DNA甲基化是重要的表观遗传现象，对基因表达发挥重要调控功能. 大量研究表明，基因DNA甲基化是重要的临床诊断生物标志物. 在临床上，实施快速、准确的DNA甲基化状态检测是诊断应用的前提和关键. 甲基化特异性PCR（methylation specific PCR，MSP）通过将两种引物与甲基化、非甲基化模板各自特异性结合和扩增，实现基因甲基化状态的区分，是切实可行、简单便捷的临床诊断实验技术. 但是，不同于常规PCR，MSP主要存在如何强化引物-甲基化/非甲基化模板特异性结合、降低引物序列Tm值差异、去除假阳性扩增及提高敏感性等四大难点. 尽管大多数MSP引物设计软件对上述难题都提出了各自解决办法，但在引物设计影响因素考虑、设计与评估并行处理及特异性扩增预测等方面仍然存在较大缺陷. 为此，本研究通过对MethPrimer、MSPPrimer、MethBlast、BiSearch等现有MSP引物设计软件原理的深入探究，以及对Bowtie、SAMtools和BEDTools等工具的有效综合整合，基于图形库Matplotlib和第三方Python功能库BioPython与Primer3-py实现了具有系列优点的甲基化特异性PCR引物设计与评估可视化工具MethyScan. 它具有引物设计、基因组索引、引物评估等三大完整功能模块，不仅可快速进行MSP引物设计，实现巢式（Nested）引物适配，还可基于4种基因组碱基转换模板分析引物结合信息，图形化展示非特异性扩增与目的片段差异，从而综合评估引物特异性-非特异性扩增. 同时，对食管癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中6个潜在生物标志物TFPI-2、NDRG4、CDKN2A、CD44、CASP8和SDHD的甲基化引物设计对比结果表明，MethyScan不仅可获得更多CpG位点的检测引物，而且所获得MSP引物位置与其他软件结果相同或相近，且引物间Tm值差值更小. 总之，作为首个图形化展示特异性-非特异性扩增差异MSP引物设计工具，MethyScan可有效提高甲基化引物设计准确性，为临床DNA甲基化检测项目开展、检测试验实施及诊断试剂盒研发提供有力支撑. MethyScan工具下载地址：https://github.com/bioinfo-ibms-pumc/MethyScan.

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