崔一平, 彭埃天^,, 宋晓兵, 程保平, 凌金锋, 陈霞广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室,广州 510640

Investigation on Occurrence of Citrus Huanglongbing and Virus Diseases, and Prophage Genetic Diversity of Huanglongbing Pathogen in Meizhou, Guangdong

CUI YiPing, PENG AiTian^,, SONG XiaoBing, CHENG BaoPing, LING JinFeng, CHEN XiaPlant Protection Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection, Guangzhou 510640

通讯作者: 彭埃天,E-mail: pengait@163.com

责任编辑: 岳梅
收稿日期:2019-09-16接受日期:2019-11-18网络出版日期:2020-04-16

基金资助:

国家重点研发计划.2018YFD0201500 国家重点研发计划.2017YFD0202000 科技创新战略专项资金(高水平农科院建设).R2018QD-059 广东省现代农业产业技术体系创新团队建设项目.2019KJ108 广东省现代农业产业技术体系创新团队建设项目.2018LM1077 植物疫病防控省级项目.0835-190Z22803281 梅州市政府购买服务合同项目.2018063001

Received:2019-09-16Accepted:2019-11-18Online:2020-04-16
作者简介 About authors
崔一平,E-mail: kktracy@163.com。








摘要
【目的】调查柑橘黄龙病（Huanglongbing,HLB）和病毒病在广东省梅州市柑橘主产区的危害情况,分析该地区柑橘黄龙病菌（CLas）的原噬菌体多样性。【方法】以16S rDNA为模板设计引物,利用实时荧光定量PCR（qPCR)检测梅州市不同抽检地在2017—2019年3年间柑橘黄龙病的发病情况;同时分别采用已报道的柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）、柑橘裂皮病毒（Citrus exocortis viroid,CEVd）、柑橘褪绿矮缩病毒（Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDaV）、柑橘碎叶病毒（Citrus tatter leaf virus,CTLV）和柑橘黄脉病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）的特异性检测引物,提取样品的RNA,反转后以样品的cDNA为模板,通过普通PCR的方法分析梅州市抽检地区柑橘病毒病的发生情况。此外,以基于2种原噬菌体类型（SC1和SC2）对应的超变异基因区域设计的2对引物（Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2）,运用普通PCR方法分析该地区CLas菌株原噬菌体的遗传多样性。【结果】除2018年9月梅州大浦顺兴公司蜜柚基地的抽检样品外,梅州市其他被检地区均发现CLas。总体来说,梅州市的脐橙CLas检出率为55.3%,蜜柚为61.5%,沙田柚为61.7%。其中2017年采集自平原县大拓镇的蜜柚和沙田柚样品CLas检出率为100%,兴宁市白马镇的蜜柚为100%,沙田柚为80%;其他抽检地区的样品CLas检出率在16.7%—83.3%。虽然梅州市部分地区的检出率较高,但其病原菌的含量并不高,大部分处于柑橘黄龙病发病初、中期,属可防可控阶段;此外,梅州市柑橘病毒的总检出率不高,CTV、CTLV和CYVCV为梅州的主要病毒,CEVd和CCDaV没有检测到。CTV、CTLV和CYVCV在脐橙上的检出率依次为78.9%、7.9%和21.1%,蜜柚为15.4%、25.0%和9.6%,沙田柚为6.4%、2.1%和4.3%。基于Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2来研究CLas原噬菌体多样性的PCR扩增条带共有4种类型（SC1-1、SC1-2、SC2-1和SC2-2）,经过PCR电泳和测序得出,来自梅州市脐橙和沙田柚的CLas菌株以SC2-1型为主,蜜柚上以SC1-1型为主。【结论】梅州柑橘产区的柑橘黄龙病目前属于可防可控阶段,其病原菌菌株的原噬菌体在不同品种上具有其独特性;由于在抽检时发现有柑橘病毒病的存在,因此在种植过程中需加强种苗监管,同时应采取有效措施对柑橘黄龙病和柑橘木虱（Diaphorina citri）进行绿色防控。
关键词： 柑橘黄龙病;韧皮部杆菌亚洲种;柑橘病毒病;原噬菌体;遗传多样性

