0 引言
【研究意义】石灰性黄壤是贵州喀斯特山地的主要土壤类型之一,pH大于8.0,钙的含量高,磷、钾、铁、铜、锌等元素的有效性低是石灰性黄壤的重要特征[1]。对石灰性黄壤进行施肥后,高浓度的钙离子会降低土壤中磷、铁等元素的有效性,影响施肥的效果,这也是石灰性黄壤上刺梨（Rosa roxburghii）栽培中养分管理难以解决的问题。探究外源小分子有机酸活化石灰性黄壤养分作用和促进刺梨对养分吸收的方法,对于石灰性黄壤上刺梨的养分调控具有重要意义。【前人研究进展】前人研究表明,外源小分子量有机酸具有活化和释放土壤养分的作用。外源柠檬酸能够通过酸溶、螯合溶解、解吸附等作用提高土壤磷、铁、锰、锌等养分元素的有效含量[2,3,4,5]。柠檬酸对难溶性的磷、铁、锌溶螯能力很强,低浓度的柠檬酸即可产生溶螯作用,增加其有效性[6]。外源柠檬酸能够抑制土壤矿物对磷的吸附,能促进土壤有效磷的释放[7,8]。另有一些研究表明,外源柠檬酸提供了土壤微生物的碳源,能够改变土壤微生物的种群结构及数量,其中功能性微生物的作用能够促进土壤养分的释放[9,10,11]。在石灰土和砖红壤等土壤中添加固氮菌、解磷菌和解钾菌后,其氮、磷、钾等有效养分元素含量明显增加[12,13]。外源有机酸还能够增强与土壤有效养分相关的土壤酶活性,在石灰性土壤上施用柠檬酸后,土壤的碱性磷酸酶活性随柠檬酸浓度的增加而增强[9],在黏壤土上添加少量的甲酸可使其淀粉酶、脲酶和磷酸酶活性升高[11],以上酶的活性增强对提高土壤的氮、磷养分的有效含量有促进作用。外源小分子有机酸导入养分胁迫的土壤后对促进植物生长的作用已有不少报道。在栽植水曲柳（Fraxinus mandshurica）、兴安落叶松（Larix gmelinii）和落叶松（Larix olensis）幼苗的棕色土壤上导入适宜浓度的草酸和柠檬酸后,栽培土壤中磷、钾、铁等有效养分含量增加,幼苗对磷、钾、铁等养分元素的吸收量增加,明显促进了幼苗生长[14,15]。对平邑甜茶（Malus hupehensis）幼苗的棕壤栽培土导入柠檬酸和苹果酸后,促进生长的效果也十分明显[16]。外源柠檬酸促进植物生长的作用不仅与土壤养分的活化有关,而且与根系的形态及生理功能的改变也有关联。外源柠檬酸能够提高养分胁迫土壤上的万寿菊[6]、落叶松和水曲柳[14]、白羽扇豆[17]、玉米[18,19]、东南景天[20]和大豆[21]的根系活力,增加根系的表面积、根体积和总根尖数,从而增强根系对养分的获取和吸收能力,对油菜根系的苹果酸和柠檬酸分泌也有促进作用[22]。研究表明,适当浓度的外源有机酸促进了植物体内的硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、蔗糖转化酶等多种酶的活性[23],这种生理变化对养分的吸收利用有重要的促进作用。因此,外源柠檬酸不仅能够提高土壤养分的有效性,改善植物的营养供给条件,而且能够通过根系形态的改善截获更多的养分,并通过根系生理功能的改变增强养分的吸收,促进植物的生长。【本研究切入点】在贵州喀斯特山地石灰性黄壤上,刺梨的种植面积很大,土壤施肥的肥效较低一直是困扰生产者的问题,急需探索提高石灰性黄壤的养分有效性和促进刺梨生长的新途径。【拟解决的关键问题】探究利用外源柠檬酸提高石灰性黄壤养分的有效性和促进刺梨实生苗生长及养分吸收的效果,并解析相关作用机理,为喀斯特地区石灰性黄壤上刺梨栽培的土壤养分管理与调控提供依据。1 材料与方法
试验于2015—2016年在贵州省果树工程技术研究中心进行。1.1 试验材料
以‘贵农5号’刺梨实生苗为材料,种子采自贵州大学刺梨种质资源圃。为尽量减小种子间生长及营养吸收特性的差异,种子从一个单株上的果实中采集,为避免异花授粉后增大种子间差异,在开花期对采种单株用透光尼龙网罩进行异花授粉隔离。盆栽培养土为石灰性黄壤,取自贵阳花溪党武地区。培养土的pH为8.19,有机质含量4.28 g·kg-1,全氮1.45 g·kg-1,全磷0.44 g·kg-1,全钾11.78 g·kg-1,速效氮38.18 mg·kg-1,速效磷5.02 mg·kg-1,速效钾50.13 mg·kg-1,交换性钙2592.90 mg·kg-1,交换性镁577.05 mg·kg-1,有效铜0.18 mg·kg-1、有效锌0.67 mg·kg-1、有效铁4.87 mg·kg-1、有效锰14.68 mg·kg-1、有效硼0.24 mg·kg-1。试验所用培养容器为黑色塑料培养槽,其长、宽和高分别为34、28和25 cm。添加到土壤中的外源有机酸为柠檬酸（AR级,纯度≥99.5%）,由天津市科蜜欧化学试剂公司提供。分析检测土壤中有机酸种类及含量所用的有机酸标准品为草酸、酒石酸、苹果酸、丙二酸、柠檬酸、琥珀酸、乳酸、乙酸,均由上海源叶生物科技有限公司提供。土壤中细菌的培养采用牛肉膏蛋白胨培养基;真菌的培养采用PAD培养基;放线菌的培养采用高氏一号培养基;解有机磷细菌的培养采用牛肉膏蛋白胨蛋黄培养基;解无机磷细菌的培养采用磷酸三钙培养基,解钾细菌的培养采用亚历山大硅酸盐培养基;固氮菌的培养采用阿须贝培养基。
1.2 试验设计
试验设3个柠檬酸不同施用量处理,柠檬酸的施用量参考笔者对贵州喀斯特山地18个野生刺梨分布地刺梨根际土中柠檬酸含量测定结果设置,将扣除根际土含水量后折算的干重根际土中柠檬酸平均含量上调至整数40 mg·kg-1作为处理的最低施入量,分别设置每kg干土施入外源柠檬酸40、80和120 mg的3个处理,每个处理1槽,重复4次,每槽种植刺梨实生幼苗12株。以不施柠檬酸为对照。1.3 试验方法
1.3.1 材料培养 事先将试验土自然风干敲碎,过0.5 cm筛,后装入培养槽,每槽装土8 kg。在每年3月20日,将层积好的‘贵农5号’刺梨种子播种在1﹕1的腐殖土和蛭石中培养实生苗,4月初选取两叶1心、株高（3±0.3）cm、主根长（3±0.2）cm、基径（0.8±0.07）mm的实生幼苗移栽于石灰性黄壤的培养槽中进行培养,每槽植苗12株。试验材料置于透光避雨棚内培养,不同处理随机排列。整个培养时间为50 d,第1周进行预培养,然后分别按试验设计施入不同量的柠檬酸,柠檬酸以液体浇灌的方式分2次加入,间隔时间为24 h。在培养过程中定时定量浇水,每次的浇水量以槽底排水孔不流出为限,以免土壤中有机酸的流失。考虑到外源有机酸作用有效时间较短的时限性,参考KPOMBLEKOU等[18]报道的外源柠檬酸导入含磷矿石土壤后促进磷养分释放作用效果最好的时间段,在试验材料培养到第50天（外源柠檬酸处理后的第43天）,翻盆取不同处理的培养土和植株进行以下指标测定。1.3.2 培养土pH和营养元素含量的测定 用PHS-3CT型数字显示酸度计测定pH。参照鲍士旦[24]的方法,全氮含量用凯氏法测定,速效氮的含量用碱解扩散法测定,全磷和速效磷的含量用钼锑抗比色法测定,全钾和速效钾的含量用火焰光度计法测定,交换性钙、交换性镁和有效铁、锰、锌、铜的含量用原子吸收分光光度计法测定,有效硼含量用姜黄素比色法测定。
