0 引言
【研究意义】双委夜蛾（Athetis dissimilis）属鳞翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae）,主要分布在日本、韩国、印度、菲律宾和印度尼西亚等地区,可危害玉米、小麦、大豆、花生和甘薯等作物幼嫩的芽和茎基部,严重时可引起断垄[1-4]。近年来,该虫在山东、河南、山西等地的危害陆续被发现并呈上升态势[5-6]。目前国内尚未有登记用于防治双委夜蛾的药剂,寻找兼具触杀、胃毒和内吸的高效杀虫剂对双委夜蛾的防治具有重要意义。杀虫剂在田间使用后,剂量会随时间推移而逐渐降低,较低致死剂量的药剂对靶标害虫的行为、生理及种群发展也会产生影响[7-8]。因此,研究低致死剂量杀虫剂对靶标害虫的影响对于科学使用农药、延缓抗药性发展及降低害虫再猖獗的风险有重要价值。【前人研究进展】双委夜蛾通常与二点委夜蛾（Athetis lepigone）混合发生,两种害虫在生活习性、形态和危害特征上基本相似,在田间很难区分。但与二点委夜蛾相比,双委夜蛾食量更大、危害期更长、繁殖力更强,存在田间大暴发的风险[5]。加之近年来由于秸秆还田,为其提供了隐蔽的场所,一般喷雾施药防治效果不理想。农药种子包衣技术因目标性强、操作方便、促进农作物壮苗等优势近年来得以广泛应用,尤其在地下害虫的防治上展现出广阔的应用前景。溴氰虫酰胺与氯虫苯甲酰胺一样均为邻甲酰氨基苯甲酰胺类杀虫剂,作用机制是激活昆虫肌肉细胞的鱼尼丁受体,引起存储于肌肉中的钙离子释放,使肌肉收缩瘫痪,最终导致昆虫死亡[9-11]。这类杀虫剂内吸作用强且易被植物根吸收,可通过喷雾或种子包衣技术防治包括地下害虫在内多种害虫[12-13],且对农田有益节肢动物的安全性高[9,14-15]。目前,溴氰虫酰胺已用于玉米种子处理防治蓟马和蛴螬[16],但对双委夜蛾是否有效未见报道。【本研究切入点】相对于氯虫苯甲酰胺,溴氰虫酰胺对鳞翅目害虫具有更高的触杀、胃毒和内吸活性,种子包衣处理防治小地老虎（Agrotis ypsilon）、二点委夜蛾等地下害虫已展现出较好的应用前景[12,17],在广泛使用前明确溴氰虫酰胺对双委夜蛾等害虫是否存在引起再猖獗的风险十分必要。【拟解决的关键问题】在实验室条件下测定溴氰虫酰胺在不同致死剂量下对双委夜蛾生长发育和繁殖、营养利用以及生化物质含量的影响,为在玉米田科学使用邻甲酰氨基苯甲酰胺类杀虫剂防治该类害虫提供依据。1 材料与方法
试验于2015—2016年在山东农业大学完成。1.1 试虫和药剂
供试双委夜蛾幼虫于2015年采集于河南洛阳玉米田,以人工饲料（含玉米粉、小麦胚芽、啤酒酵母、复合维生素、尼泊金甲酯、蔗糖等）于实验室继代饲养,成虫饲喂20%蜂蜜营养液。饲养环境为（26±1）℃,（75±5）% RH,光周期为16 L﹕8 D。94%溴氰虫酰胺原药（上海杜邦农化有限公司）,先用丙酮配制成母液,再用0.05% Triton X-100水溶液稀释成系列浓度,现配现用。
1.2 生物测定
采用杀虫剂混毒人工饲料法[18]。当新制备的人工饲料温度约40—50℃时,加入已配制好的6个浓度梯度的药剂溶液,充分搅匀,制备成0.125、0.25、0.5、1、2、4 µg·g-1溴氰虫酰胺的混毒人工饲料。对照组用不含溴氰虫酰胺的0.05% Triton X-100水溶液处理。待不同处理的人工饲料冷凝后放入已灭菌的指形管中,约1 cm3每管。挑选新蜕皮的长势一致的健康4龄幼虫（12 h内）于含人工饲料的指形管中,每管1头幼虫。每浓度设置5个重复,每个重复20头幼虫。于温度（26±1）℃,（75±5）% RH,光周期为16 L﹕8 D条件下饲养72 h后检查死亡数并计算死亡率。以幼虫不能正常爬行,或用毛笔轻触无反应,或与对照组相比虫体严重皱缩为死亡。计算LC5、LC25、LC50和LC95。1.3 溴氰虫酰胺对双委夜蛾生长发育和繁殖的影响
