0 引言
【研究意义】优质畜禽产品的产出依赖于营养充足而均衡的饲粮供给。而准确掌握饲粮中营养成分的含量是保障饲粮营养价值的首要前提。维生素是畜禽代谢所必需的一类有机化合物[1],体内一般不能合成,需通过饲粮提供。通常为满足动物特定生理阶段的需求,一般饲粮中其添加量高于0.1%[2]。因畜禽对维生素的需要量总体较少,为保证饲粮中其添加含量及添加均匀度,多利用载体稀释剂直接稀释或者搭配其他营养性添加剂进行稀释并均匀混合,制成具有一定含量的维生素预混合饲料或复合预混合饲料,然后再利用相应预混合饲料进行饲粮配制。然而载体稀释剂的使用,不仅影响预混合饲料的混合质量及添加剂的稳定性和活性,也因其成分的复杂性影响维生素含量的检测[3]。【前人研究进展】目前,以高效液相色谱法为主[4-8]的预混合饲料中维生素含量检测方法通过将维生素与载体稀释剂分离提纯后再行测定,其选择性良好、灵敏度和准确度高。但是这类常规的实验室湿化学分析方法过程繁琐复杂、消耗试剂多、对样品破坏性强,对测定人员也有着严格的操作技术要求,更重要的是耗时长,现行脂溶性维生素有效检测方法通常需要1d左右。饲料类产品属于大宗流通性产品,其成分含量现场快速检测既是生产厂家的现实需要也是饲料用户的现实需求[9]。近红外光谱技术（near infrared spectroscopy,NIRS）作为一种新兴的快检技术,其在样品制备、操作过程及检测速度方面具有显著优势[10],目前在饲料质量与营养价值评定方法上已广泛应用[11]。【本研究切入点】已有研究成功实现了预混合饲料中维生素A、维生素D3、维生素K3和维生素E的近红外光谱检测[12-16],但是相关研究少有涉及光谱采集参数、不同载体稀释剂中目标维生素的特征峰及其方法适用性情况的报道。【拟解决的关键问题】本研究搜集了添加剂预混合饲料生产中常用的3种载体稀释剂,以其配制成不同浓度的维生素E预混合饲料,拟研究不同扫描次数和分辨率等光谱采集参数对其近红外光谱质量的影响,比较不同载体稀释剂预混合饲料中维生素E特征峰情况,考察不同预处理方式下其偏最小二乘回归模型的定量精度,考察近红外光谱分析方法对不同载体预混合饲料的适用性,以期为近红外光谱技术快速检测预混合饲料中维生素含量方法的建立提供参考。1 材料与方法
1.1 样品的制备
从饲料添加剂预混合饲料企业采集维生素E粉剂（50%）样品,其主要成分为α-生育酚,是一种苯并二氢吡喃的衍生物,由一个β-色满环和一个脂肪侧链组成。其结构如图1所示：
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1α-生育酚化学结构
-->Fig. 1The chemical structure of α-tocopherols
-->
采集目前国内预混合饲料生产中常用的载体稀释剂,包括2种无机载体（二氧化硅和石粉）和1种有机载体（脱脂米糠）,在实验室以2.5 IU∙g-1的浓度梯度,分别配制了含量范围在5—250 IU∙g-1的样品各99个,充分混匀后避光保存。样品基本上涵盖市售预混合饲料中维生素的成分含量范围。
1.2 近红外光谱的采集
预混合饲料样品的光谱采集使用美国铂金埃尔默（Perkin Elmer）公司Spectrum 100傅里叶红外光谱仪。试验采用其中的近红外光谱系统,积分球附件,镀膜处理的FR-DTGS检测器。扫描样品使用仪器配备的45 mm半径的玻璃样品杯,扫描环境温度为21—24 ℃,湿度40%—60%。1.2.1 扫描次数的优化 由于物质在近红外光谱区吸收信号弱,增加扫描次数是提高光谱信噪比的一种传统方法。随着扫描次数的增加,累加平均的效果是使噪声的随机信号逐渐抵消,仪器信号与噪声信号的比值放大,信噪比得以提高。然而过多的扫描次数也将带来光谱获取时间长,分析效率降低的问题。选择适宜的光谱扫描次数既可以保证分析的速度,也有利于得到准确的分析结果[17]。随机抽取10个以二氧化硅为载体的预混合饲料样品,设置光谱分辨率为8 cm-1,获取了1、16、32和64次扫描次数下的近红外光谱,每个样品重复扫描10次。利用光谱重现性指标来评价光谱扫描次数对光谱质量的影响。光谱重现性评价指标用光谱标准偏差（standard deviation,SD）表示,计算公式如下：
\[SD_i=\sqrt{\frac{\sum
{10}_{i=1}(A
l_i-A
l_{av})}{10-1}}\ \ (1)\]
其中：Ail是第i条光谱的第l波长吸光度,Alav是第l
波长平均吸光度。根据不同光谱扫描次数条件下10个样品平均SD来评价光谱重现性。SD值越小表明光谱重现性越好,光谱质量越稳定[18-19]。
1.2.2 光谱分辨率的优化 光谱分辨率真实反映有效光谱数据点的信息,光谱分辨率不仅影响着光谱的解析度,而且在扫描次数相同的情况下还影响着光谱的信噪比,最终影响着近红外的分析结果的准确性[20-21]。为研究不同光谱分辨率对近红外光谱数据的影响,分别设置不同光谱分辨率（8 cm-1和16 cm-1）,选取与1.2.1同样的10个样品,扫描次数设定为1.2.1中优化的结果,光谱分辨率选择为8 cm-1和16 cm-1,采集其近红外光谱,每个样品重复扫描10次。通过比较光谱SD的大小,评价光谱分辨率对预混合饲料光谱质量的影响。