Abstract
【Objective】The objective of this study is to investigate the impacts of citrus Huanglongbing (HLB) and virus diseases on citrus production in Meizhou City of Guangdong Province, and to reveal the local ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ (CLas, the pathogen of HLB in China) strains genetic diversity based on the prophage region.【Method】The primers were designed with 16S rDNA as the template, and the incidence of HLB in different sampling sites in Meizhou City in the 3 years from 2017 to 2019 was detected by qPCR. After RNA extraction, RT-PCR followed by ordinary PCR were applied to detect Citrus tristeza virus (CTV), Citrus exocortis viroid (CEVd), Citrus chlorotic dwarf-associated virus (CCDaV), Citrus tatter leaf virus (CTLV) and Citrus yellow vein clearing virus (CYVCV) using their own reported primers, separately. Two pairs of primers (Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1 and Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2) were designed based on the supervariant gene regions corresponding to two prophage types (SC1 and SC2), and the genetic diversity of CLas prophage regions was analyzed using ordinary PCR method.【Result】The results of CLas detection showed that only the sample from one orchard (Honey pummelo base in Shunxing Company in Dapu County) in September, 2018 was free, other inspected areas in Meizhou all had CLas. Overall, the CLas detection rate of navel orange in Meizhou was 55.3%, the honey pummelo was 61.5%, and the Shatian pummelo was 61.7%. Among them, the CLas detection rate of honey pummelo and Shatian pummelo collected from Datuo Town, Pingyuan County in 2017 was 100%, the detection rate of honey pummelo and Shatian pummelo in Baima Town, Xingning City was 100% and 80%, respectively. The detection rate of samples in other sampling areas was 16.7%-83.3%. Although the detection rate in some areas of Meizhou was high, the content of pathogenic bacteria was not high, most of them were at the early and middle stages of HLB, which belonged to a preventable and controllable stage. In the same region, the total detection rate of citrus viruses in Meizhou City was not high. CTV, CTLV and CYVCV were the main viruses in Meizhou, CEVd and CCDaV were not detected. The detection rate of CTV, CTLV and CYVCV on navel orange was 78.9%, 7.9% and 21.1%, on honey pummelo was 15.4%, 25.0%, and 9.6%, on Shatian pummelo was 6.4%, 2.1%, and 4.3%, respectively. Through prophage genetic diversity analysis of CLas strains in Meizhou City, four CLas prophage amplicon types (SC1-1, SC1-2, SC2-1 and SC2-2) were observed in the CLas from all the tested samples, SC2-1 represented the predominant CLas type in navel orange and Shatian pummelo in Meizhou City, and SC1-1 was predominant in honey pummelo.【Conclusion】The citrus HLB in Meizhou citrus producing area is currently at a controllable stage. The prophage of its pathogenic CLas strain is unique in different varieties. Due to the existence of citrus virus diseases during spot inspection, seedling supervision needs to be strengthened during the planting process and effective measures should be taken to prevent and control HLB and Diaphorina citri.
Keywords：citrus Huanglongbing;‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ (CLas);citrus virus disease;prophage;genetic diversity


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崔一平, 彭埃天, 宋晓兵, 程保平, 凌金锋, 陈霞. 广东梅州柑橘黄龙病和病毒病的发生调查及其黄龙病菌原噬菌体多样性[J]. 中国农业科学, 2020, 53(8): 1572-1582 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.08.007
CUI YiPing, PENG AiTian, SONG XiaoBing, CHENG BaoPing, LING JinFeng, CHEN Xia. Investigation on Occurrence of Citrus Huanglongbing and Virus Diseases, and Prophage Genetic Diversity of Huanglongbing Pathogen in Meizhou, Guangdong[J]. Scientia Acricultura Sinica, 2020, 53(8): 1572-1582 doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2020.08.007