1.3.3 培养土中微生物及功能性细菌的测定 细菌、真菌、放线菌数量测定用稀释平板法[25],解有机磷细菌、解无机磷细菌、解钾细菌和固氮菌数量的测定参照纪巧凤[26]的方法。
1.3.4 培养土中酶活性测定 取培养土风干、碾碎过1 mm筛后测定土壤酶活性,碱性磷酸酶（ALP）、脲酶、蛋白酶、硝酸还原酶（NR）、蔗糖酶和淀粉酶活性测定分别参照关松萌[27]的磷酸苯二钠比色法、苯酚-次氯酸钠比色法、用茚三铜比色法、酚二磺酸比色法和3,5-二硝基水杨酸比色法。培养土的铁还原酶活性用2,2’-联吡啶法测定[28]。
1.3.5 培养土中有机酸含量的测定 称取25 g培养土溶于100 mL超纯水中,摇匀过滤后用树脂法[29]分离纯化,滤液以0.5—0.6 mL·min-1流速依次分别通过阳离子和阴离子交换树脂柱,再将滞留在阴离子交换柱内的有机酸组分用1 mol·L-1 HCl洗脱,洗脱的过柱流速为0.4—0.5 mL·min-1。洗脱液在50℃下旋转蒸发浓缩至近干,用超纯水洗出浓缩液定容至10 mL,过0.45 μm孔径水系滤膜后在Waters600高效液相色谱仪上测定有机酸组分和含量。色谱柱为Wondasil C18型（150 mm×4.6 mm,5 μm）,流动相A为0.022 mol·L-1 KH2PO4溶液（pH 2.2）,流动相B为CH3OH（色谱纯）,色谱柱温度为30℃,进样量为20 μL,紫外检测波长为210 nm,洗脱模式为等浓度梯度洗脱,总流速0.7 mL·min-1,流动相B浓度3.0%。标准曲线的绘制：先配制10 mg·mL-1的草酸、酒石酸、苹果酸、丙二酸、柠檬酸、琥珀酸、乳酸标准储备液和1 mg·mL-1的乙酸标准储备液。按照1﹕5﹕10﹕10﹕10﹕10﹕10﹕10的体积比吸取各有机酸标准储备液,按照试验需要配制不同浓度的混合标准液。以质量浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。
1.3.6 植株营养元素含量的测定 参照鲍士旦[24]的方法,整株的用凯氏法测定N含量,用钼锑抗比色法测定P含量,用火焰光度计法测定K含量,用原子吸收分光光度计法测定Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn含量,用姜黄素比色法测定B含量。
1.3.7 植株营养元素吸收量的计算 根据植株中各种营养元素的含量和植株生物量,按以下公式计算植株的营养元素吸收量。
元素吸收量（mg/株）=整株干重生物量（g）×元素含量（mg·g-1）。
1.3.8 根系有机酸含量的测定 称取1.5 g鲜根,加3 mL蒸馏水和少许石英砂研磨成匀浆,转移至离心管中定容至10 mL,在45℃水浴中提取15 min后离心,取上清液过0.45 μm滤膜后在Waters 600高效液相色谱仪上测定有机酸组分和含量。
1.3.9 根系活力和酶活性的测定 根系活力参照张志良等[30]的TTC法测定,根系中硝酸还原酶活性测定采用活体法[30],谷氨酰胺合成酶参照陈煜等[31]的方法测定,碱性磷酸酶和分泌性碱性磷酸酶活性分别采用对硝基苯酚比色法和Mclanchlan法测定[32],铁还原酶的活性用2,2’-联吡啶法测定[33]。
1.3.10 生长指标的测定 测定不同处理植株高度、基茎粗度后,取不同处理植株烘干后测定整株及根系、地上部干重生物量,计算根冠比值。另取不同处理的根系,用Epson4990根系扫描仪（支持软件为EpsonExpress1000XL1.0版）和根系图像分析系统WinRhizo测定根系总长度、总表面积、总体积、平均直径和总根尖数。
1.4 试验数据处理
本文报道的数据为两年试验测定结果的平均值。在Excel上进行数据统计,用DPS v7.05 统计软件进行显著性和相关性分析,多重比较采用Duncan’s 新复极差法。2 结果
2.1 外源柠檬酸不同施用量对刺梨实生苗的石灰性黄壤培养土营养元素含量及pH的影响
2.1.1 对石灰性黄壤培养土pH的影响 施入外源柠檬酸后能明显降低石灰性黄壤培养土的pH。图1显示,柠檬酸不同施入量的3个处理培养土的pH均小于对照,其差异达到显著水平（P<0.05）,随着柠檬酸施入量增加,培养土的pH明显降低。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1外源柠檬酸不同施用量对石灰性黄壤培养土pH值的影响
-->Fig. 1Effects of different applied amounts of exogenous citric acid on pH value of calcareous yellow
-->
2.1.2 对石灰性黄壤培养土中营养元素含量的影响 表1显示,在施入柠檬酸的3个处理中,土壤氮、磷、钾、铁、锌、硼的有效含量和交换性钙元素的含量都比对照有了明显的增加,说明外源柠檬酸具有促进石灰性黄壤中氮、磷、钾养分的释放和增强上述元素有效性的作用。从表1还可以看出,80 mg·kg-1柠檬酸处理中速效磷、钾,有效硼和交换性钙元素的含量最高,与对照和其他两个处理差异达到显著水平（P<0.05）,速效氮,有效铁和锌的含量随柠檬酸施入量的增加而增大,有效锰和铜的含量随施入量的增加而明显降低,交换性镁含量变化不明显。
Table 1
表1
表1外源柠檬酸的不同施用量对刺梨实生苗的石灰性黄壤培养土中有效态营养元素含量的影响
Table 1Effects of different applied amounts of exogenous citric acid on available nutrients in cultivated soil of calcareous yellow soil of Rosa roxburghii seedlings