挑选同日蜕皮的600头4龄幼虫进行溴氰虫酰胺对双委夜蛾生长发育和繁殖影响的测定,其中,对照组（control）、LC5、LC25和LC50处理组分别为150头幼虫。将挑取的新蜕皮4龄幼虫（12 h内）挑入灭菌的指形管内,每管1头,饲喂含LC5、LC25和LC50剂量溴氰虫酰胺的人工饲料或者无毒饲料（对照组）（约1 cm3,制备方法同1.2）,试验条件为温度（26±1）℃,（75±5）% RH,光周期为16 L﹕8 D。于处理72 h后,将所有处理组中存活的个体转移到装有无毒人工饲料的灭菌新指形管内,继续饲养至化蛹,每日8：00观察并记录每头幼虫4龄至化蛹的发育历期。饲养期间,人工饲料保持新鲜以确保幼虫的正常生长。将所有2日龄蛹编号并称重,然后转移到一次性塑料杯中（50 mL）至羽化为成虫,若20 d蛹未羽化则判定为死亡,记录蛹的发育历期。待蛹羽化后,分别随机挑选29头雌虫和雄虫对应的2日龄蛹重进行统计分析。成虫以单雌和单雄配对于一次性产卵容器中（300 mL）,饲喂20%蜂蜜营养液。开始产卵后,每日收集产在尼龙纱布上的卵并更换新纱布,计数每对成虫的日产卵量,记录成虫的存活寿命和单雌产卵量。1.4 溴氰虫酰胺对双委夜蛾4龄幼虫营养利用的影响
参考XU等[19]的方法测定。将含LC5、LC25和LC50剂量溴氰虫酰胺的人工饲料或无毒饲料（1.3同期制备）切成约1 cm3的体积,称重,装入灭菌的指形管内。挑选新蜕皮（12 h内）的长势一致的健康4龄幼虫,逐头称重后放入装有人工饲料的指形管中,每处理设5个重复,每重复10头（n=50）。于温度（26±1）℃,（75±5）% RH,光周期为16 L﹕8 D条件下处理72 h,将幼虫、剩余的人工饲料、产生的粪便分离,于45℃恒温干燥箱处理72 h后分别称重。另外,再挑选30头新蜕皮（12 h内）长势一致的健康4龄幼虫称重,于45℃恒温干燥箱处理72 h后称虫干重,计算幼虫的鲜重﹕干重比值,折算药剂处理前所有处理组幼虫个体的干重。同样方法计算各处理人工饲料的鲜重﹕干重比值折算试验初始饲料干重值。计算各处理幼虫取食人工饲料、体重增长及产生粪便的干重,所有质量均精确至0.01 mg（Sartorius BT 125D）。采用WALDBAUER[20]的公式计算营养利用指数：近似消化率（approximate digestibility,AD）=100（E-F）/E,相对取食量（relative consumption rate,RCR）=E/TA,相对生长量（relative growth rate,RGR）=P/TA,摄入食物转化效率（efficiency of conversion of ingested food,ECI）=100 P/E,消化食物转化效率（efficiency of conversion of digested food,ECD）=100 P/（E-F）,其中,T为实验周期持续的天数,A为幼虫初始平均干重,E为取食食物的干重,F为产生粪便的干重,P为虫体增加的干重。
1.5 生化指标测定样品准备
挑选新蜕皮（12 h内）长势一致的健康4龄幼虫饲喂含溴氰虫酰胺的人工饲料或无毒饲料（对照组）,每处理200头幼虫。于温度（26±1）℃,（75±5）% RH,光周期16 L﹕8 D条件下处理24、48和72 h后,在每个处理中分别挑选30头存活的试虫用灭菌去离子水清洗,并用液氮冷冻后保存于-80℃冰箱,备用。每个生化指标设置4个重复,每重复1头幼虫。1.6 碳水化合物、脂质和蛋白质含量的测定
碳水化合物含量测定参考ZHAO等[21]的方法。取1头试虫,加入500 µL 10%三氯乙酸（TCA）,冰浴下充分匀浆,12 000 r/min离心10 min（4℃）。每个样品取20 µL上清液转移到新的1.5 mL离心管中,加入80 µL 10% TCA。再向每个样品加入600 µL 0.2%蒽酮（200 mg蒽酮溶解于100 mL H2SO4）,90℃恒温水浴加热10 min。所有样品于波长630 nm处测定吸光度。用葡萄糖制作标准曲线,计算每个样品中碳水化合物的含量。脂质含量测定参考XU等[19]的方法。取1头幼虫加入200 µL 2% Na2SO4溶液,冰浴下充分匀浆,加入750 µL氯仿﹕甲醇（2﹕1）混合溶液进行提取,离心10 min（12 000 r/min,4℃）。再从每个样品中各取500 µL上清液转移到新的1.5 mL离心管,于40℃干燥。最后,每个样品用500 µL H2SO4溶解,于90℃恒温水浴锅中水浴10 min。分别取30 µL样品和270 µL香兰素（Aladdin Industrial Inc., 上海）加入酶标板中反应30 min。用胆固醇（Solarbio,北京）制作标准曲线。所有样品于波长530 nm处测定吸光度。
