0 引言
【研究意义】仔猪腹泻因具有发病率高、死亡快的特点,在养猪业危害中居首位[1]。当由胃肠平滑肌运动异常引起的仔猪功能性腹泻时,应使用调节肠管运动的药物,如阿托品、胃复安等,随着该类药物在临床上出现的诸多副作用[2-5],天然中草药在胃肠道疾病的应用中日渐显著。在兽医临床中忍冬藤常被用于急性细菌性痢疾和胃肠炎等病症[6-8],但其确切疗效及作用机制尚不明确。因此,进行忍冬藤对兔肠平滑肌运动的作用及机制研究,为该药在兽医临床中的应用提供坚实的理论基础。【前人研究进展】一般在医药上将金银花的干燥茎枝称为忍冬藤[9],和金银花一样具有抗菌消炎、清热解毒和止肠固痢的作用。《本草纲目》记载：“忍冬,茎叶及花,功用皆同”。 现代研究证明,忍冬藤与金银花具有相近的化学成分和药理活性[10]。2003 年非典爆发流行时金银花每千克高达百元以上,而忍冬藤一直没有被重视利用[11]。宋士军等报道,金银花提取液对兔小肠平滑肌运动具有显著抑制作用,其作用机制可能是激动β受体,抑制肌浆网释放钙离子和细胞外钙离子进入细胞内有关[12]。作为和金银花药性相似、价格低廉、来源丰富的忍冬藤对动物胃肠道的调节作用及机理研究鲜见报道,使其在防治畜禽消化道疾病的应用中受到一定限制。【本研究切入点】忍冬藤可以单方或复方出现用于治疗消化道疾病,但其作用机制不明确。课题组前期研究表明,将忍冬藤粉碎后添加到仔猪饲料中,可有效防治仔猪腹泻的发生,其作用机制可能与抑制动物胃肠道运动有关。鉴于此,本试验采用BL-420E生物机能实验系统,研究忍冬藤提取物对兔小肠平滑肌运动的影响,并使用不同工具药探明忍冬藤对动物胃肠平滑肌调控的机制。【拟解决的关键问题】开发忍冬藤的药用资源,探明忍冬藤对动物胃肠道运动的调控机制,为该药在防治动物消化道疾病的应用中提供理论依据。1 材料与方法
1.1 试验时间及地点
本试验于2013年4月至2013年10月在临沂大学药学院山东省鲁南中药材资源开发工程技术研究中心药理学实验室完成。1.2 材料
1.2.1 药品及来源 忍冬藤提取物不自制,原料由山东省平邑县九间棚农业科技园忍冬藤种植基地提供;氯化钡（批号：20080410,上海山浦化工有限公司）;乙酰胆碱（批号：15917,Acros ）;组胺（批号：H7125,Sigma ）;肝素（heparin, HP 批号：H0200000,Sigma）;钌红（ruthenium red, RR 批号：SC-202328,Santan cruz）;左旋硝基精氨酸甲酯（nitro-L-arginine methylester , L-NAME 批号：N5751,Sigma）。1.2.2 仪器及试剂 BL-420E生物信号采集系统（成都泰盟科技有限公司）;JH-2型张力传感器（中国北京航天医学工程研究所产品）;水浴恒温振荡器（江苏金坛市医疗仪器厂）;台氏液（g·L-1）：NaCl 8. 0, CaCl2 0.2, KCl 0.2, MgCl2 0.1, NaHCO3 1.0, KH2PO4 0.05, 葡萄糖1.0。
1.2.3 试验动物 选择同批次新西兰大白兔30只,雌雄各半,体重在（2.5±0.4）kg,购自山东省农业科学院畜牧兽医研究所。
1.3 试验方法
1.3.1 忍冬藤提取物制备 准确称取忍冬藤50 g,加入15倍体积的15%乙醇,浸泡30 min。之后加热至沸腾,煎煮3次,每次煎煮1 h,纱布过滤合并煎煮液。将煎煮液减压浓缩至20—30 mL,称量体积,加入乙醇,使含醇量达60 %。静置24 h后,过滤,滤液继续减压浓缩至无醇味,收集滤液后冷冻干燥备用。1.3.2 兔离体小肠平滑肌标本的制备 取健康家兔,禁食24 h 后,用木槌猛击兔头枕部致死。迅速沿腹中线打开腹腔,每只兔取十二指肠同一肠段放入盛有混合气体的饱和台式液中,洗净肠内容物。将其剪成2—3 cm 的肠段作为实验标本。
