0 引言
【研究意义】随着全球畜牧业的发展,奶牛业已成为支持畜牧业发展的重要产业。目前中国奶牛的总存栏数到达1 440万头[1],位居世界第三,奶制品产量占世界总量的6%,乳制品总量排在世界领先水平[2]。高产品种的培育和引进,生产性能的不断提高和饲养管理不当,使得奶牛围产期疾病日趋突出,给畜牧业造成巨大的经济损失。介于目前环境问题日益紧张,畜牧业温室气体排放量为全球排放量的18%[3]。奶牛低血钙症是奶牛围产期常见的一种重要的营养代谢疾病。临床上以低血钙、肌无力、四肢瘫痪,精神沉郁甚至昏迷等为主要症状。还会引起瘫痪、真胃变位、胎衣不下、子宫复旧缓慢及子宫内膜炎等疾病[4]。本研究为明确亚临床低血钙症奶牛生产性能、饲料转化率、粪尿排放及评价粪尿产生的污染气体的排放指数,为防治奶牛亚临床低血钙症及减少有害气体排放提供实验基础数据。【前人研究进展】数据显示,国外分娩奶牛低血钙症的发病率为0.6%—50%[5],亚临床低血钙症的发生率为14%—50%[6];国内奶牛亚临床低血钙发病率可高达80%[7]。亚临床低血钙症（sub clinical hypocalcemia）是奶牛一种钙代谢负平衡的病理现象。当奶牛血钙浓度低于2.0 mmol·L-1时可被认为患有亚临床低血钙症。据报道,美国67%的经产奶牛患有亚临床低血钙[8]。由于无明显的临床症状,该病极容易被忽视,加上易继发围产期其他疾病,从而给奶牛业带来巨大的经济损失。目前环境污染问题严重,且奶牛业带来的能量消耗、环境污染也成为了一个重要方面。畜牧业粪尿产生的温室气体给环境带来了极大的压力,尤其是二氧化碳（CO2）、甲烷（CH4）、氧化亚氮（N2O）、氨气（NH3）等,对环境的污染严重[9]。IPCC的数据统计表明家畜温室气体排放量大约相当于全球人类活动温室气体排放量的7%—18%,其中牛类每年GHG排放量在4.6千兆t二氧化碳当量左右,占家畜总排放量的65%,其中肉牛的GHG排放量占44%,奶牛的温室气体排放量占21%[10]。2011年GERBER等研究发现奶牛在生产乳制品时就会排放温室气体,随着奶制品产量的提高甲烷和氧化亚氮的排放量出现相对减少,而二氧化碳的排放量出现相对上升[11]。再加上中国饲料用粮逐年上涨,从1978年的4 575万t上涨到2003年的16 538万t,其年增长率为5.3%,远高于商品粮的1.4%。不仅饲料量的比例逐年上涨,其安全问题也会越来越受到国家的重视,成为维护粮食安全和稳定发展的重要组成部分[12]。饲料的转化率低,对能源的浪费加大,更不利于响应低投入、低排放、低能耗、高效益的低碳畜牧业发展战略。【本研究切入点】亚临床低血钙症作为集约化养殖模式下重要的奶牛群发常见多发病,对奶牛养殖业造成严重的危害,但目前从疾病的角度来系统阐述亚临床低血钙症奶牛生产性能、饲料利用、粪污及其气体排放等方面特征的研究较少。【拟解决的关键问题】探索亚临床低血钙症奶牛的生产性能,饲料转化和粪尿污染及温室气体排放特征,为低碳畜牧业研究提供数据参考。1 材料与方法
1.1 试验动物与饲养条件
2014年12月,于黑龙江省某集约化奶牛养殖场,选取产后7—14 d年龄、体况、胎次相近的荷斯坦奶牛12头作为试验动物,根据其血钙浓度,分亚临床低血钙症组（1.4 mmol·L-1<血钙浓度<2.0 mmol·L-1,无明显临床症状）和健康组（2.1 mmol·L-1<血钙浓度<2.5 mmol·L-1,无其他任何症状）,每组各6头。奶牛饲喂围产期全混合日粮（TMR）组成见表1。每头奶牛均为单独饲养,连续饲养4 d,记录每天每头牛的采食量、泌乳量、排粪量、排尿量。Table 1
表1
表1奶牛TMR日粮组分表
Table 1Ingredients and chemical compositions of the diets fed to dairy cows
| 日粮组成 Ingredient of DM (%) | 营养成分 Nutrient composition | ||
|---|---|---|---|
| 棉籽Cottonseed | 3.25 | 干物质DM (%) | 58.26 |
| 燕麦Oats | 2.50 | 能量NET (MCAL·kg-1) | 1.75 |
| 青贮Silage corn | 37.50 | 粗脂肪Crude fat (%) | 8.09 |