0 引言

【研究意义】柑橘黄龙病（Huanglongbing,HLB）是世界性的柑橘病害,有柑橘“癌症”之称,目前没有发现有效的防治措施^[1,2]。HLB可在柑橘上形成典型症状,如叶片斑驳、褪绿均匀黄化或胶质化、叶脉粗大等,这些发病症状极易与柑橘田间缺素症、病毒病及药/肥害等症状相混淆。HLB主要由柑橘韧皮部细菌属（Candidatus Liberibacter）的3个种引起,分别为亚洲种（‘Ca. L. asiaticus’,CLas）、非洲种（‘Ca. L. africanus’,CLaf）和美洲种（‘Ca. L. americanus’,CLam）^[3,4]。我国的HLB主要由CLas引起,通过木虱或带病植物材料进行传播。目前该病原菌还不能被人工培养,对研究该病原菌的形态和生理生化等方面造成了很大的障碍。梅州是广东省重要的柑橘产区,柑橘（包括柚、橙、柑、橘）产业是其农业的支柱产业,明确目前HLB在梅州市的危害情况并分析该地区CLas的原噬菌体多样性,对于该病害的防控具有重要意义。【前人研究进展】黄龙病菌基因组主要由染色体区域和原噬菌体区域两部分组成。染色体区域具有高度保守性,但原噬菌体区域变化较大,可以用于区分黄龙病菌的多样性^[5,6]。随着不同地区柑橘黄龙病菌基因组的揭示,越来越多的研究者通过研究病原菌的遗传多样性对黄龙病菌的种群遗传结构及病害流行学进行解析。过去对黄龙病菌遗传多样性的研究主要集中于16S rDNA、16S/23S rDNA基因间隔区、β-操纵子以及外膜基因omp等区域,但基于16S rDNA、16S/23S rDNA基因间隔区的PCR-SSCP、PCR-RFLP或PCR-RFLP-SSCP等分子标记技术均未发现黄龙病菌种内的明显分化现象^[7,8,9]。VILLECHANOUX等首次利用黄龙病菌的β-操纵子区域对日本、中国以及东南亚各国不同来源的CLas遗传多样性进行研究,发现不同菌株间的同源性很高,只存在少量核苷酸的变异^{[10,11,12,13]};黄永辉等^[14]利用黄龙病菌外膜蛋白（outer membrane protein,OMP）基因对来自广东省7个不同地区的7个菌株遗传多样性进行研究,发现广东地区黄龙病菌在omp水平上未见显著差异;董俊等^[15]利用M94319对采自湖南、江西、福建等地的黄龙病菌菌株进行遗传多样性分析,发现该基因也不能很好地反映不同菌株间的遗传多样性,仅能够反映黄龙病菌菌株的分化除了地域差异外还有寄主作物的不同;谭锦等^[16]利用黄龙病菌体内2种原噬菌体对应的超变异基因区域设计的2对引物,对中国不同柑橘产区的224个CLas菌株进行PCR检测和序列分析,发现PCR扩增的条带类型呈多态性,说明中国不同地理来源CLas菌株在原噬菌体区域具有较丰富的多态性,揭示了中国CLas种群的遗传多样性;XU等^[17]利用CLas基因组中全套串联重复基因（short tandem repeat,STR）对中国福建、广西、云南、广东、江西、浙江的32个样品进行PCR扩增,PCR产物表现出良好的多态性,同时发现广东省CLas具有一定的遗传特异性;黄爱军等^[18]利用对已知23个SSR（simple sequence repeat）位点筛选获得的5个SSR位点对中国境内8个不同地理来源的样品进行分析,获得很好的CLas遗传多态性;卢占军等^[19]利用筛选获得的3个位点（LasSSR-C、LasSSR-D、CWBJ44）对赣南CLas遗传多样性及各地种群结构进行分析获得了很好的结果。【本研究切入点】2017年梅州市柑橘产业面积4.83万公顷,占全省1/6。梅州盛产沙田柚（金柚）和蜜柚,是著名的“金柚之乡”,全国最大的柚类商品生产基地^[20],主产区在梅县区和大埔县。近年来,脐橙的种植面积也在逐年递加,全市橙子面积0.35万公顷,产量7.41万吨,主产区在平远县。2018年梅县区金柚、大埔县蜜柚、平远县脐橙成功入选广东省现代农业产业园项目（材料来自梅州市农业局）^[21,22]。但近年来不断有关于梅州市柑橘主产区柑橘HLB发生的报道。【拟解决的关键问题】对梅州柑橘主产区HLB的发病情况进行调查和分析,同时对柑橘病毒病在该地区的危害程度进行抽检;并进一步对来自梅州市的不同柑橘CLas菌株原噬菌体超变异基因的遗传多样性进行研究,明确梅州市CLas的遗传多样性。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试植物材料分别于2017—2019年采自广东省梅州市平远县仁居镇和大拓镇,梅县区石扇镇、城东镇、雁洋镇和人民广场森林公园,大埔县大东镇、湖寮镇和百侯镇,兴宁市石马镇,均采用多点随机采样法。其中脐橙采自平远县仁居镇;沙田柚采自梅县区石扇镇和城东镇,梅州大浦顺兴公司蜜柚基地,平远县大拓镇和兴宁市白马镇;蜜柚采自梅县区石扇镇、雁洋镇和人民广场森林公园,大埔县湖寮镇、百侯镇和梅州大浦顺兴公司蜜柚基地,平远县大拓镇和兴宁市白马镇。采集地的种植年限不一,管理水平也不同,部分采集地信息见表1。

Table 1
表1
表1部分采集地的详细信息
Table 1The detailed message of part of sample locations

采集地 Location		品种 Variety	种植年限 Crop years (a)	面积 Area (hm2)
平远县 Pingyuan County	仁居镇飞龙村Feilong Village, Renju Town	脐橙Navel orange	>2	100
	仁居镇六吉村Liuji Village, Renju Town		>1	100
梅县区 Meixian District	石扇镇西南村Xi’nan Village, Shishan Town	蜜柚Honey pummelo	>20	100
	人民广场森林公园People’s Square Forest Park		>5	>10
	石扇镇西南村Xi’nan Village, Shishan Town	沙田柚Shatian pummelo	>2	300
	城东镇玉水村Yushui Village, Chengdong Town		>25	>10
大埔县Dapu County	大东镇东光村Dongguang Village, Dadong Town		>9	1000

