C]//中国化学会有机分析专业委员会, 国家自然科学基金委. 中国化学会第十四届有机分析及生物分析学术研讨会会议论文摘要集, 2007: 281-282.
[21]	李学艳, 陈忠林, 沈吉敏, 等. 固相萃取-气质联机测定水中嗅味物质2-甲基异茨醇和土霉素[J]. 中国环境监测, 2006, 22(2): 18-21. doi: 10.3969/j.issn.1002-6002.2006.02.005
[22]	余沛芝, 阮春蓉, 陈琳琳, 等. 水中2-甲基异莰醇和土臭素的固相微萃取-气相色谱串联质谱检测方法[J]. 净水技术, 2018, 37(9): 10-14.
[23]	JOHN N, KOEHLER A V, BRENDAN R E, et al. An improved method for PCR-based detection and routine monitoring of geosmin-producing cyanobacterial blooms[J]. Water Research, 2018, 136: 34-40. doi: 10.1016/j.watres.2018.02.041

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收稿日期:2019-12-31
录用日期:2019-05-08
网络出版日期:2020-11-11
-->刊出日期:2020-11-10

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基于荧光定量PCR技术构建水源地典型致嗅物质2-甲基异莰醇的评估方法及其应用

徐晓庆^1,2,,
苏命²,
朱宜平³,
崔长征^1,,,
MUHAMMAD Suruzzaman²,
徐亚楠²,
于建伟²,
杨敏²

通讯作者: 崔长征,cuichangzheng@ecust.edu.cn ;

作者简介: 徐晓庆(1994—)，女，硕士研究生。研究方向：饮用水源地产嗅风险评估与调控。E-mail：lovelyyokyo@163.com 1.华东理工大学资源与环境工程学院，国家环境保护化工过程环境风险评价与控制重点实验室，上海 200237
2.中国科学院生态环境研究中心，环境水质学国家重点实验室，北京 100085
3.上海城投原水有限公司，上海 200125
收稿日期: 2019-12-31
录用日期: 2019-05-08
网络出版日期: 2020-11-11
关键词: 定量PCR/
2-甲基异莰醇/
产嗅功能基因/
丝状蓝藻/
饮用水
摘要:我国地表水源中由丝状蓝藻代谢产生2-甲基异莰醇(2-MIB)导致的嗅味问题十分普遍。由于传统显微镜检测方法无法鉴别产嗅藻种，不能满足水源水质管理要求，故有必要构建能特异性表征水体产嗅潜力的检测方法。由于丝状藻代谢产生2-MIB主要受其合成功能基因调控，设计了2-MIB功能基因引物，经引物特异性检验及PCR条件优化后，构建了基于2-MIB功能基因的定量PCR方法，并采用实际环境样品进行测试与验证。结果表明：引物特异性良好，定量PCR方法能有效检测2-MIB功能基因，并绘制了标准曲线，得出检测限为8.44×10² copies·L^?1；实际样品测试结果显示其2-MIB功能基因浓度在2.09×10⁷~1.94×10¹⁰ copies·L^?1范围内，与基于仪器分析方法测定的2-MIB浓度符合线性关系(R²=0.63，P<0.01)，表明定量方法可行。该方法具有灵敏性高、特异性好的特点，能特异性检测产嗅基因，可应用于水源地中产嗅潜力评估与预警。