| 苜蓿Domestic alfalfa | 5.00 | NDF (%) | 39.08 |
| 羊草Chinese wildrye | 2.25 | 磷P (%) | 0.25 |
| 精料Concentrate feed | 23.12 | 氮N (%) | 3.31 |
| 大豆皮Soybean skin | 2.10 | 有机物Organic matter (%) | 95.75 |
| 压片玉米Steam-flaked corn | 3.20 | ||
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1.2 样品的采集与处理
试验奶牛清晨饲喂前尾静脉采血10 mL,迅速离心（3 000 r/min,5 min）分离血清,置于-20℃冰箱冷冻保存待检。于全自动生化分析仪中（型号modull- arDPP,德国）检测每头试验奶牛每天血清中的钙（Ca）,β-氢丁酸（BHBA）,葡萄糖（GLU）,磷（P）,镁（Mg）,游离脂肪酸（NEFA）。试验奶牛每天榨乳3次,记录3次榨乳量相加为一天的泌乳量。
阴道按摩法采集排尿中间部分的尿液50 mL,置于-20℃冰箱冷冻保存待检。每天每8 h收集1次试验场地排尿沟内的尿液,记录每头牛每天尿量。
每头奶牛每天经直肠采集粪便或采集刚排出的未被污染的粪便样品0.5 kg,置于-20℃冰箱冷冻保存待检。每天每8 h清理饲养场地的粪便并称量,记录当天奶牛的排粪量。
1.3 检测项目及方法
血液检测方法：钙（Ca,比色法）、磷（P,比色法）、镁（MG,络合指示剂和全自动生化分析仪）、β-羟丁酸（BHBA,酶联免疫法）、葡萄糖（GLU,葡萄糖氧化酶法）,游离脂肪酸（NEFA,比色法）。乳汁检测指标：乳脂率、乳蛋白率、乳糖率用乳成分分析仪检测（荷兰DELTA LactoScope FTIR,表2）。
Table 2
表2
表2乳汁指标检测
Table 2The results of milk index
| 检测项目 Item | 健康组（n=25） Healthy group | 亚临床低血钙组（n=20） Subclinical hypocalcemia group |
|---|---|---|
| 乳脂率Fat (%) | 3.35±0.86 | 4.7±1.77** |
| 乳蛋白率Protein (%) | 3.31±0.38 | 3.58±0.56* |
| 乳糖率Lactose (%) | 5.12±0.31 | 4.74±0.67 |
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气体试验方法：气体试验是在黑龙江八一农垦大学动物科技学院恒温气候室进行,采用简易动态箱法对试验奶牛粪尿气体排放进行测定,健康组粪尿混合比例为1.4﹕1,亚临床低血钙症组粪尿混合比例为1.6﹕1,共计200 g。分别混合健康组所有奶牛每天的粪便和尿液,按同样方法分别混合亚临床低血钙症组奶牛粪便和尿液。分别置于底面积为78.5 cm2,高20 cm的广口瓶子中,25℃下进行,进气口位于瓶子顶端以2 L·min-1送空气,出气口位于离粪尿5 cm高度,试验持续120 h,每3 h采集一次气体50 mL置于气袋中,用INNOVA 1412光声气体检测仪器（AirTech Instruments A/S,Ballerup,Denmark）检测CO2、CH4、N2O浓度气体,NH3浓度用纳氏试剂分光度法测定。
1.4 数据处理
所有数据均采用SPSS19.0软件进行独立样本t检验分析,数据以“均值±标准差”表示。同行数据后所标*表示差异显著（P<0.05）,**表示差异极显著（P<0.01）,未标*表示差异不显著（P>0.05）。1.5 4%能量校正乳和干物质消化率计算
4%能量校正乳（ECM）=（0.038×乳脂g+0.024×乳蛋白g+0.017×乳糖g）×产奶量kg÷3.14;干物质消化率=（干物质采食量﹣干物质粪量）/干物质采食量。
公式参照文献[13]、[14]。
2 结果
2.1 血液指标
由表3可知,亚临床低血钙组奶牛Ca、P、Mg、极显著低于健康组奶牛（P<0.01）,GLU的含量显著低于健康组（P<0.05）,血清BHBA含量显著高于健康组（P<0.05）。NEFA含量极显著高于健康组（P<0.01）。Table 3