蛋白质测定参照BRADFORD[22]的方法。取1头幼虫加入400 µL Tris-HCl（pH 7.1）（50 mmol·L-1,0.5% Triton X-100和20%蔗糖）,冰浴下充分匀浆,12 000 r/min离心10 min（4℃）。再取30 µL上清液于酶标板中,加入150 µL 0.01%考马斯亮蓝G-250（Solarbio,北京）,反应5 min,于波长595 nm处测定吸光度。使用牛血清蛋白（Solarbio,北京）制作标准曲线。本研究所有吸光度均使用BioTek SynergyTM2 Multi-Mode Reader（BioTek Instruments,Inc. Winooski,Vermont,USA）测定。
1.7 数据统计与分析
采用Abbott’s公式,利用对照组的死亡率将药剂处理组死亡率进行校正,并用SPSS 软件进行probit分析（version 17.0,SPSS Inc.,USA）。营养利用及生化物质含量数据用单因素方差分析（ANOVA）,Tukey test（P<0.05）。应用SigmaPlot 12.5作图。2 结果
2.1 溴氰虫酰胺对双委夜蛾4龄幼虫的毒力
药剂处理72 h后,溴氰虫酰胺对双委夜蛾4龄幼虫的LC5、LC25、LC50和LC95分别为0.13、0.34、0.66和3.36 µg·g-1人工饲料（表1）。Table 1
表1
表1溴氰虫酰胺对双委夜蛾4龄幼虫的毒力
Table 1Toxicity of cyantraniliprole to the 4th instar larvae of A. dissimilis
| 药剂 Insecticide | 总试虫数 Number of tested insect | 浓度 Concentration (µg·g-1) (95% CL) | 斜率±标准误 Slope±SE | 卡方值 χ2 (df) | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| LC5 | LC25 | LC50 | LC95 | ||||
| 溴氰虫酰胺Cyantraniliprole | 700 | 0.13 (0.06-0.20) | 0.34 (0.22-0.46) | 0.66 (0.49-0.88) | 3.36 (2.19-6.91) | 2.33±0.35 | 0.31 (4) |
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2.2 溴氰虫酰胺对双委夜蛾生长发育和繁殖的影响
溴氰虫酰胺处理对双委夜蛾的生长发育产生了明显的影响。与对照组相比,处理组幼虫的发育历期显著延长,LC5、LC25和LC50剂量下幼虫的发育历期分别延长了1.63、1.75和5.48 d。溴氰虫酰胺处理后影响了雌、雄蛹的发育历期,与对照组（13.63 d）相比,仅LC50处理（15.03 d）雌蛹的历期显著延长,而LC25和LC50处理组雄蛹的历期分别为14.89和15.65 d,显著长于对照组的14.09 d。另外,溴氰虫酰胺处理组缩短了雌、雄成虫的寿命,但与对照组差异不显著（表2）。Table 2
表2
表2溴氰虫酰胺对双委夜蛾幼虫和蛹发育历期及成虫寿命的影响
Table 2Effects of cyantraniliprole at different dosages on the duration of larval and pupal period, and on adult longevity of A. dissimilis