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1.2 方法

1.2.1 植物DNA和RNA的提取、质量检测及RNA的反转录 植物DNA和RNA的提取：每份DNA和RNA样品均采集3个柑橘叶片的中脉或柑橘果实的果皮;先用刀片把材料切碎,而后用液氮快速将样品磨成粉末,依次类推。每个样品单独用一副手套、一个研钵和研磨棒（使用前需对研钵和研磨棒进行高温灭菌处理）。DNA的提取严格按照试剂盒（爱思进动植物基因组DNA制备试剂盒,AXYGEN,美国）说明书进行,具体提取方法详见试剂盒说明书;RNA的提取主要采用天根生化科技有限公司的RNA提取试剂盒（DP441,RNAprep Pure Plant Plus Kit）,具体操作详见试剂盒说明书。

DNA和RNA的质量检测：取2 µL样品在超微量紫外/可见分光光度计（Nano-100）上进行检测,读取并记录DNA和RNA的含量和质量数值。

RNA的反转录：具体操作见天根生化科技有限公司反转录试剂盒说明书（货号：KR116-02,FastKing RT Kit （with gDNAase））。

1.2.2 CLas的分子检测 采用实时荧光定量PCR（qPCR）方法对柑橘叶片和果实中的CLas进行检测,检测仪器为ABI PRISM 7500（Applied Biosystems,Foster City,CA,USA）。同时以CLas的部分16S rDNA序列为模板设计引物,引物的设计主要参照LI等^[23]。HLBas：5′-TCGAGCGCGTATGCAATACG-3′,HLBr：5′-GCG TTATCCCGTAGA AA AAGGTAG-3′,利用探针HLBp：5-6-carboxy-fluorescein (FAM)- AGAC GGGTGAGTA ACGCG-Black Hole Quencher (BHQ) -1-3对样品进行检测。所用试剂为购自TaKaRa公司的Premix Ex Taq（Probe qPCR）（宝日医生物技术有限公司,大连）,所用引物和探针均合成于上海生工生物工程股份有限公司。qPCR体系（25 µL）：12 µL Premix Ex Taq（Probe qPCR）,0.5 µL HLBas/HLBr,1 µL HLBp,1 µL DNA（50 ng·µL^-1）,10 µL ddH₂O。具体程序：95℃/30 s;95℃/5 s - 60℃/30 s,40个循环。程序运行结束后,读取Ct值,以备后续分析。利用标准品制作的Ct值与菌含量的关系式为：y=-0.286x+11.924,其中x为Ct 值,y为拷贝数,每克中含有的病原菌个数为10^y。

普通PCR：根据CLas的16S rDNA设计引物OI1（5′-GCGCGTATGCAATACGAGCGGCA-3′）,OI2c （3′-GCCTCGCGACTTCGCAACCCAT-5′）扩增目的DNA样品^[24]。PCR体系：10 µL Premix Ex Taq,0.5 µL OI1/0.5 µL OI2c,1 µL gDNA,8 µL ddH₂O;具体程序：95℃/45 s;95℃/5 s - 52℃/45 s,32个循环;72℃/10 min;16℃ forever。程序结束后进行电泳检测,DNA Marker为购自北京全式金生物技术有限公司的Trans2K DNA Marker,通过条带的大小确认样品中是否存在CLas。

1.2.3 柑橘病毒的检测 采用普通PCR方法对柑橘样品中的柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）、柑橘裂皮病毒（Citrus exocortis viroid,CEVd）、柑橘褪绿矮缩病毒（Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDaV）、柑橘碎叶病毒（Citrus tatter leaf virus,CTLV）和柑橘黄脉病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）进行检测。所用引物主要选用已报道的检测引物,模板为已反转的cDNA。PCR体系：10 µL Premix Ex Taq,0.5 µL primer F/R,1—2 µL cDNA,ddH₂O补足20 µL;具体程序：95℃/45 s;95℃/5 s - 54℃/45 s,32个循环;72℃/10 min;16℃ forever。程序结束进行电泳检测,通过扩增片段的大小确认材料中是否含有被检的柑橘病毒。

1.2.4 CLas菌株原噬菌体超变异基因遗传多样性的检测 主要基于2种原噬菌体类型（SC1和SC2）对应的超变异基因区域设计2对引物（Lap-TJ-F/Lap- TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2）,通过PCR方法,对采自梅州的14个代表菌株进行CLas原噬菌体超变异基因遗传多样性的研究^[14]。PCR扩增体系：10 µL Premix Ex Taq,0.5 µL primer F/R,1—2 µL cDNA,ddH₂O补足20 µL;具体程序：95℃/45 s;95℃/5 s - 55℃/2 min,32个循环;72℃/10 min;16℃ forever。程序结束进行电泳检测,并对检测到的条带进行测序和比对分析。