| 柠檬酸施用量 Applied amounts of citric acid (mg·kg-1) | 速效氮 Available N | 速效磷Available P | 速效钾 Available K | 交换性钙 Exchangeable Ca | 交换性镁 Exchangeable Mg | 有效性铁 Available Fe | 有效性锰 Available Mn | 有效性铜 Available Cu | 有效性锌 Available Zn | 有效性硼 Available B |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| (mg·kg-1) | ||||||||||
| 0 | 40.22±1.46d | 5.03±0.25c | 47.41±1.13b | 2371.80±113.00c | 553.67±25.30a | 5.06±0.21c | 24.47±0.59a | 0.39±0.00a | 0.75±0.02c | 0.91±0.05d |
| 40 | 60.86±1.92c | 5.93±0.10b | 51.34±2.13a | 2377.80±104.20b | 549.33±23.86a | 5.20±0.23c | 21.75±0.32b | 0.36±0.01b | 1.02±0.01b | 1.03±0.04b |
| 80 | 69.59±2.29b | 6.50±0.15a | 52.16±2.03a | 2896.60±178.00a | 541.67±26.48a | 5.32±0.14b | 21.72±0.32b | 0.30±0.01c | 1.04±0.02b | 1.74±0.02a |
| 120 | 76.47±1.46a | 6.36±0.12a | 48.41±1.73b | 2089.20±100.60d | 536.11±23.00a | 6.67±0.20a | 13.45±0.12c | 0.21±0.01d | 1.09±0.02a | 0.82±0.03c |
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2.2 外源柠檬酸不同施入量对刺梨实生苗的石灰性黄壤培养土中微生物种群结构的影响
2.2.1 对细菌、真菌和放线菌数量的影响 外源柠檬酸导入石灰性黄壤培养土后,培养土中细菌、真菌和放线菌总数发生了明显的改变。表2显示,细菌是3大微生物中的优势种群,其数量最多,3个处理中的细菌总数随柠檬酸导入量的增加而增大,而真菌和放线菌的数量随柠檬酸导入量的增加而减少。细菌总数的增加与外源柠檬酸导入后增加了细菌繁殖的碳源有关。真菌和放线菌数量的减少可能与其对碳源的利用特性和对pH变化的适应性有关。Table 2
表2
表2外源柠檬酸不同施入量对刺梨实生苗的石灰性黄壤培养土中微生物数量的影响
Table 2Effects of different applied amounts of exogenous citric acid on microbial numbers in cultivated soil of calcareous yellow soil of Rosa roxburghii seedlings
| 柠檬酸施用量 Applied amounts of citric acid (mg·kg-1) | 细菌 Bacteria (×107 CFU/g) | 真菌 Fungi (×104 CFU/g) | 放线菌 Actinomycetes (×105 CFU/g) | 功能细菌Functional bacteria | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 解无机磷细菌 Inorganic phosphorus bacteria (×105 CFU/g) | 解有机磷细菌 Organic phosphorus bacteria (×105 CFU/g) | 解钾细菌 Potassium bacteria (×105 CFU/g) | 固氮菌 Nitrogen-fixing bacteria (×105 CFU/g) | ||||
| 0 | 1.15±0.03c | 0.26±0.04a | 4.25±0.12a | 165.67±8.51c | 169.00±8.19d | 146.50±6.50d | 217.50±10.50b |
| 40 | 1.80±0.04b | 0.18±0.03b | 3.11±0.04b | 188.67±7.23b | 189.33±8.74c | 167.50±8.30c | 221.50±11.50a |
| 80 | 1.87±0.07b | 0.17±0.04b | 1.44±0.09c | 474.00±15.75a | 277.33±12.58a | 249.50±14.50a | 200.50±10.05c |
| 120 | 2.21±0.11a | 0.09±0.00c | 1.15±0.05d | 135.33±7.56d | 210.00±10.58b | 179.50±9.05b | 171.00±8.00d |
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2.2.2 对功能性细菌数量的影响 外源柠檬酸导入培养土后,能够明显增加功能性细菌的数量。从表2看出,40 mg·kg-1和80 mg·kg-1两个处理的解无机磷菌数量明显大于对照和120 mg·kg-1的处理。在3个处理的培养土中,解有机磷菌和解钾菌的数量都明显大于对照。80 mg·kg-1柠檬酸处理的解磷菌和解钾菌的数量最大。3个处理的固氮菌数量随着柠檬酸施入量的增加而减少,40 mg·kg-1柠檬酸处理的固氮菌数量最多,与其他处理和对照的差异达到了显著水平（P<0.05）。功能性细菌数量的增加对促进石灰性黄壤的养分活化与释放和促进刺梨实生苗的生长具有重要作用。
2.3 外源柠檬酸不同施入量对培养土中酶活性的影响
外源柠檬酸导入培养土后,明显增强了土壤中与养分相关的酶活性。表3显示,施入柠檬酸的3个处理中,土壤脲酶、碱性磷酸酶、蛋白酶、硝酸还原酶、蔗糖酶和铁还原酶的活性均高于对照,其差异达到显著水平（P<0.05）,其中80 mg·kg-1处理的碱性磷酸酶、蛋白酶和蔗糖酶的活性最高。脲酶、硝酸还原酶和铁还原酶的活性随柠檬酸的施入量增加而增强,淀粉酶活性则与此相反。上述土壤酶的活性增强,可使石灰性黄壤的养分状况得到改善,从而有利于刺梨实生苗对养分的吸收。Table 3
表3
表3外源柠檬酸不同施用量对刺梨实生苗的石灰性黄壤培养土中酶活性的影响