1.2.3 不同载体预混合饲料近红外光谱的采集 基于优化后的光谱采集参数,分别采集配制的3种不同载体预混合饲料的近红外光谱。每个样品重复装样并扫描3次,取3次扫描的平均光谱用于定量分析。扫描后光谱如图2所示。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2不同载体维生素E预混合饲料对应的近红外光谱图
a：以二氧化硅为载体;b：以脱脂米糠为载体;c：以石粉为载体
-->Fig. 2Near infrared spectra of VE premix samples with different carriers
a: SiO2 as a carrier; b: Defatted rice bran as a carrier; c: Stone powder meal as a carrier
-->
1.3 数据处理
论文中所有光谱数据处理和模型建立均在Matlab 2013b（Mathworks,美国）和PLS-Toolbox（Version 8.0,Eigenvector Research,美国）中进行。采用标准正态变量校正（standard normal variate, SNV）和多元散射校正（multiplicative scatter correction,MSC）进行光谱预处理,依据杠杆值和学生残差进行异常样品判定[22],用偏最小二乘回归方法建立定量分析模型。根据校正决定系数（Rc2）、校正均方根误差（RMSEC）、验证决定系数（Rp2）、预测均方根误差（RMSEP）和相对分析误差（RPD）（标准偏差SD/预测均方根误差RMSEP）值等筛选最合适的模型。一般情况下,RMSEP与RMSEC越小,模型精确度越高;RMSEP与RMSEC越接近,模型结果越准确;RPD越大模型效果越好,当RPD>3时,则认为模型可应用于实际检测[23]。2 结果
2.1 近红外光谱采集参数优化
2.1.1 不同扫描次数的优化 分别计算10个样品不同扫描次数下的光谱SDt值,然后取10个样品光谱SDt值的平均值\(\overline{SD_t}\)作为评价指标,结果如表1所示。Table 1
表1
表1不同光谱扫描次数下样品近红外光谱标准偏差
Table 1The spectral standard deviation within spectra acquired by different scanning times
| 扫描次数 Number of scans | 最大值 Max（×10-3） | 最小值 Min（×10-3） | 平均值 Mean（×10-3） |
|---|---|---|---|
| 1 | 3.249 | 0.122 | 0.739±0.607 |
| 16 | 1.024 | 0.034 | 0.227±0.178 |
| 32 | 0.404 | 0.067 | 0.170±0.057 |
| 64 | 1.414 | 0.044 | 0.403±0.258 |
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从表1中可见,\(\overline{SD_t}\)呈现先减小后增大的趋势,光谱扫描次数为1次时\(\overline{SD_t}\)值最高,为32次时达到最小,为64次时又逐步增大。该结果表明光谱扫描次数为32次时,光谱信噪比较优,光谱重现性理想,数据较为稳定。
2.1.2 不同光谱分辨率对光谱采集的影响 采用与2.1.1同样的计算方法,用\(\overline{SD_r}\)作为评价指标,结果如表2所示。
从表2可见,16 cm-1分辨率条件下的光谱\(\overline{SD_r}\)值明显小于8 cm-1分辨率条件下的光谱\(\overline{SD_r}\)值,说明预混合饲料样品在16 cm-1分辨率条件下的光谱重现性更优。因此,选择16 cm-1分辨率作为光谱采集参数之一。
Table 2
表2
表2不同光谱分辨率下样品近红外光谱标准偏差
Table 2The spectral standard deviation within spectra acquired by different resolution
| 分辨率 Resolution | 最大值 Max（×10-4） | 最小值 Min（×10-4） | 平均值 Mean（×10-4） |
|---|---|---|---|
| 8 cm-1 | 5.21 | 0.514 | 1.850±0.784 |
| 16 cm-1 | 1.98 | 0.260 | 0.925±0.327 |
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2.2 预混合饲料的近红外光谱
为了分析不同载体预混合饲料中维生素E特征峰变化情况,取3种不同载体预混合饲料和维生素E的平均近红外光谱并对其进行导数处理,其结果如图3所示。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3不同维生素E预混合饲料和维生素E平均导数光谱图