| 处理 Treatment | 4—6龄幼虫发育历期 Duration of 4-6 larval stage (d) | 蛹发育历期 Duration of pupal stage (d) | 成虫寿命 Adult longevity (d) | ||
|---|---|---|---|---|---|
| 雌虫Female | 雄虫Male | 雌虫Female | 雄虫Male | ||
| 对照Control | 21.52±0.23c | 13.63±0.15b | 14.09±0.11c | 13.49±0.56a | 14.60±0.46a |
| LC5 | 23.15±0.29b | 13.91±0.25b | 14.55±0.14bc | 12.71±0.52a | 13.58±0.66a |
| LC25 | 23.27±0.22b | 14.07±0.20b | 14.89±0.21b | 12.53±0.78a | 13.22±0.83a |
| LC50 | 27.00±0.25a | 15.03±0.17a | 15.65±0.15a | 12.62±0.80a | 12.86±0.91a |
| P | <0.001 | <0.001 | <0.001 | 0.653 | 0.281 |
| F | 70.26 | 6.76 | 16.37 | 0.54 | 1.29 |
| df | 3, 460 | 3, 184 | 3, 205 | 3, 184 | 3, 205 |
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由图1可见,溴氰虫酰胺处理显著降低了双委夜蛾幼虫的化蛹率（P<0.001）和蛹的羽化率（P<0.001）,对雌雄蛹量、单雌产卵量、产卵历期和成虫产卵前期（adult preoviposition period,APOP）也存在影响（表3）。LC5、LC25和LC50处理组雌蛹重分别为130.2、127.8和127.5 mg,显著低于对照组的蛹重（146.7 mg）,但是对雄蛹重无显著影响。溴氰虫酰胺处理后,LC5、LC25和LC50组的单雌产卵量分别为558.8、506.9和462.8粒,显著低于对照组（755.1粒）。此外,溴氰虫酰胺处理组缩短了成虫的产卵历期,但是对成虫产卵前期的影响不明显。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1溴氰虫酰胺对双委夜蛾幼虫化蛹率和蛹羽化率的影响
-->Fig. 1Effects of cyantraniliprole at different dosages on the pupated and emerged percentage rate of A. dissimilis
-->
Table 3
表3
表3溴氰虫酰胺对双委夜蛾蛹重、产卵量、产卵历期和成虫产卵前期的影响
Table 3Effects of cyantraniliprole at different dosages on the pupal weight, fecundity, oviposition period and adult preoviposition period of A. dissimilis
| 处理 Treatment | 蛹重 Pupal weight (mg) | 产卵量 Fecundity (eggs/female) | 产卵历期 Oviposition period (d) | 成虫产卵前期 Adult preoviposition period (d) | |
|---|---|---|---|---|---|
| 雌虫Female | 雄虫Male | ||||
| 对照Control | 146.7±2.01a | 137.7±3.19a | 755.1±20.3a | 9.02±0.24a | 3.18±0.11a |
| LC5 | 130.2±3.16b | 129.0±2.95a | 558.8±31.9b | 7.82±0.37ab | 3.43±0.17a |