Table 3Effects of different applied amounts of exogenous citric acid on the enzyme activities in cultivated soil of calcareous yellow soil of Rosa roxburghii seedlings
| 柠檬酸施用量 Applied amounts of citric acid (mg·kg-1) | 脲酶 Urase (mg·g-1) | 硝酸还原酶 NR (mg·g-1) | 碱性磷酸酶 ALP (mg·g-1) | 铁还原酶 Fe3+ reductase (mg·g-1) | 蛋白酶 Protase (mg·g-1) | 蔗糖酶 Sucrase (mg·g-1) | 淀粉酶 Diastase (mg · g-1) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0 | 0.15±0.02c | 0.09±0.01d | 2.87±0.03c | 1.43±0.05c | 0.55±0.02b | 11.81±0.45d | 1.18±0.00a |
| 40 | 0.21±0.01b | 0.17±0.04c | 4.48±0.02a | 1.57±0.04b | 0.58±0.04b | 64.12±2.28b | 1.10±0.02b |
| 80 | 0.23±0.02b | 0.20±0.02b | 4.50±0.04a | 1.47±0.05b | 0.73±0.06a | 85.03±4.05a | 1.05±0.01c |
| 120 | 0.27±0.02a | 0.28±0.01a | 4.32±0.06b | 1.79±0.11a | 0.68±0.02a | 26.26±1.35c | 1.02±0.01d |
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2.4 外源柠檬酸不同施用量对培养土中的小分子有机酸组分及含量的影响
外源柠檬酸施入石灰性黄壤后能够增加刺梨实生苗培养土中小分子有机酸的含量,但对有机酸种类没有改变。表4显示,在外源柠檬酸处理的培养土和对照土壤中,均检测到酒石酸、柠檬酸、草酸、乙酸和苹果酸,说明小分子有机酸的种类在土壤中没有增加。在3个处理的培养土中,酒石酸、柠檬酸、苹果酸、乙酸的含量和有机酸总量均比对照高,处理与对照的差异达到显著水平（P<0.05）,其中在80 mg·kg-1柠檬酸处理的培养土中,酒石酸和苹果酸的含量及有机酸总量都最大。培养土中的柠檬酸含量随外源柠檬酸施入量的增加而增大,这可能是施入外源柠檬酸后导致的。3个处理的草酸含量都比对照的低,这可能与草酸容易与土壤中的钙离子形成草酸钙盐沉淀有关[34]。外源柠檬酸施入石灰性黄壤后增加了酒石酸、乙酸和苹果酸的含量,可能与刺梨实生苗光合碳的增加和根系形态及碳素循环生理发生变化后根系分泌能力增强有关,此外,土壤细菌总数及功能菌数量的增加也会增多土壤中有机酸等代谢产物。Table 4
表4
表4外源柠檬酸不同施用量对刺梨实生苗的石灰性黄壤培养土中小分子有机酸种类及含量的影响
Table 4Effects of different applied amounts of exogenous citric acid on the variety and contents of low molecular organic acids in cultivated soil of calcareous yellow soil of Rosa roxburghii seedlings
| 柠檬酸施用量 Applied amounts of citric acid (mg·kg-1) | 种类及含量The varieties and content (mg·g-1) | 有机酸总量 Total content of organic acids (mg·g-1) | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 酒石酸 Tartaric acid | 柠檬酸 Citric acid | 草酸 Oxalic acid | 乙酸 Acetic acid | 苹果酸 Malic acid | ||
| 0 | 1.70±0.05c | 1.02±0.07c | 0.60±0.03a | 0.39±0.01b | 0.16±0.01d | 3.16±0.11d |
| 40 | 3.55±0.08b | 1.28±0.04b | 0.39±0.03b | 0.65±0.01a | 0.30±0.01c | 5.28±0.14c |
| 80 | 6.94±0.30a | 1.31±0.02b | 0.47±0.01b | 0.39±0.02b | 0.57±0.02a | 9.39±0.28a |
| 120 | 5.85±0.20a | 1.39±0.02a | 0.37±0.03b | 0.26±0.01c | 0.37±0.02b | 8.13±0.23b |
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2.5 外源柠檬酸不同施用量对刺梨实生苗吸收营养元素的影响
2.5.1 对刺梨实生苗中营养元素含量的影响 外源柠檬酸能够提高刺梨实生苗植株中多种营养元素的含量,其作用的大小因柠檬酸施入量的不同而异。从表5可以看出,施入柠檬酸的3个处理的刺梨实生苗中N、P、K、Ca、Fe、Mn、Cu、Zn和B等9种元素的含量均明显高于对照,其中,80 mg·kg-1柠檬酸处理的N、P、K、Ca、Cu、Zn、B元素的含量最高,与对照和其他两个处理的差异明显,植株中N、Fe、Cu的含量均随外源柠檬酸施入量的增加而明显增大,Mg和Mn的含量随柠檬酸施入量的增加而明显降低。Table 5
表5
表5外源柠檬酸的不同施用量对刺梨实生苗营养元素含量的影响
Table 5Effects of different applied amounts of exogenous citric acid on contents of nutrient elements for Rosa roxburghii seedlings