1.2.5 CLas菌株原噬菌体超变异基因遗传多样性的序列分析 利用DNSTAR Lasergene EditSeq读取所有的测序序列,并分别在NCBI进行BLAST,选取亲缘关系较近的序列;然后利用MEGA7.0.18对所有序列进行序列比对和系统进化分析。进化分析Joining method做Bootstrap验证（重复1 000次）构建系统发育进化树^[25]。

2 结果

2.1 梅州市CLas的检测

2017—2019年在梅州市进行柑橘病害的调研和取样共5次。采集的柑橘品种包括脐橙、沙田柚和蜜柚;采集地区包括平原县、梅县区、大埔县和兴宁市,共计4个市（县）11个村镇137个样品。通过qPCR方法对这些地区的柑橘黄龙病发生情况进行检测,结果显示除2018年9月份采集自大浦顺兴公司蜜柚基地的10个样品没有检测到CLas外,其他地区均能够检测到CLas。其中平远县仁居镇六吉村（采样时间：2019年,检出率：30.0%）、大埔县大东镇东光村（2019年,60.0%）、平远县仁居镇李氏家庭农场（2018年,83.3%）、梅县区雁洋镇南福村（2018年,16.7%）、大埔县湖寮镇双髻山（2018年,80.0%）、大埔县百侯镇新乐村（2018年,60.0%）、兴宁市白马镇沙田柚（2017年,80.0%）的CLas虽然在检出率上存在很大差异,但都仍处于发病初期,含菌量为42—1 700 copies/g。而采集自其他地区和果园的样品中,如平远县仁居镇飞龙村、梅县区石扇镇西南村、梅县区城东镇玉水村、梅县区人民广场森林公园和平远县仁居镇李氏家庭农场脐橙中也仅各有1个样品的Ct值在21—22,说明这些果园整体也处于发病的初期;但个别树体的柑橘黄龙病已经发展到了很严重的阶段,对树体的正常发育和产量已经形成了严重的影响,为了整个果园的安全生产,需要进行彻底的挖树和消毒处理。2017年采集自兴宁市白马镇的蜜柚、平远县大拓镇的蜜柚和沙田柚样品,CLas的检出率都达到了100%,且多个树体的含菌量达到了1×10⁶ copies/g以上,说明在这些地区被检果园中单个树体柑橘黄龙病已经到了发病后期。另外,在梅州市,CLas在脐橙、蜜柚和沙田柚的检出率几乎相同,说明这3个品种对柑橘黄龙病的抗（耐）性无明显差异（表2）。

Table 2
表2
表2梅州市柑橘主产区黄龙病菌的检测
Table 2Detection of CLas in main citrus producing areas in Meizhou City

采样时间Sampling time	采集地 Location (Village/Town/County)	品种 Variety	样品数（个）Number	检出率 Detection rate (%)	含菌量 HLB content (×103 copies/g)	Ct范围 Ct range
2019-06	平远县仁居镇飞龙村Feilong/Renju/Pingyuan	脐橙 Navel orange	11	63.6	0.069-735	21.18-35.27
	平远县仁居镇六吉村 Liuji/Renju/Pingyuan		10	30.0	0.078-0.123	34.39-35.08
	梅县区石扇镇西南村 Xi’nan/Shishan/Meixian	蜜柚 Honey pummelo	10	70.0	0.14-393	22.13-34.19
	梅县区人民广场森林公园 People’s Square Forest Park in Meixian District		12	66.7	0.073-277	22.66-35.17
	梅县区石扇镇西南村 Xi’nan/Shishan/Meixian	沙田柚 Shatian pummelo	10	60.0	0.073-576	21.55-35.18
	梅县区城东镇玉水村 Yushui/Chengdong/Meixian		10	80.0	0.072-856	20.95-35.20
	大浦县大东镇东光村 Dongguang/Dadong/Dapu		15	60.0	0.069-1.02	31.18-35.27
2018-01	平远县仁居镇李氏家庭农场 Family Farm of LI/Renju Town/Pingyuan County	脐橙× Navel orange	11	54.5	0.072-49.7	25.27-35.19
		脐橙* Navel orange	6	83.3	0.071-0.76	31.62-35.22
	梅县区雁洋镇南福村 Nanfu/ Yanyang/Meixian	蜜柚 Honey pummelo	6	16.7	0.059	35.50
	大埔县湖寮镇双髻山 Shuangji/Huliao/Dapu		5	80.0	0.042-0.31	32.98-36.02
	大埔县百侯镇新乐村 Xinle/Baihou/Dapu		5	60.0	0.135-1.7	30.43-34.24
2018-09	大埔顺兴公司蜜柚基地 Honey pummelo base in Shunxing Company in Dapu County		5	0	0	0
		沙田柚Shatian pummelo	5	0	0	0
2017-07	兴宁市白马镇 Baima/Xingning	蜜柚Honey pummelo	6	100.0	0.199-1036	20.66-32.26
		沙田柚Shatianpummelo	5	80.0	0.052-0.683	31.78-35.68
2017-08	平远县大拓镇 Datuo/Pingyuan	蜜柚Honey pummelo	3	100.0	0.232-1106	20.56-33.42
		沙田柚Shatian pummelo	2	100.0	0.18-1742	19.87-33.81
2017-2019	梅州市 Meizhou City	脐橙Navel orange	38	55.3	0.069-735	21.18-35.27
		蜜柚Honey pummelo	52	61.5	0.042-1106	20.56-36.02
		沙田柚Shatian pummelo	47	61.7	0.052-1742	19.87-35.68