表3
表3试验奶牛血清生化指标检测结果
Table 3Biochemical parameters in the serum of experimental dairy cows (mmol·L-1)
| 检测项目 Item | 健康组（n=25） Healthy group | 亚临床低血钙症组（n=20） Subclinical hypocalcemia group |
|---|---|---|
| Ca | 2.18±0.14 | 1.58±0.34** |
| BHBA | 0.68±0.15 | 0.83±0.25* |
| GLU | 4.23±0.58 | 3.01±0.34* |
| P | 1.96±0.20 | 1.69±0.33** |
| Mg | 0.86±0.08 | 0.77±0.10** |
| NEFA | 0.41±0.18 | 0.74±0.26** |
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2.2 亚临床低血钙奶牛的产奶量,采食量,排粪量和排尿量
由表4可知,与健康奶牛相比,亚临床低血钙奶牛的产奶量极显著升高（P<0.01）,4%能量校正乳显著升高（P<0.05）,排粪量显著增加（P<0.05）,但采食量和排尿量差异不显著。排尿量有增加趋势。干物质消化率差异不显著但有升高趋势。采食1 kg干物质的产奶量差异极显著（P<0.01）,采食1 kg干物质的排粪量差异显著（P<0.05）。Table 4
表4
表4产奶量,采食量,排粪量,排尿量
Table 4The results of milk yield, feed intake, feces and urine output
| 检测项目 Item | 健康组（n=25） Healthy group | 亚临床低血钙组（n=20） Subclinical hypocalcemia group |
|---|---|---|
| 奶量Milk yield (kg·d-1) | 23.40±2.28 | 29.38±3.32** |
| 4%能量校正乳ECM (kg·d-1) | 25.48±8.95 | 31.88±8.27* |
| 采食量Feed intake (kg·d-1) | 25.08±3.64 | 25.76±4.18 |
| 干物质采食量DMI (kg·d-1) | 12.86±1.98 | 13.32±1.94 |
| 粪量Feces (kg·d-1) | 24.63±3.88 | 30.89±4.63* |
| 干物质粪量Dry feces (kg·d-1) | 4.08±0.49 | 4.88±0.91 |
| 尿量Urine volume (kg·d-1) | 16.68±2.85 | 19.09±4.09 |
| 干物质消化率 Dry matter digestion efficiency | 0.63±0.09 | 0.68±0.03 |
| ECM/DMI | 0.99±0.22 | 1.21±0.24 |
| DF/DMI | 0.32±0.03 | 0.37±0.09 |
| 采食1kg干物质的产奶量 Milk yield which was fed 1 kg dry matter (kg) | 1.83±0.19 | 2.24±0.38** |
| 采食1kg干物质的产粪量 feces which was fed 1 kg dry matter (kg) | 1.92±0.22 | 2.32±0.48* |
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2.3 气体排放
ADVIENTO-BORBE等人研究表明N2O在牛的粪便中排放浓度过低可以忽略不计,本试验所检测到的N2O的浓度也较低故没有说明其排放情况[15-16]。2.3.1 CH4的排放 如图1、2 所示,健康组和亚临床低血钙症组奶牛CH4的排放曲线无明显差异,两组的产气趋势基本相同,于试验的52 h左右出现峰值,之后下降。由于实验室仿照自然环境下粪尿分解情况,氧气量充足,在这种情况下不利于CH4的产生,故排放速率较低。累计排放量差异不显著。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图1CH4的排放特征曲线