| LC25 | 127.8±2.88b | 132.0±2.73a | 506.9± 42.4b | 7.56±0.51b | 3.50±0.17a |
| LC50 | 127.5±2.97b | 129.5±2.02a | 462.8± 43.0b | 7.41±0.65b | 3.44±0.22a |
| P | <0.001 | 0.1021 | <0.001 | 0.0115 | 0.4018 |
| F | 10.77 | 2.117 | 17.64 | 3.788 | 0.984 |
| df | 3, 112 | 3, 112 | 3, 171 | 3, 171 | 3, 171 |
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2.3 溴氰虫酰胺对双委夜蛾4龄幼虫营养利用的影响
溴氰虫酰胺处理双委夜蛾4龄幼虫后对其营养利用指数影响较大（表4）。与对照组相比,溴氰虫酰胺处理组幼虫的相对生长量（RGR）、相对取食量（RCR）、摄入食物转化效率（ECI）和消化食物转化效率（ECD）均显著降低,LC25和LC50两个处理组差异不显著。但是,溴氰虫酰胺处理组增加了双委夜蛾幼虫的近似消化率（AD）,对照组和LC5处理之间无显著差异。Table 4
表4
表4溴氰虫酰胺处理双委夜蛾4龄幼虫72 h对营养利用的影响
Table 4Nutritional indices of A. dissimilis at 72 h after treatment with different dosages of cyantraniliprole to the 4th instar larvae
| 处理 Treatment | 近似消化率 AD (%) | 相对取食量 RCR (mg/mg/d) | 相对生长量 RGR (mg/mg/d) | 摄入食物转化效率 ECI (%) | 消化食物转化效率 ECD (%) |
|---|---|---|---|---|---|
| 对照Control | 55.30±0.81c | 1.81±0.04a | 0.34±0.01a | 18.97±0.20a | 34.35±0.67a |
| LC5 | 57.38±0.72c | 0.81±0.02b | 0.11±0.01b | 13.47±0.72b | 23.54±1.50b |
| LC25 | 76.79±0.86b | 0.38±0.02c | 0.03±0.00c | 7.85±0.51c | 10.25±0.72c |
| LC50 | 83.07±1.79a | 0.31±0.02c | 0.02±0.00c | 5.93±0.47c | 7.14±0.53c |
| P | <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 |
| F | 151.5 | 784.1 | 1090.2 | 133.7 | 181.8 |
| df | 3, 16 | 3, 16 | 3, 16 | 3, 16 | 3, 16 |
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2.4 溴氰虫酰胺对双委夜蛾4龄幼虫生化物质含量的影响
由图2可以看出,双委夜蛾幼虫暴露于不同剂量的溴氰虫酰胺后,其体内的碳水化合物、脂质及蛋白质的含量发生了显著变化。LC5、LC25和LC50剂量的溴氰虫酰胺处理双委夜蛾4龄幼虫24 h后显著降低了其体内碳水化合物的含量,而且这种不利影响持续到48 h和72 h（P<0.001）（图2-A）。同时,溴氰虫酰胺处理也显著降低了4龄幼虫体内脂质（24 h：P<0.001;48 h：P<0.001;72 h：P<0.001）（图2-B）和蛋白质的含量（24 h：P=0.0012;48 h：P=0.0113;72 h：P<0.001）（图2-C）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2溴氰虫酰胺对双委夜蛾4龄幼虫碳水化合物（A）、脂质（B）及蛋白质（C）含量的影响