1.3.3 肠管收缩活动的记录 打开BL-420E生物机能实验系统,调零,定标,在一通道输入接口处安装张力换能器。调节恒温平滑肌槽,使水温保持在（37±0.5）℃,将台式液加入预管内,药物管加入16 mL台氏液。将标本一端固定于L型通气钩上,另一端连接张力换能器,持续通入混合气体（96% O2,4% CO2）,每秒1—2个气泡,温度在37 ℃,标准负荷1 g,平衡1 h,待肠管运动稳定后,开始进行试验。
1.3.4 忍冬藤提取物对小肠平滑肌自主性收缩的影响 待肠管收缩稳定后, 累计加入忍冬藤提取物,使终浓度分别为2.5、5、7.5、10、12.5 g·L-1,加药间隔时间为5 min,对照组加入等量生理盐水,观察忍冬藤提取物对家兔小肠自发性收缩的影响。记录忍冬藤提取物各浓度对小肠自发性收缩的频率和振幅,并计算抑制率。
频率抑制率（%）=（给药前平均频率- 给药后平均频率）/给药前平均频率×100%
振幅抑制率（%）=（给药前平均振幅- 给药后平均振幅）/给药前平均振幅×100%
1.3.5 忍冬藤提取物对激动剂（乙酰胆碱、组胺、氯化钡）所致肠痉挛性收缩的影响 随机分为4组（n=5）,乙酰胆碱+忍冬藤组、组胺+忍冬藤组、氯化钡+忍冬藤组、生理盐水+忍冬藤组。待肠管收缩稳定后, 各组分别给予乙酰胆碱（1 μmol·L-1）、组胺（5 mg·L-1）、氯化钡（10 mg·L-1）,对照组加入等量生理盐水,描记肠肌收缩的运动曲线,再加入忍冬藤提取物10 g·L-1,记录加入忍冬藤后收缩活动的频率和振幅,计算抑制率。
1.3.6 HP、RR 和L-NAME预处理肠肌后对忍冬藤提取物舒张肠肌运动的影响 随机分为4组（n=6）,HP +忍冬藤组、RR +忍冬藤组、L-NAME+忍冬藤组、生理盐水+忍冬藤组。待肠管收缩稳定后, 各组分别给予HP（50 mg·L-1）、RR（10 μmol·L-1）、L-NAME（100 μmol·L-1）,孵育15 min后,加入忍冬藤提取物10 g·L-1,对照组加入等量生理盐水,记录加入忍冬藤前后收缩活动的频率和振幅,计算抑制率。
1.3.7 统计学处理 实验数据以平均值±标准差（
2 结果
2.1 忍冬藤提取物对兔离体肠平滑肌自发性收缩的影响
2.5—12.5 g·L-1忍冬藤能剂量依赖性抑制兔小肠平滑肌收缩,忍冬藤在较低浓度时对肠肌收缩的频率和振幅均无影响,随着药物浓度的增加,对肠肌收缩的抑制作用增强,与对照组相比,药物浓度在7.5 g·L-1以上时对肠肌收缩的频率抑制率具有显著差异（P<0.05）,药物浓度在5 g·L-1以上时对振幅抑制率具有显著差异（P<0.05,图1）。2.2 忍冬藤对乙酰胆碱、组胺、BaCl2诱导肠肌收缩后的影响
2.2.1 忍冬藤对乙酰胆碱诱导肠平滑肌收缩的抑制作用 1 μmol·L-1 乙酰胆碱可明显增强肠平滑肌运动波形,使肠肌收缩振幅增加（27.5 ± 2.5）%,与对照组相比,具有极显著差异（P<0.01）,但对收缩频率无影响。加入10 g·L-1的忍冬藤后,可明显降低乙酰胆碱诱导的肠肌运动波形,并对收缩频率的抑制具有显著差异（P<0.05）;对收缩振幅的抑制具有极显著差异（P<0.01, 图2）。2.2.2 忍冬藤对组胺诱导肠平滑肌收缩的抑制作用 5 mg·L-1组胺可明显增强肠平滑肌运动波形,使收缩振幅增加（11 ± 1）%,与对照组相比,具有显著差异（P<0.05）,对收缩频率无影响。10 g·L-1忍冬藤对组胺诱导的肠平滑肌运动的波形具有抑制作用,对收缩频率具有显著抑制作用（P<0.05）,对收缩振幅具有极显著抑制作用（P<0.01,图3）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1忍冬藤对兔小肠平滑肌运动的影响
-->Fig.1Effect of the C. lonicerae on intestinal smooth muscle motility