^{×：田间已结果的大树A big tree that has borne fruit in the field;*：复种一年内的无毒柑橘树苗Non-toxic citrus seedling within one year after replanting。表3同 The same as Table 3}

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Table 3
表3
表3梅州市柑橘主产区柑橘病毒检测
Table 3Detection of citrus viruses in main citrus producing areas in Meizhou City

采集地 Location (Village/Town/County)	品种 Variety	样品数（个） Number	检出率Detection rate (%)
			CTV	CEVd	CCDaV	CTLV	CYVCV
平远县仁居镇飞龙村 Feilong/Renju/Pingyuan	脐橙 Navel orange	11	100.0	0	0	0	0
平远县仁居镇六吉村 Liuji/Renju/Pingyuan		10	50.0	0	0	0	0
梅县区石扇镇西南村 Xi’nan/Shishan/Meixian	蜜柚 Honey pummelo	10	50.0	0	0	0	0
梅县区人民广场森林公园 People’s Square Forest Park in Meixian County		10	0	0	0	0	0
梅县区石扇镇西南村 Xi’nan/Shishan/Meixian	沙田柚 Shatian pummelo	12	0	0	0	0	0
梅县区城东镇玉水村 Yushui/Chengdong/Meixian		10	0	0	0	0	0
大埔县大东镇东光村 Dongguang/Dadong/Dapu		15	0	0	0	0	0
平远县仁居镇李氏家庭农场 Family Farm of LI, Renju Town, Pingyuan County	脐橙× Navel orange	11	81.8	0	0	9.1	72.7
	脐橙* Navel orange	6	83.3	0	0	33.3	0
梅县区雁洋镇南福村 Nanfu/Yanyang/Meixian	蜜柚 Honey pummelo	6	0	0	0	50	0
大埔县湖寮镇双髻山 Shuangji/Huliao/Dapu		5	0	0	0	100	0
大埔县百侯镇新乐村 Xinle/Baihou/Dapu		5	0	0	0	60	0
大浦顺兴公司蜜柚基地 Honey pummelo base in Shunxing Company in Dapu County		5	0	0	0	20	40
	沙田柚Shatian pummelo	5	0	0	0	0	0
平远县大拓镇 Datuo/Pingyuan	蜜柚Honey pummelo	3	100.0	0	0	0	100.0
	沙田柚Shatian pummelo	2	100.0	0	0	50.0	100.0
兴宁市白马镇 Baima/Xingning	蜜柚Honey pummelo	6	0	0	0	20.0	0
	沙田柚Shatian pummelo	5	10.0	0	0	0	0
梅州市 Meizhou City	脐橙Navel orange	38	78.9	0	0	7.9	21.1
	蜜柚Honey pummelo	52	15.4	0	0	25.0	9.6
	沙田柚Shatian pummelo	47	6.4	0	0	2.1	4.3

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2.2 梅州市柑橘病毒的检测

由于在田间症状上柑橘黄龙病极易于柑橘病毒病混淆,本研究特别对我国已报道的5种常见柑橘病毒病在梅州市柑橘主产区的发生情况进行了调研和检测,主要包括柑橘衰退病、柑橘裂皮病、柑橘褪绿矮缩病、柑橘碎叶病和柑橘黄脉病^[26,27,28]。结果显示,在采集自梅州市的柑橘样品中没有发现CEVd和CCDaV的存在,同时CTV的检出率最高（脐橙78.9%,蜜柚15.4%,沙田柚6.4%）,其次是CTLV（脐橙7.9%,蜜柚25.0%,沙田柚2.1%）和CYVCV（脐橙21.1%,蜜柚9.6%,沙田柚4.3%）,被检病毒在沙田柚上的检出率最低。