| 柠檬酸施用量 Applied amounts of citric acid (mg·kg-1) | 氮N (%) | 磷P (%) | 钾K (%) | 钙Ca (g·kg-1) | 镁Mg (g·kg-1) | 铁Fe (mg·kg-1) | 锰Mn (mg·kg-1) | 铜Cu (mg·kg-1) | 锌Zn (mg·kg-1) | 硼B (mg·kg-1) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0 | 1.52±0.01c | 0.16±0.01c | 0.76±0.04c | 8.57±0.26d | 1.41±0.01a | 124.25±5.03c | 253.77±10.14c | 5.83±0.29c | 15.13±1.00d | 34.08±1.19d |
| 40 | 1.82±0.08b | 0.19±0.01b | 0.87±0.02b | 9.42±0.32c | 1.37±0.01b | 150.83±5.87b | 425.03±18.82a | 7.20±0.45b | 26.87±1.05b | 43.67±1.69b |
| 80 | 2.15±0.00a | 0.31±0.01a | 1.04±0.04a | 13.49±0.41a | 1.25±0.00c | 151.76±5.97b | 352.33±17.35b | 9.07±0.50a | 29.57±1.23a | 64.48±1.93a |
| 120 | 2.08±0.05a | 0.20±0.02b | 0.80±0.01c | 13.06±0.36b | 1.17±0.02d | 181.49±8.63a | 252.50±12.55c | 8.37±0.48ab | 24.77±0.76c | 36.63±1.69c |
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2.5.2 对刺梨实生苗营养元素吸收量的影响 外源柠檬酸能明显促进石灰性黄壤上刺梨实生苗对多种营养元素的吸收。表6显示,在施入柠檬酸的3个处理中,刺梨实生苗对氮、磷、钾、钙、镁、铁、锰、锌、硼元素的吸收量均明显高于对照,3个处理间和处理与对照间上述元素吸收量的差异达到显著水平（P<0.05）。不同处理对刺梨实生苗铜的吸收量无明显影响。在40 mg·kg-1柠檬酸的处理中锰的吸收量最大,而再增加柠檬酸施用量后锰的吸收量降低,说明在石灰性黄壤上施入较低浓度的柠檬酸有利于刺梨实生苗对锰的吸收。在80 mg·kg-1柠檬酸处理中,刺梨实生苗对氮、磷、钾、钙、镁、铁、锌、硼的吸收量最大,处理和对照间差异达到显著水平（P<0.05）,说明适宜的柠檬酸施入量有利于刺梨实生苗对这些营养元素的吸收,柠檬酸施入量过少或过多都会影响吸收效果。
Table 6
表6
表6外源柠檬酸不同施用量对刺梨实生苗的营养元素吸收量的影响
Table 6Effects of different applied amounts of exogenous citric acid on uptaking contents of nutrients for Rosa roxburghii seedlings
| 柠檬酸施用量 Applied amounts of citric acid (mg·kg-1) | 氮 N | 磷 P | 钾 K | 钙 Ca | 镁 Mg | 铁 Fe | 锰 Mn | 铜 Cu | 锌 Zn | 硼 B | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| (mg/plant) | |||||||||||||||||||
| 0 | 18.37±0.45d | 1.99±0.11c | 9.46±0.34d | 10.72±0.34d | 1.39±0.06d | 0.15±0.00d | 0.32±0.01d | 0.01±0.00a | 0.02±0.00c | 0.04±0.00d | |||||||||
| 40 | 27.50±1.36c | 3.16±0.14b | 14.22±0.57b | 16.03±0.59c | 2.26±0.04b | 0.25±0.00c | 0.70±0.01a | 0.01±0.00a | 0.04±0.00b | 0.07±0.00b | |||||||||
| 80 | 41.29±1.62a | 5.80±0.23a | 19.68±0.97a | 25.46±1.13a | 2.40±0.04a | 0.29±0.01a | 0.66±0.01b | 0.01±0.00a | 0.06±0.00a | 0.12±0.00a | |||||||||
| 120 | 34.02±1.32b | 3.01±0.11b | 12.20±0.54c | 20.02±1.02b | 1.74±0.04c | 0.28±0.01b | 0.39±0.01c | 0.01±0.00a | 0.04±0.00b | 0.06±0.00c | |||||||||
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2.6 外源柠檬酸不同施用量对刺梨实生苗根系中有机酸种类及含量的影响
对石灰性黄壤施入外源柠檬酸后,没有增加刺梨实生苗根系中小分子有机酸的种类,但根系中不同的有机酸含量却发生了明显的变化。从表7看出,施入柠檬酸的3个处理和对照根系中,检测到柠檬酸、苹果酸、酒石酸、草酸、乙酸和琥珀酸等6种小分子有机酸,3个处理根系中的苹果酸、酒石酸、乙酸和琥珀酸的含量均比对照高,而柠檬酸和草酸的含量都比对照低,不同处理间和处理与对照间的差异达到显著水平（P<0.05）。在80 mg·kg-1柠檬酸处理的根系中,酒石酸和乙酸含量最大。根系中的苹果酸含量随外源柠檬酸施入量的增加而明显增大,而柠檬酸、草酸、琥珀酸的含量和有机酸总量随外源柠檬酸施入量的增加而降低。以上结果说明,外源柠檬酸可能对根系中有机酸的构成有调节作用。根系中的柠檬酸含量的降低与施入外源柠檬酸后对根系中柠檬酸合成产生反馈抑制有关,而根系中的草酸含量减少与根系中的草酸和钙离子相结合形成草酸钙有关联[34]。根系中其他有机酸含量的增加可能与刺梨实生苗生长增强后光合碳的增长和碳素代谢转化有联系。Table 7
表7
表7外源柠檬酸不同施用量对刺梨实生苗根系小分子有机酸种类和含量的影响
Table 7Effects of different applied amounts of exogenous citric acid on variety and contents of low molecular organic acids in roots of Rosa roxburghii seedlings
