0 引言
【研究意义】世界上蜱类3科18属899种[1],中国有2科10属117种[2]。新疆至少有2科10属45种[3],占全国蜱种类的1/3之多,分布也极其广泛。蜱直接叮咬造成动物出现炎症、贫血、瘫痪、中毒、过敏以及通过皮肤损伤处继发感染和发生蝇蛆病等,且蜱携带和传播多种病原体,不仅给畜牧业造成巨大经济损失,还是仅次于蚊的人类疾病第二大传播媒介,严重威胁公共卫生安全[4]。调查蜱种类及其携带病原情况,对当地蜱及蜱传病的防控意义重大。【前人研究进展】图兰扇头蜱（Rhipicephalus turanicus）属于硬蜱科（Ixodidae）扇头蜱亚科（Rhipicephalinae）扇头蜱属（Rhipicephalus）,三宿主蜱,主要寄生于骆驼、牛、马、绵羊、山羊等家畜和野生动物[5]。图兰扇头蜱在中国分布于新疆、陕西、江苏、云南和广西,是新疆南部荒漠及半荒漠地区常见种和优势种,新疆周边国家分布也极为广泛[5,6]。【本研究切入点】已报道,经软蜱或硬蜱可垂直传播的病原有非洲猪瘟病毒[7]、新疆出血热病毒[8]、克里米亚-刚果出血热病毒[9]、伯氏疏螺旋体[10]、巴贝斯虫[11]、斑点热群立克次体[12]、西伯利亚立克次体、贝氏立克次体[13]、似柯克斯氏体属共生体、似立克次体属共生体[14]、Rickettsia peacockii[15]、Rickettsia parkeri和Rickettsia amblyommatis[16],等等。综上所述,一种病原是否经蜱的卵传播的研究是非常必要的,研究结果可对分析该病的蔓延和流行风险评估提供基础信息和科学参考。【拟解决的关键问题】本研究拟通过对新疆南部扇头蜱属蜱结合分子生物学进行蜱种类鉴定,然后对饱血雌蜱和其产的卵通过立克次体属16S rRNA基因扩增进行立克次体及其种类的鉴定与分析,以期为蜱及蜱传病的防控提供理论依据。1 材料与方法
试验于2017年4—7月在塔里木大学动物科学学院实验室和新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室完成。1.1 材料
1.1.1 扇头蜱及其卵 饱血雌蜱（图1）,于2017年5月采集于新疆南部阿拉尔市某团场一个羊场,约50只,经形态学鉴定均为扇头蜱属蜱（图2）;饱血雌蜱置于一定湿度和一定温度的环境中产卵,随机取5个具有独立空间的卵样品（1个卵样品为1只雌蜱所产全部卵,图3箭头所示）及其对应的5只产卵雌蜱为后续研究对象。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1寄生于新疆阿拉尔市绵羊耳部的蜱
-->Fig. 1The ticks parasitized on sheep ear in Alar, Xinjiang
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显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2扇头蜱属蜱
-->Fig. 2The Rhipicephalus ticks
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显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3雌蜱产的卵
-->Fig. 3Eggs oviposit from female ticks
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1.1.2 引物和参考基因序列 鉴定蜱种类的12S rRNA基因扩增引物为12S-F：5′-AAA CTA GGA TTA GAT ACC CT-3′,12S-R: 5′-AAT GAG AGC GAC GGG CGA TGT-3′,预期扩增产物大小为320 bp[17];鉴定立克次体种类16S rRNA基因扩增引物为16S-F：5′-ATC AGT ACG GAA TAA CTT TTA-3′,16S-R：5′-TGC CTC TTG CGT TAG CTC AC-3′,预期扩增产物大小为1 332 bp[18],由生工生物工程（上海）有限公司合成。
基因分析参考序列均来源于NCBI数据库,序列名称和GenBank登录号见图5和图6。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图5图兰扇头蜱12S rRNA进化关系（采用MEGA5软件NJ法）▲标注序列为本研究序列
-->Fig. 5Evolutionary relationships of Rhipicephalus turanicus base on 12S rRNA (Evolutionary analyses were conducted in MEGA5 by Neighbor-Joining method) The black trilateral tagging sequence is the sequence of this research
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显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图6立克次体16S rRNA基因进化关系（采用MEGA5软件NJ法）●标注序列为本研究序列
-->Fig. 6Evolutionary relationships of Rickettsia base on 16S rRNA gene (Evolutionary analyses were conducted in MEGA5 by Neighbor-Joining method) The black circles tagging sequence is the sequence of this research