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显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2忍冬藤对乙酰胆碱诱导的肠平滑肌收缩的影响
-->Fig. 2Effect of C. lonicerae on intestinal smooth muscle contractions induced by acetylcholine
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2.2.3 忍冬藤对BaCl2诱导肠平滑肌收缩的抑制作用 10 mg·L-1 BaCl2 可明显增强肠平滑肌运动波形,使肠平滑肌收缩频率增加8%,振幅增加14%,与对照组相比,BaCl2对收缩振幅的增强具有极显著差异（P<0.01）。10 g·L-1 忍冬藤可显著抑制由BaCl2诱导的肠肌收缩的频率和振幅（图4）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3忍冬藤对组胺诱导的肠平滑肌收缩的影响
-->Fig.3Effect of C. lonicerae on intestinal smooth muscle contractions induced by histamine
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显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图4忍冬藤对氯化钡诱导的肠平滑肌收缩的影响
-->Fig.4Effect of C. lonicerae on intestinal smooth muscle contractions induced by BaCl2
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2.3 HP、RR、L-NAME预处理对忍冬藤舒张肠平滑肌的影响
10 g·L-1忍冬藤可显著抑制肠平滑肌收缩的频率和振幅,50 mg·L-1的IP3 受体阻断剂肝素（heparin, HP）预孵育后,可增强忍冬藤舒张肠平滑肌的作用,对肠平滑肌收缩频率由（76±3）%减为44.5%（P<0.01,图5）。与忍冬藤比较,肌浆网ryanodine受体阻断剂RR（10 μmol·L-1）预孵育后对忍冬藤舒张肠平滑肌的作用无明显影响（P>0.05,图6）。一氧化氮合酶抑制剂L-NAME（100 μmol·L-1）预孵育后,可极显著增加忍冬藤舒张肠平滑肌运动的振幅（ P<0.01,图7）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图5肝素对忍冬藤抑制肠平滑肌收缩的影响
-->Fig.5Effect of HP on intestinal smooth muscle contractions inhibited by C. lonicerae
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显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图6钌红对忍冬藤抑制肠平滑肌收缩的影响
-->Fig. 6Effect of RR on intestinal smooth muscle contractions inhibited by C. lonicerae
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显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图7L-NAME对忍冬藤抑制肠平滑肌收缩的影响
-->Fig. 7Effect of L-NAME on intestinal smooth muscle contractions inhibited by C. lonicerae