| 柠檬酸施用量 Applied amounts of citric acid (mg·kg-1) | 种类及含量The varieties and content (μg·g-1) | 有机酸总量 Total content of organic acids(μg·g-1) | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 柠檬酸 Citric acid | 苹果酸 Malic acid | 酒石酸 Tartaric acid | 草酸 Oxalic acid | 乙酸 Acetic acid | 琥珀酸 Succinic acid | ||
| 0 | 929.52±39.58a | 364.64±15.99d | 190.34±10.24d | 834.53±40.36a | 36.11±1.62d | 33.16±1.43d | 2441.65±113.08b |
| 40 | 805.71±31.71b | 437.58±19.65c | 291.14±12.85b | 807.66±39.81a | 130.40±5.92b | 195.27±8.43a | 2681.08±168.53a |
| 80 | 737.57±30.11c | 565.32±21.59b | 368.66±16.33a | 465.05±20.68b | 157.20±7.51a | 106.53±5.60b | 2406.53±131.45b |
| 120 | 581.51±26.82d | 687.32±33.28a | 221.95±11.97c | 435.69±21.94b | 51.19±2.18c | 75.48±3.16c | 2006.45±103.94c |
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2.7 外源柠檬酸不同施用量对刺梨实生苗根系活力和酶活性的影响
施入外源柠檬酸能够提高刺梨实生苗根系活力和酶的活性。表8显示,3个处理根系的硝酸还原酶、碱性磷酸酶、铁还原酶、谷氨酰胺合成酶和分泌性碱性磷酸酶的活性均高于对照,其差异达到显著水平（P<0.05）,其中80 mg·kg-1处理的根系活力、碱性磷酸酶、谷氨酰胺合成酶和分泌性碱性磷酸酶的活性最高。硝酸还原酶和铁还原酶的活性随柠檬酸的施入量增加而增强。硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性的增强,有利于刺梨实生苗根系对氮的吸收利用,而分泌性碱性磷酸酶和铁还原酶能够通过根系分泌到体外,对改善石灰性黄壤中磷、铁养分的有效性和增强刺梨实生苗对磷、铁养分的吸收有重要作用。Table 8
表8
表8外源柠檬酸不同施用量对刺梨实生苗根系活力和酶活性的影响
Table 8Effects of different applied amounts of exogenous citric acid on the root activity and enzyme activities in roots of Rosa roxburghii seedlings
| 柠檬酸施用量 Applied amounts of citric acid (mg·kg-1) | 根系活力 Root activity (mg·g-1·h-1) | 硝酸还原酶 NR (μg·g-1·min-1) | 碱性磷酸酶 ALP (μg·g-1·min-1) | 铁还原酶 Fe3+ reductase (μmol·g-1·h-1) | 谷氨酰胺合成酶 Gs (OD·mg-1·h-1) | 分泌性碱性磷酸酶SAP in root (μg·g-1·min-1) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 0 | 0.16±0.01d | 0.13±0.00d | 3.06±0.14d | 4.70±0.14d | 0.14±0.01c | 1.30±0.04d |
| 40 | 0.31±0.01b | 0.19±0.01c | 3.94±0.18c | 7.14±0.39c | 0.18±0.01b | 1.68±0.08b |
| 80 | 0.37±0.01a | 0.26±0.01b | 6.46±0.23a | 8.29±0.36b | 0.28±0.02a | 1.79±0.06a |
| 120 | 0.24±0.01c | 1.18±0.01a | 5.62±0.12b | 9.56±0.20a | 0.18±0.01b | 1.45±0.03c |
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2.8 外源柠檬酸不同施用量对石灰性黄壤上刺梨实生苗生长和根系形态的影响
2.8.1 对刺梨实生苗生长的影响 外源柠檬酸导入石灰性黄壤后能够明显促进刺梨实生苗生长及根系的发育。从图2看出,施入柠檬酸处理的刺梨实生苗都比对照生长得好,根系发育状况明显好于对照,不施柠檬酸的对照生长效果最差,地上部及根系发育很弱。表9显示,3个柠檬酸不同施用量处理的刺梨实生苗植株高度、基径粗度、整株的干重生物量和根冠比值均高于对照,相互间的差异均达到显著水平（P<0.05）,其中80 mg·kg-1柠檬酸处理的刺梨实生苗株高、基径粗度、整株干重生物量和根冠比值都最大,根系最为发达,然后依次为40 mg·kg-1和120 mg·kg-1的处理,对照的株高、基径粗度、整株干重生物量和根冠比值都最小,说明外源柠檬酸对促进石灰性黄壤上刺梨实生苗生长和根系发育的效果因施入量的不同而表现出明显差异,外源柠檬酸对石灰性黄壤上刺梨实生苗生长的促进作用与石灰性黄壤的养分活化和释放有关。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2外源柠檬酸的不同施用量对石灰性黄壤上刺梨实生苗生长的影响
-->Fig. 2Effects of different applied amounts of exogenous citric acid on the growth of Rosa roxburghii seedlings growing on calcareous yellow soil
-->
Table 9
表9
表9外源柠檬酸不同施用量对石灰性黄壤上刺梨实生苗株高、基径、生物量及根冠比的影响