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1.1.3 主要试剂及仪器 TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver. 5.0 (Code No. 9765)、Premix TaqTM（TakaRa TaqTM Version 2.0）(Code No. R004A)和DL2000 DNA Marker（Code No. 3427A）,购自宝生物工程（大连）有限公司。PCR仪（TC-5000, Bibby Scientific Ltd）,小型高速冷冻离心机（R134a, Hermetically sealed refrigeration system）,电泳仪（DYY-12,北京市六一仪器厂）,紫外分析仪（JY02S,北京君意东方电泳仪设备有限公司）等。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取 雌蜱和卵分别用蒸馏水洗脱3次后,无菌滤纸吸干,置于2mL无菌管中,按照TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver. 5.0（Code No. 9765）试剂盒说明书操作,提取基因组DNA,最后用50 μL无菌水洗脱收集DNA,-20℃保存备用。1.2.2 PCR 按照Premix TaqTM（TakaRa TaqTM Version 2.0）（Code No. R004A）试剂盒说明书对蜱12S rRNA基因和立克次体16S rRNA基因进行扩增,PCR体系均为50 μL,PCR反应条件分别为：94℃ 5 min—5个循环（94℃ 15 s,51℃ 30 s,68℃ 30 s）—25个循环（94℃ 15 s,53℃ 30 s,70℃ 30 s）—70℃ 5 min和95℃ 5 min—30个循环（95℃ 45 s,58℃ 45 s,72℃ 90 s）—72℃ 5 min。
1.2.3 序列分析 扩增产物经1%凝胶电泳鉴定后,30μL阳性扩增产物与上下游引物一同送生工生物工程（上海）有限公司测序。测序结果利用BLAST在线平台（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi? PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）、Primer Premier 5.0、DNAMAN、DNAStar和MEGA5.0软件,进行种系发育分析和构建系统发育树。
2 结果
2.1 PCR扩增
通过蜱12S rRNA基因扩增引物对产卵后的雌蜱基因组DNA进行PCR,结果5只雌蜱样品扩增全部阳性,产物与预期大小一致;通过立克次体16S rRNA基因扩增引物对产卵后的雌蜱和其所产的卵基因组DNA分别进行PCR,结果1只蜱和其产的卵样品（20%,1/5）扩增均为阳性,产物与预期大小一致（图4）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图4蜱12S rRNA基因（左）和立克次体16S rRNA基因（右）PCR扩增结果 M：Marker;1—5：蜱12S;6和9：阴性对照;7：蜱立克次体16S;8：卵立克次体16S
-->Fig. 4PCR amplification results of Ticks 12S rRNA gene (Left) and Rickettsia 16S rRNA gene (Right) M: Marker; 1-5: Tick 12S; 6 and 9: Negative control; 7: Ticks rickettsia 16S; 8: Eggs rickettsia 16S
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2.2 Blast比对分析
蜱12S rRNA基因扩增产物全部送测序,获得的4段蜱12S rRNA基因序列完全一致,通过Blast在线分析,与数据库中图兰扇头蜱12S rRNA基因序列相似性最高,达99%以上,且高相似性前五基因序列均为图兰扇头蜱（表1）,其中包括来自新疆绵羊的图兰扇头蜱,本研究蜱12S rRNA基因测序结果提交GenBank数据库获得的登录号为MG744514。产卵后的雌蜱和卵立克次体16S rRNA基因扩增产物送测序,来自雌蜱和卵的该基因测序结果完全一致,通过Blast比对分析,与数据库中Rickettsia raoultii 16S rRNA基因序列相似性最高,达99%以上,且高相似性前五基因序列为4个Rickettsia raoultii和1个Rickettsia sp.（表1）,其中包括来自新疆2011年的亚洲璃眼蜱和草原革蜱的立克次体,本研究立克次体16S rRNA基因测序结果提交GenBank数据库获得的登录号为MG744513。Table 1
表1
表1蜱12S rRNA基因和立克次体16S rRNA基因Blast比对分析
Table 1Blast analysis results of Ticks 12S rRNA gene and Rickettsia 16S rRNA gene
| 序号 No. | 蜱12S rRNA基因 Ticks 12S rRNA gene | 立克次体16S rRNA基因 Rickettsia 16S rRNA gene | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| GenBank登录号 GenBank accession number | 相似性 Nucleotide homology | 物种 Species | GenBank登录号 GenBank accession number | 相似性 Nucleotide homology | 物种 Species | |
| 1 | KF219722 | 347/351(99%) | Rhipicephalus turanicus | KJ410261 | 1213/1216 (99%) | Rickettsia raoultii |