-->Fig. 3The derivative of average spectra of three different premixed feeds and vitamin E
-->
由图3可见,结合α-生育酚、二氧化硅、石粉的结构以及脱脂米糠的成分,可知维生素E粉剂在近红外谱区的吸收主要是烷烃芳烃C-H的伸缩振动和O-H的振动;二氧化硅在近红外谱区的吸收主要是Si-O的振动;石粉在近红外谱区的吸收主要是CO32-伸缩振动;脱脂米糠成分则比较复杂,近红外谱区的吸收主要是水的O-H、蛋白的C=O和N-H、淀粉和纤维素O-H、C-O和C=O等的振动[11]。表3为不同物质近红外光谱区主要吸收谱带、振动类型及其谱带位置。结合图3和表3可知,维生素E的主要吸收峰为4 050—4 300、4 435、4 660、5 323、5 950、7 090 cm-1;二氧化硅维生素E预混合饲料的主要吸收峰位于4 050—4 300、4 520、4 900、5 323、5 950、7 050 cm-1,可见在二氧化硅载体Si-O振动吸收的影响下,维生素E的部分特征吸收峰与载体的特征峰叠加,使预混合饲料的维生素E的特征吸收发生偏移;脱脂米糠维生素E预混合饲料的主要吸收峰位于4 050—4 300、4 435、5 323、5 970、 7 250 cm-1,可见在脱脂米糠载体复杂成分多种波段吸收的影响下,维生素E的特征吸收与载体中不同成分的吸收峰叠加,使预混合饲料的特征吸收也发生了较小程度的偏移;石粉维生素E预混合饲料的主要吸收峰位于4 050、4 440、4 600、5 323、6 000、7 310 cm-1,可见在石粉载体CO3-2振动吸收的影响下。维生素E的特征吸收也发生了叠加从而出现偏移[24-26]。
Table 3
表3
表3不同物质的近红外光谱特征吸收波段
Table 3Characteristic absorption peaks of different materials
| 名称 Name | 波段 Band/cm-1 | 基团 Group | 振动类型 Vibration type |
|---|---|---|---|
| 维生素E Vitamin E | 7090 | C-H(CH3) | 一倍频one octave |
| 5950 | CH3 | 一倍频one octave | |
| 5323 | 芳烃O-H aromatic O-H | 组合频combination octave | |
| 4660 | 芳烃C-C aromaticC-C | 组合频combination octave | |
| 4435 | 芳烃C-H aromaticC-H | 组合频combination octave | |
| 4050-4300 | C-H(CH2) | 组合频combination octave | |
| 二氧化硅 SiO2 | 4900 | Si-O | 对称伸缩振动symmetric stretching vibration |
| 脱脂米糠 Defatted rice bran | 7050 | 游离O-H freeO-H | 一倍频one octave |
| 6020-5550 | 淀粉和纤维素CH3和CH2 starch and fibrin CH3 and CH2 | 一倍频one octave | |
| 4910-4720 | 淀粉O-H伸缩、纤维素O-H变形、蛋白质N-H弯曲 telescopic of starchO-H, deformation of fibrinO-H, bend of proteinN-H | 一、二倍频和组合频 one, two and combination octave | |
| 4550 | 烯烃C=C,芳烃C-H olefin C=C, aromatic C-H | 一、二倍频和组合频 one, two and combination octave | |
| 石粉 Stone powder | 4650 | CO32- | 对称伸缩振动symmetric stretching vibration |
| 二氧化硅+维生素E SiO2+Vitamin E | 7050 | C-H(CH3) | 二倍频+组合频two and combination octave |
| 5950 | CH3 | 一倍频one octave | |
| 4900 | Si-O | 对称伸缩振动symmetric stretching vibration | |
| 5323 | 芳烃O-H aromatic O-H | 组合频combination octave | |
| 4520 | 芳烃C-H aromaticC-H | 组合频combination octave | |
| 4050 | C-H(CH2) | 组合频combination octave | |