English Abstract

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--> --> --> 湖库是我国许多城市的重要饮用水水源地^[1]。然而，我国35个城市水源水库中有80%的水体存在饮用水嗅味问题^[2]，其中由致嗅化合物2-甲基异莰醇(2-methylisoborneol，2-MIB)导致的水体土霉味问题居多^[3-7]。由于该物质嗅阈值极低^[5](4~16 ng·L^?1)，且很难通过常规水处理工艺去除^[8]，饮用水中残留的痕量2-MIB物质容易引发消费者对水质的担忧，威胁城市供水安全^[4]。水源地嗅味问题已经成为我国供水行业中重点关注的问题之一^[9]。
2-MIB主要由丝状蓝藻生长代谢产生，这类蓝藻包括颤藻属(Oscillatoria)、席藻属(Phormidium)、浮颤藻属(Planktothrix)以及伪鱼腥藻属(Pseudanabaena)等^[9]。丝状蓝藻导致的2-MIB嗅味问题可最早追溯到1983年，由于水源水库底泥附着生长的颤藻引发美国加利福尼亚州3个供水系统出现嗅味问题^[10]；1991年，MARTIN等^[11]在密西西比某池塘中采集到一株产2-MIB的颤藻；1998年，日本****SUGIURA等^[12]在Kasumigaura湖中分离出4株丝状产嗅蓝藻，包括2株席藻、1株颤藻和1株鞘丝藻，发现这些藻种生物量与水体土霉味之间存在正相关关系。
近10年来，我国关于水源地嗅味问题的报道越来越多。北京密云水库每年9—10月局部区域出现浮颤藻生长导致水体嗅味问题^[7]；上海市新建水源地青草沙水库由于丝状蓝藻爆发导致季节性嗅味问题^[13]；天津于桥水库、苏州东太湖湖滨水库、上海金泽水库及银川某化工园区水源水库等均存在由于不同种属的丝状产嗅蓝藻生长或爆发导致的嗅味问题^[14]。
大部分水源地中2-MIB由丝状蓝藻产生，由于丝状蓝藻种类较多、形态相近，不同藻种具有不同的产2-MIB特征，甚至同一藻种在不同外部环境条件下也存在产嗅差异。传统方法主要依托显微镜镜检通过藻细胞形态进行藻种计数。然而，从细胞形态上无法区分产嗅丝状藻种与非产嗅丝状藻种，因此，无法特异性检测水体中的产嗅藻；此外显微镜镜检前处理耗时长，检测效率低，准确度与精确度较低^[7]。致嗅物质2-MIB可基于气相色谱-质谱联用(GC-MS)方法^[15]分析，但因仪器昂贵、操作要求高、运行维护成本高，大部分水源管理机构不具备该条件，且该方法只能测定水样中已产生的2-MIB物质浓度，无法提前预警，也不能鉴别产生来源。因此，有必要构建一种能特异性检测水体2-MIB产生潜力的方法。
由于丝状藻代谢产生2-MIB受相关功能基因控制，可通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR)方法构建特异性检测2-MIB合成功能基因的方法。关于2-MIB的合成途径最初在放线菌中被发现^[16]，主要由SCO7701基因与SCO7700基因调控；随后，GIGLIO等^[17]发现蓝藻中2-MIB的生物合成机制为GPP的甲基化和甲基GPP的环化反应，分别由GPPMT基因和2-MIBS基因调控。根据序列相似性分析，蓝藻和放线菌的2-MIB相关基因具有相对较高的相似度和同源性^[18]。
本研究通过设计针对蓝藻中2-MIB功能基因的特异性引物，构建实时定量PCR方法，并采用实际水体检验方法的可行性，实现水源中丝状蓝藻的致嗅功能基因定量检测，进而评估水体产嗅潜力与产嗅风险，为水源嗅味问题的监测与预警提供实时、快速、科学的方法。

1.1. 实验材料

所用藻种均为产2-MIB蓝藻，分别为FACHB-1277(Pseudanabaena sp., 伪鱼腥藻)、FACHB-1375(Planktothrix sp., 浮颤藻)，购自中国科学院淡水藻种库。藻类培养使用BG11培养基，扩大培养后用于DNA提取及致嗅物质检测等目的。

1.2. 培养藻种及环境样品DNA提取方法

取500 mL藻培养液将藻细胞过滤富集至1.2 μm滤膜(RTTP04700，1.2 μm 聚碳酸酯膜，Isopore^TM, 美国)上；随后将滤膜剪切破碎后使用FastDNA ^?SPIN Kit for Soil 试剂盒(6560-200，MPBio，美国)提取样品DNA。

1.3. 引物设计与特异性验证

采用已有研究^[19]中的2-MIB引物(MIB3313F/MIB4226R和MIB3324F/MIB4050R)可以有效扩增FACHB-1277与FACHB-1375样品中2-MIB功能基因，验证了实验藻种含MIB功能基因。但由于两对引物所扩增得到的2-MIB基因片段较长，分别为913 bp与726 bp，不能用于定量PCR扩增。进一步检验了已有研究中报道的定量PCR引物MIBS-RTF/ MIBS-RTR^[19]，发现不能扩增本研究中实验藻种的2-MIB功能基因。因此，本研究基于NCBI已公开的2-MIB功能基因数据库，设计2-MIB功能基因的特异性引物(表1)，基因引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。将所设计的引物与NCBI中已有2-MIB基因数据库比对验证引物可行性与特异性；并采用普通PCR法测试相关引物，使用1.2 %琼脂糖凝胶电泳方法检验了引物的特异性。