在被抽检的地区中,采集自梅县区人民广场森林公园、梅县区石扇镇西南村、梅县区城东镇玉水村、大埔县大东镇东光村、大浦顺兴公司蜜柚基地沙田柚的样品中没有发现5种被检病毒的存在;采集自平远县大拓镇的沙田柚样品和平远县仁居镇李氏家庭农场的脐橙样品中,均能够检到CTV、CTLV和CYVCV。

2.3 梅州市CLas菌株原噬菌体超变异基因遗传多样性

对随机抽取来自梅州市的14个样品和来自广州市白云区的3个样品,通过qPCR和普通PCR分别进行CLas检测,结果显示qPCR的结果较普通PCR的结果更准确,当被检测样品的Ct 值>31.18时,普通PCR已经不能检测出样品中含有CLas（表4、图1）;同时发现来自平远县仁居镇的脐橙R4不含CLas,为健康的柑橘材料。采用谭锦等^[16]报道的研究中国CLas 2个原噬菌体超变异基因遗传多样性的引物（Lap-TJ- F/Lap-TJ-R1、Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2）进行PCR扩增,并对其中随机抽取的5个菌株（Z3、R1、SM1、S1、G1）进行测序,具体结果见表4。Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1扩增梅州地区的CLas菌株得到的条带较多,且都集中在2 kb以下;根据文献[17],1 677 bp左右的条带为其主要条带,命名为SC1-1;1 149—1 812 bp的条带命名为SC1-2。结果显示仅SM1和SM2具有SC1-1,C2具有SC1-2。

Table 4
表4
表4部分来自梅州的CLas菌株信息及扩增类型
Table 4Sample information and amplicon types of partial CLas strains from Meizhou City

采集地 Location	品种 Variety	样品 Sample	Ct-value	CLas		扩增类型 Amplified type
				qPCR	Ordinary PCR
广州市白云区钟落潭镇 Zhongluotan Town, Baiyun District, Guangzhou City	砂糖橘Sugar orange	Z1	22.08	A+	A+	SC2-1 (2)
	默克特Murcott	Z2	25.89	A+	A+	SC2-1(2)
	蜜柚Honey pummelo	Z3	22.08	A+	A+	SC2-1
平远县仁居镇 Renju Town, Pingyuan County	脐橙Navel orange	R1	21.18	A+	A+	SC2-1
		R2	35.20	A+	A-	SC2-1
		R3	34.80	A+	A-	SC2-1
		R4	N	A-	A-	-
梅县区石扇镇 Shishan Town, Meixian District	蜜柚Honey pummelo	SM1	22.13	A+	A+	SC1-1
		SM2	32.69	A+	A-	SC1-1
	沙田柚Shatian pummelo	S1	21.55	A+	A+	SC2-1
		S2	33.96	A+	A-	SC2-1
梅县区城东镇 Chengdong Town, Meixian District	沙田柚Shatian pummelo	C1	31.68	A+	A-	SC2-1
		C2	34.06	A+	A-	SC1-2
梅县区人民广场森林公园 People’s Square Forest Park in Meixian District	蜜柚Honey pummelo	G1	22.66	A+	A+	SC2-1
		G2	34.60	A+	A-	SC2-1
大埔县大东镇 Dadong Town, Dapu County	蜜柚Honey pummelo	D1	31.18	A+	A-	SC2-1
		D2	34.92	A+	A-	-

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图1

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图1选取的典型梅州CLas菌株3个基因区域的电泳图

P: OI1/OI2c; P1: Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1; P2: Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2; M: Trans2K DNA Marker; Z1-D2: 不同菌株Different strains
Fig. 1Electrophoresis profile of representative Meizhou citrus CLas strains from PCR amplification with three primer sets targeting three gene regions



Lap-TJ-F/Lap-TJ -R2扩增获得的1 456和846 bp 2种大小不同的基因序列,分别对应的电泳条带被命名为SC2-1和SC2-2。结果表明,D2没有扩增出有效条带;除SM1、SM2和C2外,被抽查的梅州地区的CLas菌株均具有SC2-1;来自广州市白云区的蜜柚品种也具有SC2-1;在被抽检的梅州地区样品中未检测到含有SC2-2（图1）。没有发现CLas菌株同时具有SC1和SC2。

2.4 系统进化分析

来自Z3、R1、S1和G1的SC2-1,SM1的SC1-1经过测序以及在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上进行Blast后,通过MEGA7软件进行多序列比对（图2）。结果显示这些序列的结构与谭锦等^[16]报道的大致相同,但在不同菌株的同一片段上存在个别碱基的不同或缺失;进化树结果显示,不同菌株间同源性差异较大,且与已报道的来自福建、广西、江西、云南等地菌株中的相关原噬菌体序列SC1和SC2的同源性较差,独立成为一簇。由图2可以看出,这些菌株间的同源性不仅与品种无关,与小范围的地理位置也无关。