| 脱脂米糠+维生素E Defatted rice bran+Vitamin E | 7250 | C-H(CH3) | 二倍频+组合频two and combination octave |
| 5970 | CH3 | 一倍频one octave | |
| 5323 | 芳烃O-H aromatic O-H | 组合频combination octave | |
| 4435 | 芳烃C-H aromaticC-H | 组合频combination octave | |
| 4050~4300 | C-H(CH2) | 组合频combination octave | |
| 石粉+维生素E Stone powder+Vitamin E | 7310 | C-H(CH3) | 二倍频+组合频two and combination octave |
| 6000 | CH3 | 一倍频one octave | |
| 5323 | 芳烃O-H aromatic O-H | 组合频combination octave | |
| 4440 | 芳烃C-H aromaticC-H | 组合频combination octave | |
| 4660 | 芳烃C-C aromaticC-C | 组合频combination octave | |
| 4050 | C-H(CH2) | 组合频combination octave |
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2.3 近红外光谱定量分析模型的建立与验证
2.3.1 光谱预处理方法的选择 近红外光谱除了含有样品本身的化学信息外,还包含其他无关信息和噪声,化学计量学建模时,光谱预处理方法是十分关键和必要的。如导数减弱了基线的干扰,提高了光谱分辨率;多元散射校正（MSC）、标准正态变量变换（SNV）可以消除颗粒分布不均匀造成的散射影响[11]。分别采用不同的光谱预处理方法对三种不同载体预混合饲料的光谱进行处理,并建立偏最小二乘回归定标模型,结果如表4所示。由表4可知,以二氧化硅为载体的预混合饲料最佳预处理方法为SNV+1stDeriv.（2,15）,以脱脂米糠为载体的预混合饲料最佳预处理方法为MSC+1stDeriv（2,21）,以石粉为载体的预混合饲料最佳预处理方法为SNV+2stDeriv（2,15）。
2.3.2 近红外模型的建立 将3种不同载体混合成的样品随机分配校正集和验证集,采用最优预处理方法,在全谱范围（10 000—4 000 cm-1）内建立3种预混合饲料中维生素E的定量校正模型,其结果如表5所示。
从表5的定量校正模型结果可以看出,三种预混合饲料的R2都超过0.9,RPD均超过3,说明结果较好。以二氧化硅和脱脂米糠为载体的预混合饲料维生素E定量模型的R2分别为0.989、0.980,RPD分别为8.10、6.90,优于石冬冬[16]和李秋玫[15]的结果,检测精度高,效果良好;以石粉为载体的预混合饲料的R2为0.941,RPD为3.07,虽然定量精度比二氧化硅和脱脂米糠为载体的模型精度低,但同样达到了准确定量分析的目的。
Table 4
表4
表4基于不同光谱预处理方式的不同维生素预混合饲料近红外光谱定标模型
Table 4Performances of NIRS calibration models within vitamin E premix samples pretreated by different methods
| 载体 Carrier | 预处理(Deriv.（X, Y）) Pretreatment | 主成分数 The number of principal components | 校正集决定系数 Rc2 | 校正均方根误差 RMSEC | 交互验证均方根误差 RMSECV |
|---|---|---|---|---|---|
| 二氧化硅 SiO2 | 2stDeriv.（2,15） | 4 | 0.920 | 10.11 | 11.02 |
| SNV+1stDeriv.（2,15） | 3 | 0.988 | 7.64 | 7.78 | |
| SNV+2stDeriv.（2,15） | 3 | 0.941 | 8.56 | 8.96 | |
| 脱脂米糠 Rice bran | 2stDeriv.（2,15） | 4 | 0.885 | 18.34 | 19.45 |
| MSC+1stDeriv.（2,21） | 5 | 0.948 | 14.66 | 14.97 | |
| SNV+2stDeriv.（2,15） | 5 | 0.931 | 15.12 | 15.78 | |
| 石粉 Stone powder | 2stDeriv.（2,15） | 3 | 0.794 | 20.46 | 24.12 |
| SNV+2stDeriv.（2,21） | 4 | 0.913 | 18.17 | 19.03 | |
| SNV+2stDeriv.（2,15） | 4 | 0.941 | 16.16 | 16.56 |
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Table 5