1.4. 普通PCR与qPCR扩增条件

普通PCR反应体系为：2×PCR Taq MasterMix with dye (RR005A，TAKARA Bio公司，日本)12.5 μL，上下游引物各0.8 μL，模板DNA 2.0 μL，ddH₂O 8.9 μL。普通PCR扩增程序为：高保真酶活化阶段95 ℃，持续5 min；高温变性阶段95 ℃，持续30 s；低温退火阶段64 ℃，持续 45 s；延伸阶段72 ℃，持续30 s；高温变性、低温退火、延伸阶段共45个循环。
qPCR反应体系为：TB Green^TM Premix Ex Taq^TM (RR820，TAKARA Bio公司，日本)12.5 μL，上下游引物MIBF/MIBR各0.5 μL，模板DNA 2.0 μL，ddH₂O 9.5 μL。qPCR扩增程序为：高温变性95 ℃，持续10 s；低温退火64 ℃，持续20 s；延伸阶段72 ℃，持续30 s；反应共40个循环；另外，溶解曲线设置条件为由65 ℃升温至97 ℃，速率为2.2 ℃·s^?1。

1.5. 标准曲线的建立

基于引物MIBF与MIBR扩增FACHB-1277 DNA模板，经测序后根据序列信息合成2-MIB功能基因质粒，浓度为359 ng·μL^?1(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。根据式(1)计算质粒拷贝数。
式中：N为基因拷贝数浓度，copies·μL^?1；N_A为阿伏伽德罗常数；c为核酸质量浓度，ng·μL^?1；L为碱基长度，bp；M_W为单位碱基平均摩尔质量。
由式(1)计算得到质粒拷贝数为8.44×10¹¹copies·μL^?1。按10倍进行梯度稀释，得到7个浓度水平，以此为DNA模板，按照1.4节提及的优化体系与运行参数进行qPCR扩增。同一浓度梯度质粒DNA为模板的反应孔作3组平行实验，将得到的C_q值与2-MIB基因量的对数构建线性模型，绘制标准曲线。

1.6. 实际样品测试

配制了9个不同浓度产嗅藻的培养样品，包括FACHB-1277伪鱼腥藻-1 (S01)、FACHB-1277伪鱼腥藻-2 (S02)、FACHB-1277伪鱼腥藻-3 (S03)、FACHB-1375浮颤藻-1 (S04)、FACHB-1375浮颤藻-2 (S05)、FACHB-1375浮颤藻-3 (S06)、青草沙分离的Pseudanabaena sp. 01 (S10)、青草沙分离的Pseudanabaena sp. 02 (S11)、青草沙分离的Pseudanabaena sp. 03 (S12)。采集了12个南水北调工程的环境样品，包括S07~S09、S13~S21。对这21组样品分别进行了定量PCR方法检测与气相色谱-质谱联用的2-MIB物质浓度分析^{[15, 20-22]}，每个样品重复分析3次。

2.1. 引物设计与特异性验证结果分析

实验测试了已有研究^[19]的2-MIB基因相关引物，发现MIB3313F/MIB4226R、MIB3324F/MIB4050R两对引物能有效扩增模拟培养藻种FACHB-1277与FACHB-1375。然而，目标基因片段过长，因此，无法用于定量PCR扩增。已有研究^[19]的引物不能有效扩增本实验的藻种，这与2-MIB功能基因序列具有一定的可变性有关。因此，采用MIB3313F/MIB4226R引物扩增了FACHB-1277 DNA，并通过测序获得2-MIB功能基因序列，序列NCBI登记号为MN869917。基于该序列信息设计了MIBF/MIBR引物(见表1)。经测试发现，这对引物能有效扩增2-MIB功能基因，PCR产物长度为389 bp，可用于qPCR方法。MIBF/MIBR NCBI比对结果见表2。




为验证MIBF/MIBR引物的可行性，比对了引物序列与NCBI基因数据库中所有蓝藻中MIB合成功能基因结果，发现这对引物能匹配18条MIB功能基因序列(截至目前发表了23条)。由结果分析可知：不能匹配的基因序列(19~23)是由于这些序列仅为部分MIB基因序列，未包含MIBF/MIBR引物段序列；而这对引物仅能匹配NCBI中已发表的MIB功能基因。进一步采用实际藻种进行普通PCR扩增实验，产物条带介于250 bp至500 bp之间，验证了MIBF/MIBR引物的可行性，结果如图1所示。

2.2. 定量PCR标准曲线的构建

将1.5节合成的2-MIB功能基因质粒(拷贝数8.44×10¹¹copies·μL^?1)作为标准品进行定量PCR测试，基于结果构建循环次数C_q值与2-MIB基因拷贝数的对数构建线性模型，绘制标准曲线如图2所示。标准曲线公式见式(2)。


式中：C_q为循环次数；C_g为2-MIB基因丰度，copies·L^?1。图2表明两者符合线性关系(R²=0.999 5，P<0.01)，检测限为8.44×10² copies·L^?1，说明该方法能满足2-MIB功能基因检测要求。