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3 讨论
胃肠平滑肌痉挛可引起腹痛、腹泻等临床常见的疾病。研究表明,胃肠平滑肌上主要存在某些受体（M胆碱能受体、组胺受体和5-HT受体等）和离子通道（钙离子通道、钾离子通道和钠离子通道）[13-15]。神经递质乙酰胆碱主要通过突触后膜的两大受体系统发挥其生理作用,即烟碱型受体（N受体）和毒蕈碱型受体（M受体）,其中广泛分布于胃肠平滑肌,并对其具有调控作用的为M胆碱能受体。乙酰胆碱激动M受体,可使细胞内第二信使三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DG）浓度上升,进而引起细胞内钙离子释放,浓度增加而产生收缩反应[16]。组胺可作用于分布在胃肠平滑肌上的H1受体,以打开细胞膜上允许Na+,K+,Ca2+ 通透的离子通道,导致细胞膜去极化,进而使电压依赖性钙通道开放,胞内游离钙离子浓度增高,从而引起胃肠平滑肌收缩[17]。氯化钡可通过直接刺激胃肠粘膜,引起胃肠平滑肌细胞内钙离子释放诱导收缩[18]。本试验结果表明,忍冬藤提取物能浓度依赖性抑制肠平滑肌的自发性收缩,并显著抑制由乙酰胆碱、组胺和氯化钡诱导的肠平滑肌痉挛性收缩。因乙酰胆碱、组胺和氯化钡引起肠平滑肌痉挛性收缩都与细胞内钙离子浓度增多有关,故推测忍冬藤抑制肠平滑肌痉挛性收缩与降低细胞内钙离子浓度有关。肠平滑肌收缩所需的钙离子主要来源于细胞外通过电压依赖性钙离子通道进入的钙离子和细胞肌浆网内三磷酸肌醇受体和雷诺定受体释放的钙离子,当胞内Ca2+ 浓度达到一定水平（1—50 μmol·L-1）时, 与肌钙蛋白或肌调蛋白结合, 触发平滑肌收缩[19-20]。为此本试验进一步进行了忍冬藤提取液对内钙释放的影响。
细胞内释放的钙离子主要来自于肌浆网,肌浆网内释放的钙离子主要通过三磷酸肌醇受体（IP3）和雷诺定受体（ryanodine）来完成。当这些受体被激活后,可引起肌浆网内钙离子释放,从而引起细胞内钙离子浓度增加,诱导平滑肌收缩[21-22]。忍冬藤可能通过三磷酸肌醇受体或雷诺定受体途径来完成其对肠平滑肌运动的抑制作用。为此,本试验进行了IP3受体阻断剂肝素（HP）和雷诺定受体阻断剂钌红（RR）预处理下,忍冬藤对肠平滑肌的作用。结果显示,预先应用IP3受体阻断剂HP可显著减弱忍冬藤对肠平滑肌收缩的振幅（P<0.01）,而预先应用雷诺定受体阻断剂RR后,对忍冬藤舒张肠平滑肌的作用无影响（P>0.05）,由此推断,IP3受体途径受到抑制,引起细胞内钙离子释放减少可能介导忍冬藤舒张肠平滑肌的作用,但雷诺定受体途径并未介导忍冬藤对肠平滑肌的舒张作用机制。
据报道,神经递质NO通过激活平滑肌细胞内的鸟苷酸环化酶,使胞质内cGMP浓度增高,钙离子浓度下降,诱导胃肠平滑肌的舒张[23-25]。本试验采用NO合酶抑制剂L-NAME预处理肠平滑肌细胞,忍冬藤舒张平滑肌作用明显减弱（P<0.01）,表明忍冬藤对肠平滑肌的抑制作用可能与NO浓度有关,但对其下游的鸟苷酸环化酶有无影响尚需进一步研究。
4 结论
通过忍冬藤对兔小肠平滑肌运动的影响研究,表明忍冬藤可浓度依赖性抑制自发性肠平滑肌收缩,并对乙酰胆碱、组胺和氯化钡诱导的肠平滑肌痉挛具有显著抑制作用;IP3受体阻断剂HP和NO合酶抑制剂L-NAME预处理后可显著增强忍冬藤的舒张作用,而雷诺定受体阻断剂钌红并没有影响忍冬藤的舒张作用。由此得出忍冬藤抑制兔肠平滑肌收缩的作用机制可能为增加小肠平滑肌NO浓度,抑制IP3受体介导的内钙释放,最终使细胞内钙离子浓度降低,平滑肌舒张而达到对肠平滑肌的解痉作用。忍冬藤对动物肠平滑肌运动具有显著的舒张作用,因此,该药在胃肠功能紊乱性疾病的应用中,具有广阔的开发前景。The authors have declared that no competing interests exist.