表5
表5基于最优光谱预处理方式的不同维生素预混合饲料近红外光谱定标模型
Table 5Performances of NIRS calibration models within vitamin E premix samples pretreated by optimal methods
| 载体 Carrier | 校正集 Determination | 验证集 Prediction | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 数量 Num. | 校正决定 系数Rc2 | 校正均方根误差 RMSEC | 数量 Num. | 预测决定 系数Rp2 | 预测均方根 误差RMSEP | 相对分析 误差RPD | |
| 二氧化硅 SiO2 | 78 | 0.988 | 7.64 | 12 | 0.989 | 8.86 | 8.10 |
| 脱脂米糠 Rice bran | 74 | 0.949 | 14.66 | 11 | 0.980 | 10.36 | 6.90 |
| 石粉 Stone powder | 75 | 0.941 | 16.16 | 11 | 0.921 | 23.37 | 3.07 |
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为了更好的解释模型结果,在PLS模型中提取VIP（variable importance in projection）Score值,用来表示在PLS模型中该点对模型的贡献,当VIP Score值大于1时,认为该点对模型产生了显著的贡献[27-28]。3种不同载体预混合饲料的VIP Score曲线图（图4）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图43种不同载体预混合饲料的VIP Score曲线
-->Fig. 4The VIP score curves for model of premix with different carriers
-->
从图4可以看出,以二氧化硅为载体的维生素E预混合饲料模型的VIP Score曲线中,贡献显著的峰值分别为7 410、7 350、5 950、5 323、4 435、4 050—4 300 cm-1,其中5 950 cm-1处的吸收与维生素E的CH3特征峰吸收相关,5 323 cm-1与芳烃O-H的组合频吸收相关,4 435 cm-1处则与芳烃C-H的吸收相关,4 050—4 300 cm-1与CH2的C-H键的吸收相关;以脱脂米糠为载体的预混合饲料模型的VIP Score曲线中,贡献显著的峰值分别为7 520、7 266、7 210、5 950、5 323、5 228、4 435 cm-1,其中5950 cm-1与CH3的吸收相关,5 323 cm-1与芳烃O-H的组合频吸收相关,4 435 cm-1则与芳烃C-H的吸收相关;而以石粉为载体的维生素E预混合饲料模型的VIP Score曲线中,与维生素E特征吸收相关的VIP Score峰值只有5 323、4 435 cm-1。说明在上述3种载体稀释剂中,二氧化硅对维生素E特征峰的提取产生的影响最小,脱脂米糠虽然成分复杂,但是化学计量学手段消除了复杂成分带来的影响,而石粉作为载体稀释剂,对维生素E产生了较大的吸附作用,对维生素E的特征峰的提取产生了较大的影响,使VIP Score曲线提取的产生显著贡献（即VIP Score>1）值相关波段较少,对近红外模型产生了较大的影响。
3 讨论
二氧化硅和脱脂米糠作为载体,能够很好的将维生素E粉末稀释并且使之镶嵌和承载于其表面,能够使维生素E粉末本身的物理性质发生改变或不再表现出来,不仅起到稀释剂的作用,还可提高了维生素E粉末的流散性,使其更好更均匀的分布[29]。其中二氧化硅的Si-O基团在近红外谱区的吸收较弱,将其与维生素E混合后对维生素E在近红外谱区的特征吸收基本没有产生影响,使维生素E吸收信息的提取较完全,因而得到了好的模型效果;脱脂米糠包含丰富的化学吸收信息,虽然会对维生素E化学吸收信息的提取产生一定的影响,但是实践结果表明通过化学计量学可以减小这种影响,模型结果也非常理想。而石粉作为稀释剂,CO32-在近红外谱区也有吸收,这对维生素的特征信息提取产生了一定的影响;加上石粉载体特殊,石粉维生素E模型中对定量模型起重要贡献的光谱变量数较少[30],在维生素E的特征吸收峰位置相关光谱变量VIP Scores值相对较小,表明石粉中维生素E的特征光谱信息提取不充分,模型结果相对较差。4 结论
预混合饲料的载体种类不同会影响着其中维生素E特征吸收信号的提取,近红外光谱检测技术对于以二氧化硅和脱脂米糠为载体的预混合饲料的适用性较好,但对石粉载体的适用性较差。本研究只探讨了单一载体的影响,而实际预混料样品更复杂,需进一步考虑与其他种类维生素互作影响,以期为近红外分析方法在预混合饲料维生素检测方面的实际应用提供更多的参考。The authors have declared that no competing interests exist.