2.3. 实际样品2-MIB基因丰度测试结果

图3为12个环境水体及9个不同浓度产嗅藻的培养样品的测试结果。由图3可知，该方法能够检测出环境水体及培养样品中的2-MIB功能基因，得到的环境样品浓度为2.09×10⁷ ~1.94×10¹⁰ copies·L^?1。其中，实验室培养的FACHB-1375 Planktothrix sp.浮颤藻样品2-MIB功能基因丰度最高，实际环境样品中2-MIB功能基因丰度水平相近，最低为于桥水库样品，相应基因丰度为2.09×10⁷ copies·L^?1。此外，各水样3组重复样品检测结果十分接近，表明该方法的重现性较好。

2.4. 2-MIB监测方法的对比与验证

为验证方法的可靠性，用GC-MS方法检测了上述21个样品中2-MIB浓度^[7]。对比分析2种方法的结果发现其符合线性关系(R²=0.63，P<0.01)，表明定量PCR方法可以表征水体中2-MIB浓度(见图4)。式(3)为2-MIB浓度与功能基因之间的定量关系模型，可用于利用定量PCR结果评估水体中2-MIB浓度水平。


式中：C_g为2-MIB基因丰度，copies·L^?1；c为2-MIB浓度，ng·L^?1。

2.5. 2-MIB的定量PCR监测方法的应用前景

水源地中藻类生长产生的嗅味问题已成为供水行业最为关注的问题。在我国，由于丝状蓝藻生长代谢2-MIB导致的水体土霉味问题尤为普遍，确认2-MIB的产生来源能提升水源地嗅味管理及防控水平。实时荧光定量PCR(qPCR)对基因定量的检测方法已广泛应用于检测蓝藻或有毒蓝藻总量中。该方法具有快速高效、灵敏度高、检出限低、特异性好和高重复性高等优点。目前，已有少量基于qPCR方法的检测水体中产土臭素(geosmin)微生物生物总量的方法^[23]，但是用于含2-MIB功能基因微生物生物总量的检测应用还较少。
本研究中构建的定量PCR方法，能直接定量检测水体中的2-MIB功能基因，避免了传统方法基于形态学无法区分产嗅藻与非产嗅藻的缺陷。相比于采用气相色谱-质谱联用(GC-MS)的仪器分析方法，定量PCR方法能同时检测多达96个样品，具有通量高、速度快等特点。此外，该方法检测限低，能最低检测到8.44×10² copies·L^?1个2-MIB功能基因拷贝数。该结果与基于定量PCR方法检测水体中土臭素功能基因的结果一致^[7]。
然而，由于该方法存在一些缺陷，限制了其推广应用。大部分分子生物学方法是以目标生物DNA为主要研究对象，而蓝藻具有细胞壁，DNA的提取难度与误差增加。SU等^[7]发现DNA提取是影响检测样品中土嗅素功能基因准确度的最主要步骤，与本研究的结论类似。DNA提取过程的不确定显著降低了结果的准确性。此外，由于产2-MIB的蓝藻并未完全界定，不同产2-MIB藻种的基因序列不完全相同，加上当前有关2-MIB的功能基因研究很少，NCBI中的MIB基因序列仍在不断完善中。因此，本研究中所设计的引物可能无法扩增之后新发现的产嗅藻2-MIB功能基因，正如以往引物不能有效扩增本研究涉及的产嗅藻种一样。随着DNA提取方法的不断改进，以及2-MIB功能基因库序列信息的完善，基于定量PCR的水源2-MIB风险评估方法具有广泛的应用前景。
基于此，本课题组还将此方法应用于上海市、厦门市的水源水库中，旨在考察该方法是否能快速、有效地核算出水体的产嗅潜力，达到水体嗅味问题预警的要求，为水源地的水质管理提供十分重要的工具与技术支持。

1)建立了检测水体中2-MIB功能基因的定量PCR方法，该方法能克服传统方法无法区分产嗅藻与非产嗅藻的缺点，且满足检测要求(R²=0.999 5，P<0.01)。
2)通过采集我国不同地区的实际水源样品，对比验证了定量PCR方法与仪器分析方法结果的一致性(R²=0.63，P<0.01)，说明本研究提出基于定量PCR评估水体嗅味风险的方法具有可行性。
3)基于qPCR的产嗅基因丰度检测代替了繁琐、重现性低的显微镜看藻、数藻过程。快速、准确有效地检测水体中致嗅功能基因的丰度，能起到预警作用，为水源地的水质管理提供十分重要的工具与技术支持。

参考文献 (23)