Table 9Effects of different applied amounts of exogenous citric acid on the plant height, base diameter and the weight biomass and root-shoot ratio of Rosa roxburghii growing on calcareous yellow soil
| 柠檬酸施用量 Applied amounts of citric acid (mg·kg-1) | 株高 Plant height (mm) | 基径 Base diameter (mm) | 干重生物量Dry weight biomass (g/plant) | 根冠比 Root-shoot ratio | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 地上部 Above ground part | 根系 Root | 整株 The whole plant | ||||
| 0 | 93.39±3.29d | 1.31±0.03c | 0.81±0.03d | 0.43±0.00d | 1.24±0.03d | 0.54±0.02c |
| 40 | 167.22±7.98b | 1.38±0.04b | 1.02±0.04b | 0.62±0.00b | 1.64±0.02b | 0.60±0.02b |
| 80 | 238.27±12.80a | 1.54±0.06a | 1.10±0.05a | 0.79±0.01a | 1.89±0.03a | 0.72±0.02a |
| 120 | 147.27±7.48c | 1.43±0.02b | 0.95±0.02c | 0.57±0.01c | 1.53±0.01c | 0.61±0.02b |
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2.8.2 对刺梨根系形态的影响 施入外源柠檬酸会使石灰性黄壤上刺梨实生苗的根系形态发生变化,而且这种变化依柠檬酸施入量的多少而表现出差异。表10显示,3个施入柠檬酸处理的根系总长度、总表面积、总体积和总根尖数都明显高于对照,相互间差异达到显著水平（P<0.05）,80 mg·kg-1柠檬酸处理的根系总长度、总表面积和总体积都最大,40 mg·kg-1处理次之,120 mg·kg-1处理的最小。80 mg·kg-1和120 mg·kg-1两个处理根的平均直径明显大于40 mg·kg-1的处理和对照。刺梨实生苗根系总长度、总表面积、总体积和总根尖数的增加,对促进养分的吸收和生长有重要的作用。
Table 1
表1
表10 外源柠檬酸不同施用量对石灰性黄壤上刺梨实生苗根系形态指标的影响
Table 10 Effects of different applied amounts of exogenous citric acid on root morphology index of Rosa roxburghii seedlings growing on calcareous yellow soil
| 柠檬酸施用量 Applied amounts of citric acid (mg·kg-1) | 总长度 Root length (cm) | 总表面积 Surface area (cm2) | 总体积 Volume (cm3) | 总根尖数 Tips (No./plant) | 平均直径 Average diameter (mm) |
|---|---|---|---|---|---|
| 0(ck) | 24.54±1.05d | 10.22±0.78d | 0.14±0.01d | 159.00±14.16d | 0.45±0.02c |
| 40 | 51.26±1.39b | 17.80±0.97b | 0.35±0.02b | 284.50±13.55c | 0.47±0.02c |
| 80 | 63.52±2.62a | 23.55±1.13a | 0.38±0.01a | 372.00±16.43a | 0.61±0.02a |
| 120 | 44.81±1.38c | 15.38±0.64c | 0.31±0.01c | 356.00±15.87b | 0.54±0.01b |
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3 讨论
3.1 石灰性黄壤施入外源柠檬酸后促进刺梨实生苗生长的作用机制
外源柠檬酸施入石灰性黄壤后能够促进刺梨实生苗的生长和养分吸收,是土壤养分状况改善和刺梨实生苗根系吸收利用养分的能力增强共同作用的结果。在这一作用机制中,外源柠檬酸通过促进土壤养分的活化与释放对改善刺梨实生苗的营养条件具有十分重要的作用。外源柠檬酸的酸溶、螯合溶解、解吸附等作用对提高土壤中磷、铁、锰、锌等养分元素的有效含量产生了重要的直接作用[2,3,4,5,6,7,8],此外,外源柠檬酸施入石灰性黄壤后的养分活化与微生物和土壤酶的作用也有密切的关系。外源柠檬酸通过对土壤微生物提供碳源,能够改变土壤微生物的种群结构,增加溶磷和溶钾等功能性细菌的数量,进而促进土壤中矿物磷和矿物钾的溶释,增加有效磷和有效钾含量[35,36]。外源柠檬酸能够增强土壤中脲酶、硝酸还原酶、磷酸酶、铁还原酶和蔗糖酶、蛋白酶等多种养分酶的活性[9,10],这对土壤有机质的分解和有效养分的增加都有重要的作用。然而,外源柠檬酸施入石灰性黄壤后,刺梨实生苗根系形态的变化和酶活性的增强对加强自身的养分吸收也有积极的作用,施入柠檬酸处理的根系总长度、总表面积、总体积和总根尖数都明显增大,这有利于增强刺梨实生苗根系对石灰性黄壤中有限养分的截获能力,类似的结果在水曲柳和兴安落叶松[14]、平邑甜茶[16]、玉米[18,19]、大豆[21]等多种植物上都有报道。外源柠檬酸能够增强植物根系的活力和根系中多种养分转化酶的活性[22-23,37]。本研究中,石灰性黄壤施入外源柠檬酸后,刺梨实生苗根系中的硝酸还原酶、碱性磷酸酶、铁还原酶、谷氨酰胺合成酶和分泌性碱性磷酸酶的活性都明显提高,这对提高刺梨根系主动获取土壤中磷、铁养分的能力和加强养分吸收与利用都具有积极的促进作用。刺梨实生苗根系中分泌性碱性磷酸酶的活性增强,也有利于促进石灰性黄壤有机质中有机磷转化,增加刺梨根际的无机磷含量。因此,在石灰性黄壤上施入柠檬酸能够促进刺梨实生苗的养分吸收和生长是上述机制协同作用的结果。在这一过程中,土壤养分活化是外在条件改善,根系形态的改善和养分转化酶活性的提高是刺梨实生苗增强养分吸收的内在动力。3.2 外源柠檬酸对提高石灰性黄壤培养土和刺梨根系中小分子量有机酸含量的作用