-->Fig. 2Effects of cyantraniliprole at different dosages on content of carbohydrate (A), lipid (B), and protein (C) of A. dissimilis after treated on the 4th instar larvae
-->
3 讨论
明确杀虫剂对靶标害虫的低致死效应对于指导新农药科学使用、延缓昆虫抗药性发展、避免害虫再猖獗等均有重要价值。在田间状态下,虽然杀虫剂最初的高剂量可以直接杀死害虫,但这种剂量往往只能维持较短的时间,随着药剂降解和代谢,剂量多降为相对较低甚至亚致死的剂量,存活下来的害虫会相对长期接触这种剂量的杀虫剂,也能引起一系列生理或行为上的变化[8,23]。溴氰虫酰胺对多种鳞翅目害虫幼虫具有较高活性[17-19,24-25]。本研究表明,溴氰虫酰胺对双委夜蛾4龄幼虫同样毒力较高,而接触相对较低剂量的溴氰虫酰胺能够使双委夜蛾幼虫的取食能力下降,减缓幼虫的正常生长,降低幼虫的质量和延长发育历期。并且在幼虫变态为蛹的过程中,由于溴氰虫酰胺处理组幼虫能量物质积累不足导致化蛹率降低,并出现了部分低质量的蛹,蛹的发育历期也有所延长。近似的结果在其他鳞翅目害虫如烟青虫（Helicoverpa assulta）[18]、斜纹夜蛾（Spodoptera litura）[24]上也有报道。相对较低致死剂量的溴氰虫酰胺延长了双委夜蛾幼虫的发育历期,这与其他研究报道一致[18-19,24-25]。原因可能是多方面的,一种解释是溴氰虫酰胺降低了昆虫的取食能力后,其体内的碳水化合物、脂质和蛋白质等化学物质的含量也相应降低,直接影响到昆虫正常的生理和生化反应过程[26],导致幼虫发育时间延长[27-28]。另外,幼虫体内的能量物质更多用于代谢解毒,无法维持虫体的正常生长发育过程,因此溴氰虫酰胺处理后的幼虫需要更长的时间去积累足够的能量物质满足正常的生长发育所需。再有一种可能是药剂影响到昆虫对营养的利用效率。
昆虫的营养利用是指昆虫将所取食的食物转化为生物量的能力,是摄食生态学的重要组成部分[26,29],植物提取物或杀虫剂往往会对昆虫的营养利用效率产生不利的影响[19,26]。本研究中,溴氰虫酰胺处理双委夜蛾幼虫后提高了近似消化率,这是因为幼虫需要克服和弥补由拒食影响导致的缺陷和不足,降低了食物在消化道中的蠕动速度,进而导致了相对生长量的降低[26]。相对生长量是和昆虫的体重密切相关的物理量,相对生长量降低表明含溴氰虫酰胺的人工饲料不适合双委夜蛾幼虫的取食,表现为拒食效应[19,29]。本研究中溴氰虫酰胺处理组的幼虫可以暂时维持相对消化率,却无法维持相对生长量,也为幼虫通过取食和消化食物得到的大部分能量物质参与了解毒过程而不是维持幼虫的正常生长发育过程提供了间接证据。不过溴氰虫酰胺处理后对雌蛹和雄蛹质量的影响存在着明显的不同,反映出不同性别幼虫对营养需求存在差异,那么溴氰虫酰胺处理对双委夜蛾种群的性别组成存在何种影响还需要进一步明确。
此外,杀虫剂会对昆虫成虫的交配行为等产生一定的影响[19,30-31]。低剂量的溴氰虫酰胺对双委夜蛾的成虫寿命及成虫产卵前期未产生显著影响。但缩短了成虫的产卵历期,这些改变导致了雌成虫的产卵量显著降低,从而不利于种群的发展。
总之,溴氰虫酰胺对双委夜蛾幼虫具有较高的致死活性,同时在低剂量下对双委夜蛾种群的发展也存在不利影响。但是,由于本试验双委夜蛾是实验室继代饲养,其敏感性可能与田间种群存在一定误差,因此影响其防控效果。然而,当双委夜蛾暴露于低于无可观察效应浓度（no observed effect concentration, NOEC）的溴氰虫酰胺时是否有刺激现象还需进一步研究。
4 结论
溴氰虫酰胺对双委夜蛾个体存在较强的急性致死效应,而幸存个体在较低致死剂量下,溴氰虫酰胺还可进一步抑制其种群增长,再猖獗的风险较低。低致死剂量种群抑制效应提示,将邻甲酰氨基苯甲酰胺类杀虫剂纳入对双委夜蛾类农业害虫的综合治理是合理的。The authors have declared that no competing interests exist.