图2

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图2邻接法构建原噬菌体基因序列的系统发育树

Fig. 2Phylogenetic tree of prophage gene sequences constructed by neighbor-joining method

3 讨论

梅州市是广东省重要的柑橘生产基地,本研究通过qPCR方法更精确地反映了梅州市不同柑橘产区的黄龙病发病（潜伏）情况,结果表明柑橘不同品种间黄龙病发病率无明显差异。以16S rDNA为模板设计的引物,通过qPCR方法进行CLas检测的结果,同时结合田间柑橘树的生长状况和产量,笔者研究室把Ct值≥37划分为健康苗木,Ct值介于30—37为柑橘黄龙病的发病初期（轻病期）,Ct值介于25—30为柑橘黄龙病发病的中病期,Ct值<25为柑橘黄龙病发病的后期（待发表）。从2017—2019年对梅州市不同地区、不同果园的检测情况来看,除大浦顺兴公司的柑橘种植基地没有检出CLas外,其他果园均不同程度地检出了CLas,平远县大拓镇、兴宁市白马镇和梅县区城东镇玉水村的橘园已经发展到了柑橘黄龙病的后期,需要进行挖树,彻底消毒和复种无毒种苗或改种其他作物;其他果园除个别果树比较严重,需要做特殊的处理（挖除）外,加强果园的防虫和栽培管理,可维持树体的健康和产量,具体措施参见崔一平等^[29]。近年来对柑橘木虱（Diaphorina citri）的绿色防控研究取得了较大进展,如以天敌（亮腹釉小蜂、阿里食虱跳小蜂、瓢虫、草蛉、蜘蛛和蚂蚁）、昆虫病原真菌（球孢白僵菌、绿僵菌和玫烟色棒束孢等）和来自印楝的印楝素等植物源农药为主的生物防治技术和以灯光、色板诱捕、反光膜驱避、防虫网阻隔为主的物理防治技术等都取得了很好的防治效果^[30]。但在实际生产中柑橘木虱绿色防控技术的集成应用却很少,主要是上述措施在都存在一定的技术瓶颈有待突破。

值得注意的是,平远县仁居镇李氏脐橙家庭农场复种的脐橙小苗,在种植不到一年的时候进行抽检发现,CLas检出率为83.3%,含菌量为71—760 copies/g,CTLV检出率为33.3%。种植者在购买无毒种苗时应从正规厂家购买,确保种植的种苗确实是健康的。而像大浦顺兴公司蜜柚基地这种没有检出CLas,但有CTLV和CYVCV的果园,则应继续加强栽培管理,做好防虫防病工作。梅州市总的柑橘病毒检出率并不高,仅脐橙的CTV检出率较高,为78.9%,说明梅州市在过去种苗质量的控制上把关较严。同时发现沙田柚比脐橙和蜜柚对衰退病、碎叶病和黄脉病有更好的耐病性,检出率均低于10%。

通过对CLas两个噬菌体超变异基因多样性的研究,梅州柑橘主产区的CLas虽然大部分都含有SC2-1,但它们在核酸序列的多个碱基位点上都存在变异或缺失。梅县区石扇镇的蜜柚SM1、SM2和梅县区城东镇的沙田柚C2则分别含有SC1-1和SC1-2。广东省梅州市柑橘主产区的CLas菌株自成一簇且相对单一和保守,与已报道的其他地区的CLas菌株同源性较差。

谭锦等^[16]研究表明,来自广东四会的砂糖橘含有SC2-1和SC1-2。为了进一步研究地域是否影响CLas菌株的进化,本研究对来自广州市白云区钟落潭镇的砂糖橘、默克特与蜜柚的CLas菌株进行了分析,发现来自砂糖橘和默科特的CLas菌株都含有SC2-1和SC2-2,而来自蜜柚的菌株仅含有SC2-1。通过对来自梅州主产区和广州市白云区的CLas菌株进行分析,发现在这些地区CLas的进化与柑橘品种、小范围内的地域关系都不大;同时发现CLas菌株的进化速度很快,在同一地域的同一果园内存在不同的CLas株系,CLas具体的进化机制仍需要进一步的研究。

4 结论

广东省梅州市主要柑橘产区的柑橘黄龙病目前属于发病初、中期,为可防可控阶段,应采取有效措施对柑橘黄龙病和柑橘木虱进行绿色防控。同时梅州市CLas菌株的原噬菌体在不同品种上具有其独特性,其进化与柑橘品种、小范围内的地域关系都不大。该地区柑橘病毒的检出率并不高,但病毒病的存在仍然能够对树体的生长发育造成严重的影响,因此建议在种植过程中加强种苗监管,从源头上减少柑橘病毒对树苗的侵染。

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