土壤中小分子量有机酸来源于植物根系的分泌、土壤细菌和真菌合成代谢和土壤有机物的分解[2],其中光合碳的输入和转化是植物根系有机酸分泌量多少的重要前提。在本研究中,土壤中的酒石酸、乙酸和苹果酸的含量增加可能与刺梨实生苗光合碳合成和转化能力增强有间接的联系,同时与根系形态变化后导致分泌能力增强有关。外源柠檬酸施入石灰性黄壤后,促进了刺梨实生苗的生长,增大了光合叶面积,这有利于增加刺梨实生苗体内的光合碳量,提高有机酸转化的物质基础。王志颖[22]的研究表明,施入外源柠檬酸能够提高油菜根系中苹果酸含量,其机理是外源柠檬酸能够增强顺乌头酸酶的活性,顺乌头酸酶是碳素三羧酸循环中的关键酶,其活性增强能够促进柠檬酸转化为琥珀酸,琥珀酸进一步反应合成苹果酸,在这一过程中根系中琥珀酸和苹果酸的含量增加。因此,刺梨实生苗根系中琥珀酸和苹果酸的增加可能与此有关。在施入柠檬酸的石灰性黄壤上,刺梨实生苗根系数量、表面积和根尖数的增加对增强根系有机碳组分的分泌无疑有积极的作用,类似的情况在白羽扇豆[17]和油菜[22,37]等植物上已有报道。微生物的代谢活动能够增加土壤中有机酸含量。外源柠檬酸施入土壤后能够增加细菌数量[2,3],细菌在分解土壤中有机质的过程中能够释放小分子量的有机酸。对溶磷菌的溶磷效果的研究发现,在接种溶磷菌的培养基中,有柠檬酸、苹果酸、乙酸和琥珀酸等小分子有机酸产生[38,39,40]。然而,更多研究者认为,植物根系有机酸的分泌是一种反馈调节机制,环境中的有机酸浓度对植物根系有机酸分泌种类、强度具有抑制作用。在本研究中,施入外源柠檬酸后,石灰性黄壤中柠檬酸含量的增加与外源柠檬酸的直接输入有关。随施入石灰性黄壤的外源柠檬酸浓度增加,刺梨根系中的柠檬酸含量随之减少,这是外源柠檬酸反馈抑制的结果,而根系和培养土中草酸含量的降低可能与石灰性黄壤中过高的钙离子浓度有关,草酸与钙离子结合形成的草酸钙几乎不溶于水[34]。3.3 外源柠檬酸对土壤酶活性增强和功能性微生物增加的作用
大量的研究表明,外源有机酸能够增强多种土壤酶的活性[9,10,11],但对其机理的研究报道很少。有研究报道认为,土壤pH是影响部分土壤养分酶活性的重要因素,土壤中脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶的活性在不同的土壤pH条件下各自都表现出明显差异[41,42],因此,施入柠檬酸后石灰性黄壤的pH明显降低可能对土壤酶活性产生重要影响。前人的研究结果表明,土壤胶体、矿物和腐殖质对土壤酶具有吸附作用,从而能够降低土壤酶的活性[43]。外源柠檬酸能竞争土壤胶体和矿物对土壤酶的吸附位点,从而使土壤胶体和矿物对土壤酶的吸附作用减弱,增强了土壤的酶活性[44,45],在本研究中,外源柠檬酸施入石灰性黄壤后多种土壤酶活性增强与此有关。外源小分子有机酸能够增加土壤中微生物利用的碳源物质,降低土壤的pH,改善土壤的生态及营养环境,有利于土壤微生物及功能菌的繁殖生长[2,3]。外源小分子有机酸虽然都具有上述作用,但施入土壤后的作用强度以及持续时间依小分子有机酸的不同种类而有差异。对于降低土壤pH和对矿物养分的酸溶及螯合溶解作用而言,三羧基的柠檬酸比二羧基的酒石酸、草酸、苹果酸及一羧基的乙酸的作用强度大和持续时间长[2,18]。孔涛等[11]的研究表明,不同微生物种类对不同小分子有机酸的利用具有明显差异,对黏壤土分别导入不同浓度的柠檬酸、草酸、甲酸和苯甲酸后,中等浓度的处理中,柠檬酸对细菌增加的作用比草酸、甲酸和苯甲酸都大;在低浓度的处理中,草酸促进放线菌数量增加的作用较其他3种酸强;高浓度的处理中,苯甲酸对真菌数量的增加具有促进作用,其他3种酸则具有抑制作用。在本研究中,外源柠檬酸导入石灰性黄壤后仅仅增加了细菌总量和功能性细菌的数量,土壤中的真菌和放线菌的数量也是降低的,说明细菌利用外源柠檬酸的能力比真菌和放线菌的强。BOWERS等[46]的研究表明,真菌的细胞壁厚,难以利用外源柠檬酸。外源柠檬酸使土壤中的放线菌的数量减少,是由于放线菌对土壤的pH变化反应敏感引起的,外源柠檬酸导入土壤后pH降低幅度大,不利于放线菌繁殖[11]。
不同种类的外源有机酸对土壤养分活化及释放作用的强度和持续时间也有差异,KPOMBLEKOU等[18]的研究表明,外源柠檬酸导入多种含磷矿石土壤中后,对活化磷的作用强于草酸,在25℃的条件下导入外源柠檬酸30 d后活化磷的作用达到最好。这也是本试验外源柠檬酸处理43 d取样测定土壤有效养分的参考依据,考虑到试验在春季进行的过程中土壤温度较低,本试验的取样时间有所推后。
3.4 外源柠檬酸促进石灰性黄壤养分活化和刺梨生长的技术应用
本研究结果表明,外源柠檬酸的不同施入量对提高石灰性黄壤有效养分的作用在不同元素间有明显差异,对促进刺梨实生苗生长、改善根系形态和增强根系的多种酶活性也有差异性影响。总体上看,80 mg·kg-1外源柠檬酸的处理对土壤养分活化和促进刺梨生长的效果较好,因此在生产中进行应用时要确定适宜的施用浓度。由于外源柠檬酸的不同施入量对提高石灰性黄壤有效养分的作用在不同元素间有明显差异,因此,在利用外源柠檬酸促进石灰性黄壤的养分活化与释放的过程中,也可以根据不同的目标元素正确选择柠檬酸的施用量。本研究结果为贵州喀斯特石灰性黄壤地区刺梨栽培中土壤和树体养分调控提供了新的技术借鉴。笔者在贵州西南部喀斯特石灰性黄壤地区,对刺梨栽培土壤每年施入2次外源柠檬酸后,刺梨的生长明显增强,果实产量和品质明显改善（试验结果另文发表）。4 结论
在pH大于8的石灰性黄壤上,施入外源柠檬酸对活化土壤养分和增加土壤中氮、磷、钾、钙、铁、锌、硼的有效含量具有促进作用。外源柠檬酸能够降低石灰性黄壤的pH,增强多种土壤酶活性,增加土壤中酒石酸、柠檬酸、苹果酸和乙酸的含量和细菌总数、解磷菌及解钾菌的数量;同时能够改变刺梨实生苗的根系形态,增大根系的吸收面积,增强根系活力和硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、铁还原酶、碱性磷酸酶及分泌性碱性磷酸酶的活性。外施柠檬酸能够增强刺梨实生苗根系对石灰性黄壤中养分的吸收能力,加强刺梨实生苗对氮、磷、钾、钙、镁、铁、锰、锌、硼养分元素的吸收,进而促进刺梨实生苗的生长,土壤养分供给状况的改善和根系吸收养分能力的增强对促进刺梨实生苗生长具有协同作用。The authors have declared that no competing interests exist.