-->Fig. 1The characteristic curve of CH4 emission
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显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图2CH4的累计排放量
-->Fig. 2The accumulative curve of CH4 emission
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2.3.2 CO2的排放 CO2的排放浓度没有明显变化趋势,也未见明显规律性变化,健康组和亚临床低血钙症组分别在48和36 h处出现高峰,亚临床低血钙症组出现峰值的时间要早于健康组,之后下降随即无规律起伏（图3）。亚临床低血钙症组的累计排放量随时间的推移低于健康组（图4）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图3CO2的排放浓度
-->Fig. 3The characteristic curve of CO2 emission
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显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图4CO2的累计排放量
-->Fig. 4The accumulative curve of CO2 emission
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2.3.3 NH3的排放 健康组奶牛NH3排放浓度在24 h处出现高峰,随后降低,45 h再次出现峰值,之后排放浓度逐渐降低。亚临床低血钙症组奶牛NH3排放浓度在21 h处出现峰值,之后排放浓度降低。在图5中可以看出两组试验的折线趋势基本一致,出现峰值后浓度降低但都是有起伏的波动。亚临床低血钙症组NH3的累计排放量低于健康组（图6）。
显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图5NH3的排放浓度
-->Fig.5The characteristic curve of NH3 emission
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显示原图|下载原图ZIP|生成PPT图6NH3的累计排放量
-->Fig. 6The accumulative curve of NH3 emission
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3 讨论
3.1 血液指标分析
奶牛低血钙的产生主要是由于分娩和大量泌乳导致奶牛对钙离子需求加剧,血液中大量的钙离子进入乳汁并随着乳汁排出体外,造成血钙浓度在短时间内急剧下降。小肠是机体钙吸收的主要场所[17],骨骼是钙的主要贮存场所,当血钙浓度低下时机体通过肠道的吸收和骨钙的动员来补充,然而由于妊娠分娩对奶牛的生理应激状态,此时钙的稳态调节机制尚未充分发挥作用,而泌乳初期肠道和骨钙不能完全满足对机体钙的大量需求,奶牛就会出现低血钙症[18]。低血镁造成甲状旁腺分泌（PTH）减少,影响钙的代谢。低血钙奶牛血液BHBA显著高于对照组,血糖含量显著低于对照组,表明低血钙奶牛处于能量负平衡的状态。能量负平衡状态下由于奶牛摄食的营养物质不能满足泌乳对营养物质的需求也是低血钙发生主要原因。3.2 亚临床低血钙症奶牛采食量与泌乳量、排粪量的关系
奶牛低血钙症常发于高产奶牛,本试验中亚临床低血钙症奶牛的产奶量极显著高于健康组奶牛（P<0.01）,亚临床低血钙症奶牛所产能量校正乳也显著高于健康组奶牛（P<0.05）,这与HORST等研究结果一致,他们发现患低血钙症的奶牛在泌乳高峰期的3周内产奶量明显增加[19]。而本试验中亚临床低血钙组的排粪量出现显著增加（P<0.05）,排尿量出现上升趋势,采食1 kg干物质的产奶量极显著增加（P<0.01）,采食1 kg干物质的产粪量也出现显著增加（P<0.05）,而采食量并无显著变化,这可能是由于低血钙奶牛中的钙离子含量下降,引起奶牛出现能量负平衡现象,使得奶牛过多的动员体内的能量来满足产奶需求,这种异常的产奶量上升,如果持续发展不予以治疗,可能会引起更加严重的低血钙症状,影响奶牛产奶的持续力。3.3 气体排放情况