| 2 | JQ480850 | 347/351(99%) | Rhipicephalus turanicus | KJ410259 | 1213/1216 (99%) | Rickettsia raoultii |
| 3 | MF002569 | 344/349(99%) | Rhipicephalus turanicus | KJ410258 | 1213/1216 (99%) | Rickettsia raoultii |
| 4 | MF002568 | 344/349(99%) | Rhipicephalus turanicus | DQ365809 | 1213/1216 (99%) | Rickettsia raoultii |
| 5 | MF002567 | 344/349(99%) | Rhipicephalus turanicus | AF120026 | 1213/1216 (99%) | Rickettsia sp. |
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2.3 序列分析
来自于GenBank数据库图兰扇头蜱、血红扇头蜱、微小牛蜱、边缘革蜱、草原革蜱、长角血蜱、小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱、残缘璃眼蜱、全沟硬蜱及外围群尘螨的22个12S rRNA基因序列,与本研究序列一同进行进化关系分析。进化树显示,本研究获得的蜱12S rRNA基因序列与图兰扇头蜱进化关系最近,聚在同一个小分支（图5）。来自于GenBank数据库的37个24种立克次体16S rRNA基因序列,与本研究序列一同进行进化关系 分析。进化树显示,本研究获得的立克次体16S rRNA基因序列与Rickettsia raoultii进化关系最近,聚在同一个小分支,与其他15种立克次体同属于斑点热群立克次体（图6）。
3 讨论
对扇头蜱属蜱进行12S rRNA基因PCR扩增及测序,通过Blast比对分析,本研究获得GenBank登录号为MG744514的序列与数据库中多个图兰扇头蜱12S rRNA基因序列相似性达到99%以上。且与多种蜱及外围群尘螨的22个12S rRNA基因序列进化树显示,本研究12S rRNA基因序列与图兰扇头蜱进化关系最近,聚在同一个小分支。综合以上所述,本研究蜱样品为图兰扇头蜱。文献[5,6]也报道,图兰扇头蜱为新疆南部荒漠及半荒漠地区常见种和优势种,也有报道新疆伊宁县图兰扇头蜱具有生物多样性[19]。新疆南部图兰扇头蜱是否具有多样性及其他特征,需要进一步利用大量样本结合多个基因对其研究分析。另外一方面,本研究对雌性图兰扇头蜱及其产的卵进行立克次体16S rRNA基因PCR扩增及测序,其中一组蜱和卵样品PCR扩增均为阳性。测序结果通过Blast比对分析,本研究获得GenBank登录号为MG744513的序列与数据库中R. raoultii 16S rRNA基因序列相似性达到99%以上。且与24种立克次体16S rRNA基因序列进化树显示,本研究获得的立克次体16S rRNA基因序列与R. raoultii进化关系最近,聚在同一个小分支。参照文献[18,20]分析本研究获得的R. raoultii与其他12种立克次体同属于斑点热群立克次体。1999年,R. raoultii发现于短小扇头蜱和草原革蜱[21]。目前,欧洲、北美洲、南美洲和亚洲发现了这种立克次体[22]。中国,早在2008年吉林森林革蜱发现了R. raoultii[23],近年来西藏[24]、新疆[25,26,27]、黑龙江[28,29]等地区先后报道发现了R. raoultii。本研究补充了新疆南部发现R. raoultii,也证实了新疆确实存在R. raoultii,文献也报道R. raoultii为新疆的广布种[12]。2016年之前的报道,R. raoultii仅报道于蜱,至少有13种蜱（仅包括1种扇头蜱）,多见于革蜱[22],尤其西藏地区革蜱R. raoultii携带率高达84.6%[24]。本研究首次在图兰扇头蜱中发现了R. raoultii,且在雌蜱产的卵中也发现了R. raoultii。图兰扇头蜱对R. raoultii是偶然感染还是可以长期稳定传播、卵是否可以稳定多代传递该病原、新疆南部地域地貌和特殊气候等是否对图兰扇头蜱感染R. raoultii有影响等等,诸多问题均需要进一步研究,分析大量样品证实。但是,结合2016年石河子大学报道[26]新疆羊蜱蝇和新疆医科大学报道新疆长尾黄鼠检测到R. raoultii[27],新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室分析R. raoultii的宿主分布和其他特征还存在诸多未知。另外,本研究采集的蜱样通过形态学鉴定,均为扇头蜱属蜱,且随机取的5只蜱样分子生物学鉴定获得的12S rRNA基因序列一致,鉴定为图兰扇头蜱,即本研究绵羊宿主体外寄生单一种类蜱。结合本研究图兰扇头蜱R. raoultii的感染率为20%,且卵中检测到了R. raoultii,新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室分析图兰扇头蜱对R. raoultii的感染和传播可能有其复杂机制和重要意义。此外,近年来包括中国的多个国家报道R. raoultii对人致病,引起蜱传淋巴结炎和蜱传坏死红斑淋巴结病,受到了卫生部门及相关研究机构的关注[29,30]。关于R. raoultii感染宿主细胞的机制和在动物群体的流行病学研究等,需要相关****进一步研究。新疆南部地区需要长期对蜱、动物及人是否携带R. raoultii等蜱传病原进行监测,及时了解蜱传病原的动态,以便有效防控R. raoultii感染等蜱传病。
4 结论
在中国新疆南部首次发现图兰扇头蜱,其雌蜱及其卵携带斑点热群立克次体R. raoultii。这为深入研究R. raoultii经蜱传播奠定了基础。（责任编辑 林鉴非）
The authors have declared that no competing interests exist.