温室气体排放目前已成为全球关注的焦点,数据显示农业排放的CO2、CH4、N2O等已成为温室气体的主要来源,其中畜牧业温室气体主要来源于畜禽呼吸代谢、反刍动物瘤胃发酵、畜禽粪便处理过程中直接或间接的排放[20]。奶牛粪便的分解会产生大量的甲烷,奶牛粪便中含有大量的有机物,在厌氧的条件下粪尿中有机物被分解为有机酸、H2和CO2,然后在微生物有机体内生成CH4,该过程受环境温度、饲料特性、堆积高度覆盖等因素的影响。动物粪便分解 CH4可分为3个阶段：水解,产酸,产甲烷;好氧分解是几乎不产生CH4。本试验开始时氧气充足,随着试验时间的进行,粪尿中氧气的消耗,CH4产生量增加,在试验的第3天达到排放峰值,但随着粪尿表面硬壳的产生阻止了气体的溢出检出量减少[21]。从图1、2中可以看出两组奶牛粪尿混合物所产生的甲烷排放趋势和排放量基本相同,这说明在饲喂相同饲料的情况下甲烷的产生是无差异的。美国的研究表明,在饲喂相同饲料的情况下,不同品种、年龄和性别的动物甲烷排放量相似[22]。PINARES-PATINO 等报道,给绵羊和羊驼同时饲喂紫花苜蓿时,甲烷产生量没有显著差异[23]。所以亚临床低血钙症可能不引起甲烷排放量的变化。当环境处于好氧条件下CO2的产生,通常要经过升温、高温、降温和腐熟微保温4个阶段,粪尿中的有机成分转化为CO2、热量、生物量和腐殖质。好氧微生物将粪尿转化和分解成为可降解有机物同时产生CO2、水及热量的过程,粪尿堆置材料碳素物质主要是为微生物活动提供能源和碳源[24]。厌氧情况下甲烷产生量增加,不利于CO2的产生[25]。本试验前期氧气相对充分,CO2排放浓度较高,但亚临床低血钙症组CO2排放峰值出现早于健康组。这是可能是由于两组试验奶牛的粪尿混合比例不同造成的,当粪便中水分含量高时趋于厌氧环境,不利于CO2的产生,而亚临床低血钙症组奶牛粪便中水分含量较大,过早地消耗尽了氧气,并且CH4和CO2的排放此消彼长、相互制约,随着氧气消耗殆尽甲烷的产生抑制了CO2的生产,所以亚临床低血钙症组奶牛的CO2排放量低于健康组。
N2O的生成机理在不同环境中有多种途径,但硝化和反硝化作用被认为是生成N2O的基本机理。在通气条件下,氨和氨盐通过硝化细菌的作用,被氧化成硝酸盐和亚硝酸盐的过程称为硝化作用,此过程产生N2O[26]。一般说来,硝化作用包括两个步骤,即氨氧化为亚硝酸和亚硝酸氧化为硝酸,分别由氨氧化菌和亚硝酸氧化菌完成。首先由氨氧化成亚硝酸,然后亚硝酸再氧化成硝酸,期间生成N2O。上述反应中,有些过程不甚完全了解,但N2O作为中间产物则是肯定的,而且在某些条件下N2O释放量很大[27]。反硝化作用是在通气不好的条件下,在反硝化细菌或化学还原剂作用下 NO3、NO2、N2还原生成NO、N2O、N2的过程。SOMMER等发现,当没有表面覆盖时,N2O的排放凡乎为零,然而当形成自然表面外壳时,N2O的排放增加[28]。表面覆盖层为硝化反应和反硝化反应提供合适的地方,导致N2O的产生增加,但是在实际条件下（农场粪坑覆盖稻草后）N2O和CH4的排放也很低[29],NH3的产生也会抑制N2O的排放,本试验检测到的N2O的排放浓度也很低,这与前人研究结果相似。
钱承梁等[30]研究表明,牛粪氨的挥发过程快而猛,挥发高峰天数在1—2 d,本试验中健康组奶牛的NH3排放结果显示,24 h内NH3浓度迅速上升,随后下降,45 h有上升,之后逐渐降低。这一结果与钱承梁等研究结果相符。而亚临床低血钙组奶牛NH3排放低于健康组,且趋势相对平稳,原因与CO2相似。
4 结论
奶牛亚临床低血钙初期,泌乳量增加明显,生产性能的增加调动了机体的能量动员,机体能量负平衡的出现和肠道的消化吸收率增加共同用于满足亚临床低血钙症奶牛泌乳能量增加的需求。同时,亚临床低血钙症奶牛粪尿混和物中CO2和NH3的排放量减少。但亚临床低血钙症不会影响甲烷的排放。The authors have declared that no competing interests exist.
